Tytuł oryginału: HARPER’S ILLUSTRATED BIOCHEMISTRY, Thirty-second Edition

Original edition copyright © 2023 by McGraw Hill, LLC. All rights reserved. Except as permitted under the United States Copyright Act of 1976, no part of this publication may be reproduced or distributed in any form or by any means, or stored in a data base or retrieval system, without the prior written permission of the publisher.

Polish edition © Copyright by Wydawnictwo Naukowe PWN S.A., Warszawa 2026

Wszystkie prawa zastrzeżone.

Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci całości bądź części książki bez pisemnej zgody wydawcy są zabronione.

Autorzy, Tłumacze i Wydawnictwo dołożyli wszelkich starań, aby wybór i dawkowanie leków w tym opracowaniu były zgodne z aktualnymi wskazaniami i praktyką kliniczną. Mimo to, ze względu na stan wiedzy, zmiany regulacji prawnych i nieprzerwany napływ nowych wyników badań dotyczących podstawowych i niepożądanych działań leków, Czytelnik musi brać pod uwagę informacje zawarte w ulotce dołączonej do każdego opakowania, aby nie przeoczyć ewentualnych zmian we wskazaniach i dawkowaniu. Dotyczy to także specjalnych ostrzeżeń i środków ostrożności. Należy o tym pamiętać, zwłaszcza w przypadku nowych lub rzadko stosowanych substancji.

Wydawca: Anna Plewa

Redaktor prowadzący: Barbara Nowak-Pacholczak

Redaktor merytoryczny: Magdalena Mendys

Producent: Marta Kubica

Projekt okładki i stron tytułowych: Lidia Michalak-Mirońska

Ilustracja na okładce: Videst/123RF

(ilustracja wygenerowana przy użyciu AI)

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2026 r. (Wydanie VIII)

Warszawa 2026

PZWL Wydawnictwo Lekarskie

ISBN 978-83-01-24949-6

Wydawnictwo Naukowe PWN S.A.

ul. G. Daimlera 2

02-460 Warszawa

pwn.pl

Księgarnia wysyłkowa:

tel. 42 680 44 88; infolinia: 801 33 33 88

e-mail: wysylkowa@pzwl.pl

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN S.A.:
Michał Latusek

Informacje w sprawie współpracy reklamowej: BR.PZWL@pwn.pl

Fragment

Współautorzy

Wykaz tłumaczy

Przedmowa do wydania polskiego

Przedmowa

I. Struktury oraz funkcje białek i enzymów

1. Biochemia a medycyna - Victor W. Rodwell, PhD

2. Woda i pH - Peter J. Kennelly, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

3. Aminokwasy i peptydy - Peter J. Kennelly, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

4. Białka: określanie struktury pierwszorzędowej - Peter J. Kennely, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

5. Białka: struktury wyższego rzędu - Peter J. Kennelly, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

II. Enzymy: kinetyka, mechanizmy, regulacja i rola metali przejściowych

6. Białka: mioglobina i hemoglobina - Peter J. Kennelly, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

7. Enzymy: mechanizm działania - Peter J. Kennelly, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

8. Enzymy: kinetyka - Victor W. Rodwell, PhD

9. Enzymy: regulacja aktywności - Peter J. Kennelly, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

10. Biochemiczne znaczenie metali przejściowych - Peter J. Kennelly, PhD

III. Bioenergetyka

11. Bioenergetyka: rola ATP - Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc

12. Utlenianie biologiczne - Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc

13. Łańcuch oddechowy i fosforylacja oksydacyjna - Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc

IV. Metabolizm węglowodanów

14. Zarys szlaków metabolicznych i pozyskiwanie substratów energetycznych - Owen P. McGuinness, PhD

15. Węglowodany o znaczeniu fizjologicznym - Owen P. McGuinness, PhD

16. Cykl kwasu cytrynowego: główny szlak metabolizmu węglowodanów, lipidów i aminokwasów - Owen P. McGuinness, PhD

17. Glikoliza i utlenianie pirogronianu - Owen P. McGuinness, PhD

18. Metabolizm glikogenu - Owen P. McGuinness, PhD

19. Glukoneogeneza i kontrola stężenia glukozy we krwi - Owen P. McGuinness, PhD

20. Szlak pentozofosforanowy oraz inne szlaki przemiany heksoz - Owen P. McGuinness, PhD

V. Metabolizm lipidów

21. Lipidy o znaczeniu fizjologicznym - Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc

22. Utlenianie kwasów tłuszczowych: ketogeneza - Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc

23. Biosynteza kwasów tłuszczowych i eikozanoidów - Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc

24. Metabolizm acylogliceroli i sfingolipidów - Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc

25. Transport i magazynowanie lipidów - Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc

26. Synteza, transport i wydalanie cholesterolu - Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Peter A. Mayes, PhD, DSc

VI. Metabolizm białek i aminokwasów

27. Biosynteza aminokwasów nie niezbędnych - Victor W. Rodwell, PhD

28. Katabolizm białek i azotu aminokwasów - Victor W. Rodwell, PhD

29. Katabolizm szkieletów węglowych aminokwasów - Victor W. Rodwell, PhD

30. Przemiana aminokwasów w wyspecjalizowane produkty - Victor W. Rodwell, PhD

31. Porfiryny i barwniki żółciowe - Victor W. Rodwell PhD

VII. Budowa, funkcje i replikacja makrocząsteczek – nośników informacji

32. Nukleotydy - Victor W. Rodwell, PhD

33. Metabolizm nukleotydów purynowych i pirymidynowych - Victor W. Rodwell, PhD

34. Struktura i funkcja kwasów nukleinowych - P. Anthony Weil, PhD

35. Organizacja, replikacja i naprawa DNA - P. Anthony Weil, PhD

36. Synteza, przekształcanie i metabolizm RNA - P. Anthony Weil, PhD

37. Synteza białek i kod genetyczny - P. Anthony Weil, PhD

38. Regulacja ekspresji genu - P. Anthony Weil, PhD

39. Genetyka molekularna, rekombinowane DNA i technologia genomowa - P. Anthony Weil, PhD

Pytania sprawdzające

VIII. Biochemia komunikacji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej

40. Błony: struktura i funkcja - P. Anthony Weil, PhD

41. Różnorodność układu wewnątrzwydzielniczego - P. Anthony Weil, PhD

42. Działanie hormonów i transdukcja sygnałów - P. Anthony Weil, PhD

IX. Wybrane zagadnienia (A)

43. Żywienie, trawienie i wchłanianie - David A. Bender, PhD

44. Mikroskładniki: witaminy i składniki mineralne - David A. Bender, PhD

45. Wolne rodniki i składniki odżywcze o działaniu antyoksydacyjnym - David A. Bender, PhD

46. Glikoproteiny - David A. Bender, PhD

47. Metabolizm ksenobiotyków - David A. Bender, PhD; Robert K. Murray, MD, PhD

48. Biochemia kliniczna - David A. Bender, PhD

X. Wybrane zagadnienia (B)

49. Wewnątrzkomórkowy transport i sortowanie białek - Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Robert K. Murray, MD, PhD

50. Macierz pozakomórkowa - Kathleen M. Botham, PhD, DSc; Robert K. Murray, MD, PhD

51. Mięsień i szkielet komórkowy (cytoszkielet) - January D. Haile, PhD; Peter J. Kennelly, PhD

52. Białka osocza i immunoglobuliny - Peter J. Kennelly, PhD

53. Krwinki czerwone - Peter J. Kennelly, PhD

54. Krwinki białe - Peter J. Kennelly, PhD

XI. Wybrane zagadnienia (C)

55. Proces hemostazy i powstawania zakrzepu - Peter L. Gross, MD, MSc, FRCP(C); P. Anthony Weil, PhD; Margaret L. Rand, PhD

56. Nowotwory: podstawowe informacje - Molly Jacob, MD, PhD; MNASc, FRCPath, Joe Varghese, MD, PhD; P. Anthony Weil, PhD

57. Biochemia starzenia się - Peter J. Kennelly, PhD

58. Opisy przypadków biochemicznych - David A. Bender, PhD

Odpowiedzi na pytania sprawdzające

Przypisy

Pozostałe rozdziały dostępne w pełnej wersji e-booka.

Współautorzy

David A. Bender, PhD

Professor (Emeritus) of Nutritional Biochemistry

University College London

London, United Kingdom

Peter L. Gross, MD, MSc, FRCP(C)

Associate Professor

Department of Medicine

McMaster University

Hamilton, Ontario, Canada

January D. Haile, PhD

Associate Professor of Biochemistry and Molecular Biology

Centre College

Danville, Kentucky

Molly Jacob, MD, PhD, MNASc, FRCPath

Professor of Biochemistry

Christian Medical College

Vellore, Tamil Nadu, India

Peter A. Mayes, PhD, DSc

Emeritus Professor of Veterinary Biochemistry

Royal Veterinary College

University of London

London, United Kingdom

Robert K. Murray, MD, PhD

Emeritus Professor of Biochemistry

University of Toronto

Toronto, Ontario, Canada

Margaret L. Rand, PhD

Senior Associate Scientist

Division of Hematology/Oncology

Hospital for Sick Children, Toronto

Professor, Department of Biochemistry

University of Toronto, Toronto, Canada

Joe Varghese, MD, PhD

Professor and Head of Biochemistry

Christian Medical College

Vellore, Tamil Nadu, India

Wykaz tłumaczy

Prof. dr hab. Zenon Aleksandrowicz

(rozdz. 11, 13, 15–17)

Dr Alicja Braczko

(rozdz. 55)

Dr Aleksandra Czumaj

(rozdz. 35–39)

Dr hab. Agnieszka Dettlaff-Pokora

(rozdz. 18, 57)

Dr Areta Hebanowska

(rozdz. 40–44)

Dr hab. Joanna Karbowska

(rozdz. 10, 21, 22, 47)

Prof. dr hab. Zofia Kiliańska

(rozdz. 2, 3)

Dr Narcyz Knap

(rozdz. 45)

Dr hab. Zdzisław Kochan

(rozdz. 10, 21, 22, 43, 44, 47)

Prof. dr hab. Franciszek Kokot

(rozdz. 41, 42)

Prof. dr hab. Wanda M. Krajewska

(rozdz. 6, 9, 31)

Dr Katarzyna Krawczyk

(rozdz. 35–39, 52–55)

Dr hab. Anna Krześlak

(rozdz. 48, 49, 56)

Prof. dr hab. Eugeniusz J. Kucharz

(rozdz. 50)

Prof. dr hab. Barbara Kutryb-Zając

(rozdz. 7–9)

Dr hab. Andrzej Lewandowicz

(rozdz. 1, 4, 5, 29, 30)

Prof. dr hab. Anna Lipińska

(rozdz. 7, 8, 27, 28)

Dr Paulina Mierzejewska

(rozdz. 4, 12, 27–30, 34, 45-46, 52–54, 58)

Dr hab. Beata Schlichtholz

(rozdz. 16, 17, 56)

Prof. dr hab. Ewa M. Słomińska

(rozdz. 3, 5, 15, 32, 48)

Prof. dr hab. Ryszard T. Smoleński

(rozdz. 1–3, 5-6, 11–13, 32–33, 48)

Dr Aleksander Sochanik

(rozdz. 32–34)

Dr hab. Ewa Stelmańska

(rozdz. 15, 25, 26, 31)

Dr Sylwia Szrok-Jurga

(rozdz. 19, 25, 49)

Dr hab. Marta Tomczyk

(rozdz. 14, 51)

Dr Jacek Turyn

(rozdz. 20, 23, 24, 50)

Dr Joanna Wawszczyk

(rozdz. 40)

Prof. dr hab. Ludmiła Węglarz

(rozdz. 40)

Dr inż. Anita Wojtczyk-Miąskowska

(rozdz. 17)

Prof. dr hab. Michał Woźniak

(rozdz. 45)

Prof. dr hab. Mariusz M. Żydowo

(rozdz. 18–20, 23–26)

Przedmowa do wydania polskiego

Przekazujemy Państwu tłumaczenie na język polski 32. wydania Biochemii Harpera. W imieniu całego zespołu redakcyjnego chciałbym podziękować za zainteresowanie tym podręcznikiem i prosić o jego życzliwe przyjęcie. Biochemia Harpera jest przeznaczona przede wszystkim dla środowiska medycznego, a jej głównym celem jest pomoc w zrozumieniu biochemicznych mechanizmów funkcjonowania organizmu człowieka, zmian zachodzących w stanach chorobowych oraz roli biochemii w diagnostyce i terapii.

W Biochemii Harpera omówiono najważniejsze procesy biochemiczne zachodzące w organizmie człowieka, a także – co jest unikatową cechą niniejszego podręcznika – przedstawiono metodykę badań, zarówno pionierskich, jak i tych najnowszych, które podtrzymują dynamiczny rozwój tej dyscypliny.

W obecnym wydaniu książki zaktualizowano wiele informacji zgodnie z wynikami najnowszych badań naukowych, uwzględniając nowe trendy związane głównie z rozwojem biologii systemowej i medycyny spersonalizowanej w takich obszarach, jak: genomika, transkryptomika, proteomika czy metabolomika. Podejście takie pozwala nie tylko na badanie wybranych procesów, lecz także na analizę ich interakcji z funkcją organizmu jako całości, co ma szczególne znaczenie w medycynie. Rozbudowane w tym wydaniu opisy przypadków i odniesienia do chorób występujących u człowieka podkreślają znaczenie biochemii jako jednego z fundamentów medycyny i nawiązują do współczesnych trendów w kształceniu zorientowanym na rozwiązywanie konkretnych problemów. Wiele wprowadzonych modyfikacji i uzupełnień miało na celu ułatwienie nauki i zrozumienia biochemii.

Biochemia jest obszerną i jedną z najszybciej zmieniających się dyscyplin naukowych, dlatego przekazanie wszystkich najnowszych informacji w niniejszej książce nie byłoby możliwe. Mamy nadzieję, że lektura podręcznika dostarczy wielu informacji na temat podstaw biochemii i zachęci Czytelnika do dalszego pogłębiania tego obszaru wiedzy.

Wydanie niniejszego opracowania nie byłoby możliwe bez zaangażowania zespołu redakcyjnego: wydawcy, redaktorów PZWL Wydawnictwa Lekarskiego i tłumaczy. Chciałbym złożyć serdeczne podziękowania całemu zespołowi za ogromny wkład pracy, wyrozumiałość i życzliwość.

Redaktor naukowy tłumaczenia

Ryszard T. Smoleński

Przedmowa

Autorzy i wydawcy z przyjemnością prezentują 32. wydanie Biochemii Harpera ilustrowanej. Pierwsze wydanie, zatytułowane Biochemia Harpera, autorstwa dr. Harolda Harpera ze Szkoły Medycznej Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco, ukazało się w 1939 roku. Podręcznik pod obecnym tytułem Biochemia Harpera ilustrowana kontynuuje, zgodnie z pierwotnym zamierzeniem, zwięzły przegląd aspektów tej dziedziny wiedzy najbardziej istotnych w medycynie. Do rozwoju tego obchodzącego obecnie 83. rocznicę podręcznika przyczyniła się praca wielu autorów kolejnych wydań.

Pandemia COVID-19 ujawniła zarówno potencjał, jak i ograniczenia medycyny molekularnej i epidemiologii. Szybki rozwój wysoce skutecznych szczepionek stał się możliwy dzięki adaptacji nowatorskich metod związanych z RNA, w których odpowiedź immunologiczna pacjenta nie jest aktywowana wstrzyknięciem antygenu, lecz poprzez endogenną ekspresję antygenów genetycznie kodowanych w szczepionce. Wykorzystanie własnych komórek pacjenta jako bioreaktora do generowania antygenów, zamiast konieczności ich zewnętrznego tworzenia przed podaniem, umożliwiło zarówno przyspieszenie opracowywania szczepionek, jak i późniejszą ich produkcję na dużą skalę.

Ilustracja na okładce 32. wydania przedstawia przeciwciało neutralizujące (na niebiesko) związane z białkiem kolca (na czerwono) na powierzchni powodującego COVID-19 koronawirusa SARS-CoV-2. Epitop, z którym wiąże się przeciwciało, pokrywa się z epitopem, z którym wirus wiąże się z receptorem ACE-2 – białkiem błonowym, za pomocą którego patogen rozpoznaje komórki ludzkie, wiąże się z nimi i następnie je atakuje. Przeciwciała stosowane w terapii zapewniają ochronę poprzez fizyczne blokowanie łączenia białka kolca z receptorem ACE-2.

Zmiany w 32. wydaniu

Jak zawsze, Biochemia Harpera ilustrowana podkreśla ścisły związek biochemii z rozumieniem chorób, ich patologią i praktyką medyczną. Wraz z przejściem na emeryturę wieloletniego współpracownika Davida A. Bendera do grona współautorów dołączył prof. Owen P. McGuinness z Uniwersytetu Vanderbilt. Oprócz świeżych perspektyw i nowatorskich spostrzeżeń przedstawionych przez prof. McGuinnessa treść większości rozdziałów została zaktualizowana i dostarcza czytelnikowi najbardziej istotnych informacji. Na przykład w rozdziale 6 zreorganizowano i rozszerzono opis wpływu efektu Bohra na transport i uwalnianie CO₂ z płuc, a rozdział 9 został zaktualizowany i zreorganizowany, aby uwzględnić szerszy opis aktywacji zymogenów w regulacji enzymów.

Organizacja książki

Wszystkie 58 rozdziałów 32. wydania kładzie duży nacisk na medyczne znaczenie biochemii. Tematy uporządkowano pod 11 głównymi częściami. Aby ułatwić naukę i utrwalenie zawartych informacji, po każdej części znajdują się pytania. Po rozdziale 58 zamieszczono odpowiedzi.

Część I zawiera krótką historię biochemii i podkreśla wzajemne powiązania między tą dziedziną nauki a medycyną. Omówiono wodę i znaczenie homeostazy wewnątrzkomórkowego pH, a także różne aspekty struktury białek.

Część II rozpoczyna się rozdziałem poświęconym hemoglobinie. Kolejne cztery rozdziały dotyczą mechanizmu działania, kinetyki, regulacji metabolicznej enzymów oraz roli jonów metali w wielu aspektach metabolizmu.

Część III omawia bioenergetykę i rolę wysokoenergetycznych fosforanów w pozyskiwaniu i przenoszeniu energii, reakcje utleniania i redukcji związane z utlenianiem biologicznym oraz metaboliczne szczegóły przejmowania energii poprzez łańcuch oddechowy i fosforylację oksydacyjną.

Część IV dotyczy metabolizmu węglowodanów w glikolizie, cyklu kwasu cytrynowego, szlaku pentozofosforanowego, metabolizmu glikogenu, glukoneogenezy oraz kontroli stężenia glukozy we krwi.

Część V przedstawia charakterystykę lipidów prostych i złożonych, transport i magazynowanie lipidów, biosyntezę i degradację kwasów tłuszczowych oraz lipidów bardziej złożonych, a także reakcje i regulację metaboliczną biosyntezy i transportu cholesterolu u ludzi.

Część VI prezentuje katabolizm białek, biosyntezę mocznika i katabolizm aminokwasów, podkreślając istotne z medycznego punktu widzenia zaburzenia metaboliczne związane z ich nieefektywnym katabolizmem. Ostatni rozdział tej części poświęcony jest biochemii porfiryn i barwników żółciowych.

Część VII przedstawia strukturę i funkcję nukleotydów oraz kwasów nukleinowych, omawia replikację i naprawę DNA, syntezę i modyfikację RNA, syntezę białek, technologie rekombinacji DNA oraz regulację ekspresji genów.

Część VIII ma za przedmiot aspekty komunikacji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej. Szczegółowe tematy obejmują strukturę i funkcję błon komórkowych, molekularne podstawy działania hormonów oraz transdukcję sygnału.

Części IX, X i XI poruszają wiele zagadnień o istotnym znaczeniu medycznym. Część IX omawia odżywianie, trawienie i wchłanianie, mikroskładniki odżywcze, w tym witaminy, wolne rodniki i przeciwutleniacze, glikoproteiny, metabolizm ksenobiotyków oraz biochemię kliniczną.

Część X dotyczy transportu wewnątrzkomórkowego i sortowania białek, macierzy zewnątrzkomórkowej, mięśni i cytoszkieletu, białek osocza i immunoglobulin oraz biochemii czerwonych i białych krwinek.

Część XI obejmuje hemostazę i jej zaburzenia, takie jak zakrzepica, przegląd biochemii nowotworów, biochemię starzenia się oraz opisy przypadków klinicznych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Michaelowi Weitzowi za jego udział w planowaniu niniejszego wydania oraz Peterowi Boyle’owi za nadzorowanie przygotowań do publikacji. Dziękujemy również Tasneem Kauser i jej współpracownikom z KnowledgeWorks Global Ltd. za ich wysiłek włożony w redakcję, skład i grafikę. Z wdzięcznością przyjmujemy liczne sugestie i poprawki otrzymane od studentów i współpracowników z całego świata.

Peter J. Kennelly

Kathleen M. Botham

Owen P. McGuinness

Victor W. Rodwell

P. Anthony Weil

1

Biochemia a medycyna

Victor W. Rodwell, PhD

CELE

Po zapoznaniu się z treścią tego rozdziału Czytelnik powinien:

• Zrozumieć znaczenie zdolności do fermentacji cukrów przez bezkomórkowy ekstrakt z drożdży, której poznanie umożliwiło odkrycie produktów pośrednich fermentacji, glikolizy oraz innych szlaków metabolicznych.

• Docenić szeroki zakres biochemii i jej kluczową rolę w dziedzinie nauk przyrodniczych oraz fakt, że biochemia i medycyna są dyscyplinami ściśle ze sobą powiązanymi.

• Docenić fakt, że biochemia integruje wiedzę o procesach chemicznych w żywych komórkach ze strategiami dotyczącymi utrzymania zdrowia, pozwala zrozumieć choroby i określić metody potencjalnych terapii oraz zwiększa naszą wiedzę o początkach życia na Ziemi.

• Opisać, jak krytyczne podejście genetyczne pozwoliło wyjaśnić wiele obszarów biochemii i jak projekt badania genomu ludzkiego przekłada się na dalszy postęp w wielu aspektach biologii i medycyny.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Biochemia i medycyna ściśle ze sobą „współpracują”. Badania biochemiczne naświetliły wiele aspektów zdrowia i choroby, otwierając nowe obszary biochemii. W tej książce położono szczególny nacisk na medyczne znaczenie biochemii zarówno w normalnych, jak i odbiegających od normy stanach organizmu. Biochemia wnosi istotny wkład w rozwój wiedzy na temat biologii komórki, fizjologii, immunologii, mikrobiologii, farmakologii, toksykologii i epidemiologii, jak również procesów zapalnych, uszkodzenia komórki i chorób nowotworowych. Z tych bliskich związków biochemii i medycyny jasno wynika, że życie, jakie znamy, zależy od reakcji i procesów biochemicznych.

ODKRYCIE, ŻE EKSTRAKT Z DROŻDŻY POZBAWIONY KOMÓREK MOŻE FERMENTOWAĆ CUKIER

Chociaż zdolność drożdży do „fermentowania” różnych cukrów do alkoholu etylowego jest znana od tysiącleci, dopiero stosunkowo niedawno proces ten zapoczątkował naukę biochemii. Wielki francuski mikrobiolog Louis Pasteur utrzymywał, że fermentacja może zachodzić tylko w nienaruszonych komórkach. Jednak w 1899 roku bracia Büchner odkryli, że fermentacja może następować w przypadku braku nienaruszonych komórek, gdy przechowywali ekstrakt drożdżowy w naczyniu z zagęszczonym roztworem cukru, dodawanym jako środek konserwujący. W ciągu nocy zawartość naczynia sfermentowała, rozlała się po stole laboratoryjnym i podłodze, dramatycznie wykazując, że fermentacja może zachodzić w przypadku braku nienaruszonych komórek. To odkrycie wywołało lawinę badań, które zapoczątkowały naukę biochemii. Badania ujawniły istotną rolę nieorganicznego fosforanu, ADP, ATP i NAD(H), a ostatecznie zidentyfikowały fosforylowane cukry oraz reakcje chemiczne i enzymy, które przekształcają glukozę w pirogronian (glikoliza) lub w etanol i CO₂ (fermentacja). W badaniach rozpoczętych w latach 30. XX wieku zidentyfikowano pośrednie etapy cyklu kwasu cytrynowego i biosyntezy mocznika oraz wykazano istotną rolę niektórych kofaktorów lub „koenzymów” pochodzących z witamin, takich jak pirofosforan tiaminy, ryboflawina, a ostatecznie koenzym A, koenzym Q i kobamid koenzym (kobamid – pochodna witaminy B₁₂, kobalaminy – przyp. tłum.). Lata 50. XX wieku ujawniły, w jaki sposób złożone węglowodany są syntetyzowane z cukrów prostych i na nie rozkładane, a także ścieżki biosyntezy pentoz i katabolizmu aminokwasów i kwasów tłuszczowych. Badacze wykorzystali modele zwierzęce, perfundowane nienaruszone narządy, plasterki tkanek, homogenaty komórek i ich podfrakcje, a następnie oczyszczone enzymy.

Postępy zostały wzmocnione przez rozwój analitycznej ultracentrifugacji (ultrawirowania), papierowej i innych form chromatografii oraz dostępność radioizotopów po II wojnie światowej, głównie ¹⁴C, ³H i ³²P, jako „znaczników” do identyfikacji pośredników w złożonych szlakach, takich jak biosynteza cholesterolu. Następnie krystalografię rentgenowską wykorzystano do rozwiązania trójwymiarowych struktur licznych białek, polinukleotydów, enzymów i wirusów. Postępy genetyczne, które nastąpiły po uświadomieniu sobie, że DNA jest podwójną helisą, obejmują reakcję łańcuchową polimerazy oraz zwierzęta transgeniczne lub te z wyciętymi genami. Metody stosowane do przygotowywania, analizowania, oczyszczania i identyfikacji metabolitów oraz aktywności naturalnych i rekombinowanych enzymów i ich trójwymiarowe struktury omówiono w kolejnych rozdziałach.

BIOCHEMIA I MEDYCYNA WZAJEMNIE STYMULUJĄ SWÓJ ROZWÓJ

Dwa główne zadania naukowców z dziedziny medycyny, a w szczególności naukowców lekarzy, to zrozumienie, co to jest zdrowie i jak je zachować oraz co to jest choroba i jak ją skutecznie leczyć. Biochemia jest fundamentem obu tych wyzwań, a wzajemne powiązania biochemii i medycyny są szerokie i dwukierunkowe. Badania biochemiczne rzuciły światło na wiele aspektów zdrowia i chorób, i odwrotnie, badanie zdrowia i chorób otworzyło nowe wyzwania dla biochemii (ryc. 1-1). Wczesnym przykładem tego powiązania jest badanie struktury i funkcji białka, które ujawniło pojedynczą różnicę w sekwencji aminokwasów między normalną hemoglobiną a hemoglobiną w niedokrwistości sierpowatokrwinkowej. Późniejsza analiza licznych wariantów hemoglobiny w niedokrwistości sierpowatokrwinkowej i innych przyczyniła się znacząco do naszego zrozumienia struktury i funkcji zarówno hemoglobiny, jak i innych białek.

Rycina 1-1. Biochemię i medycynę łączy ulica dwukierunkowa. Wiedza o związkach biochemicznych znajdujących się w górnej części wykresu wpłynęła na wyjaśnienie i zrozumienie chorób wymienionych w dolnej części. I odwrotnie, analiza tych chorób pomogła w naświetleniu wielu dziedzin biochemii. Należy zauważyć, że niedokrwistość sierpowatokrwinkowa jest chorobą genetyczną, a zarówno miażdżyca tętnic, jak i cukrzyca mają genetyczne uwarunkowania.

Na początku XX wieku angielski lekarz Archibald Garrod, badając pacjentów z relatywnie rzadkimi zaburzeniami alkaptonurii, albinizmu, cystynurii i pentozurii, ustalił, że te schorzenia są uwarunkowane genetycznie. Garrod określił je jako wrodzone błędy metabolizmu. Jego spostrzeżenia dały podwaliny pod rozwój genetyki biochemicznej człowieka. Współczesnym jej przykładem jest badanie genetycznych i molekularnych podstaw rodzinnej hipercholesterolemii, choroby, która prowadzi do wystąpienia miażdżycy w młodym wieku. Wyjaśnienie różnych mutacji genetycznych odpowiedzialnych za tę chorobę zapewniło głębsze zrozumienie działania receptorów komórkowych i mechanizmów nie tylko wychwytu cholesterolu, lecz także tego, w jaki sposób inne cząsteczki przenikają przez błony komórkowe. Badania onkogenów i genów supresorowych nowotworów w komórkach raka zwróciły uwagę na mechanizmy molekularne zaangażowane w kontrolę prawidłowego wzrostu komórek. Te przykłady ilustrują, w jaki sposób badanie chorób może stworzyć wyzwania dla podstawowych badań biochemicznych. Biochemia stanowi fundament dla lekarzy i innych pracowników służby zdrowia oraz przedstawicieli biologii, który wpływa na praktykę, stymuluje ciekawość i sprzyja zaadaptowaniu podejścia naukowego w dalszej edukacji.

PRAWIDŁOWE PROCESY BIOCHEMICZNE SĄ PODSTAWĄ ZDROWIA

Badania biochemiczne mają wpływ na naukę o żywieniu i medycynę prewencyjną

Światowa Organizacja Zdrowia (World Health Organization, WHO) definiuje zdrowie jako stan „w pełni dobrego samopoczucia fizycznego, umysłowego i socjalnego, a nie tylko jako brak choroby lub osłabienia”. Z czysto biochemicznego punktu widzenia zdrowie może być rozważane jako sytuacja, w której wszystkie spośród wielu tysięcy reakcji wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych występujących w organizmie przebiegających z odpowiednią szybkością, zapewniają przetrwanie pod presją wewnętrznych i zewnętrznych wyzwań.

Utrzymanie zdrowia wymaga dostarczenia z pożywieniem podstawowych składników węglowodanowych, lipidowych i białkowych, a także optymalnych ilości witamin, niektórych aminokwasów i kwasów tłuszczowych, składników mineralnych oraz wody. Zrozumienie procesu odżywiania w dużej mierze zależy od wiedzy biochemicznej, a nauki biochemiczne i wiedza o odżywianiu wspólnie koncentrują się na tych związkach chemicznych. Wciąż wzrasta znaczenie systemowych działań mających na celu utrzymanie zdrowia i zapobieganie chorobom, czyli medycyny prewencyjnej, obejmujące również podejście dietetyczne w zapobieganiu takim chorobom, jak miażdżyca tętnic i nowotwory.

Większość chorób ma podłoże biochemiczne

Oprócz chorób wynikających z kontaktu z organizmami zakaźnymi i zanieczyszczeniami środowiska istnieje wiele chorób spowodowanych nieprawidłowościami dotyczącymi genów, białek, reakcji chemicznych lub procesów biochemicznych, z których każdy może niekorzystnie dotknąć jedną lub wiele krytycznych funkcji biochemicznych. Przykłady zaburzeń biochemii człowieka odpowiedzialnych za choroby lub inne stany upośledzające funkcjonowanie obejmują zaburzenia gospodarki elektrolitowej, efekty spożycia lub wchłonięcia niewłaściwych składników pożywienia, nierównowagę hormonalną, działania toksycznych związków chemicznych lub czynników biologicznych oraz zaburzenia genetyczne dotyczące DNA. Aby sprostać tym wyzwaniom, badania biochemiczne wciąż się przeplatają z badaniami z dziedzin genetyki, biologii komórki, immunologii, nauki o żywieniu, patologii i farmakologii. Ponadto wielu biochemików jest bardzo zainteresowanych wkładem w mierzenie się z kluczowymi zagadnieniami, takimi jak kwestia przetrwania gatunku ludzkiego oraz edukacja społeczna w zakresie wspierania wykorzystywania metod naukowych do rozwiązywania problemów środowiskowych oraz innych ważnych problemów, które są dla nas wyzwaniem.

Wpływ Programu Poznania Ludzkiego Genomu na biochemię, biologię i medycynę

Nieoczekiwany szybki postęp sekwencjonowania genomu człowieka w późnych latach 90. XX wieku doprowadził do ogłoszenia w połowie roku 2000, że zsekwencjonowano ponad 90% genomu. Przedsięwzięciem kierowały The International Human Genome Sequencing Consortium i prywatna firma Celera Genomics. Z wyjątkiem kilku luk sekwencja całego genomu ludzkiego została określona do 2003 roku, tj. 50 lat po scharakteryzowaniu podwójnej helisy DNA przez Watsona i Cricka.

Wpływ Human Genome Project (HGP) na rozwój biochemii, całej biologii i medycyny jest ogromny. Na przykład możliwość izolacji i sekwencjonowania genu oraz badanie jego struktury i funkcji za pomocą sekwencjonowania oraz doświadczeń z inaktywcją (knockoutem) genowym pozwoliły odkryć wiele poprzednio nieznanych genów i ich produktów. Badania te rzuciły nowe światło na zagadnienie rozwoju człowieka i procedury identyfikacji genów związanych z chorobami.

Największe postępy w biochemii i zrozumieniu ludzkiego zdrowia i choroby nadal osiągane są dzięki wykorzystaniu mutacji genomów organizmów modelowych, takich jak drożdże, oraz eukariotów, takich jak muszka owocowa Drosophila melanogaster, nicień Caenorhabditis elegans czy ryba danio pręgowany. Każdy z tych organizmów ma krótki okres rozwoju i może być poddawany manipulacjom genetycznym, co pozwala rzucić światło na funkcje poszczególnych genów.

Osiągnięcia te potencjalnie mogą się przekładać na opracowanie rozwiązań pomocnych człowiekowi i dostarczenie odpowiedzi, jak leczyć choroby, na które cierpią ludzie, takich jak nowotwory lub choroba Alzheimera. Na rycinie 1-2 przedstawiono dziedziny, których rozwój lub przyspieszenie rozwoju były bezpośrednim skutkiem postępów osiągniętych w Human Genome Project. Rozkwitły nowe pola „omik”, a każda z nich skupia się na kompleksowym badaniu struktury i funkcji cząsteczek, których dotyczy. Produkty genów (cząsteczki RNA i białka) badane są za pomocą technik transkryptomiki i proteomiki. Przykładem wyjątkowo szybkiego postępu transkryptomiki jest eksplozja wiedzy o małych cząsteczkach RNA jako regulatorach aktywności genów. Inne pola „omik” obejmują: glikomikę, lipidomikę, metabolomikę, nutrigenomikę i farmakogenomikę. Aby nadążyć za wytwarzanymi informacjami, wiele uwagi poświęca się bioinformatyce. Innymi dziedzinami, do których trafia impuls z projektu HGP, są biotechnologia, bioinżynieria, biofizyka i bioetyka. Definicje obszarów „omik” umieszczono w Słowniczku na końcu tego rozdziału. Nanotechnologia jest aktywną dziedziną, która może np. przyczynić się do stworzenia nowych metod diagnostyki i leczenia nowotworów oraz innych schorzeń. Biologia komórek macierzystych znajduje się w centrum zainteresowania wielu obecnie prowadzonych badań. Terapia genowa ma już swoje pierwsze sukcesy, lecz musi jeszcze spełnić obietnice, które w niej pokładano. Rozwinięto wiele nowych diagnostycznych testów molekularnych w takich dziedzinach, jak genetyka, mikrobiologia i immunologia. Rośnie również znaczenie biologii systemowej. Wyniki badań na polu różnych wymienionych tu dziedzin ogromnie wpłyną na przyszłość biologii, medycyny i nauk o zdrowiu. Biologia syntetyczna oferuje potencjał tworzenia żywych organizmów z materiału genetycznego, na razie małych bakterii, które mogą pełnić specyficzne zadania, takie jak oczyszczanie wycieków ropy naftowej. To wszystko czyni XXI stulecie ekscytującym czasem dla bezpośredniego zaangażowania w biologię i medycynę.

Rycina 1-2. Projekt poznania ludzkiego genomu (Human Genome Project, HGP). Projekt ten wpłynął na wiele dyscyplin i obszarów nauki. Nie zaznaczono biochemii, ponieważ jej powstanie poprzedza rozpoczęcie HGP, ale takie dyscypliny, jak bioinformatyka, genomika, glikomika, lipidomika, metabolomika, diagnostyka molekularna, proteomika i transkryptomika, stanowią przecież aktywne obszary badań biochemicznych.

STRESZCZENIE

• Biochemia to nauka zajmująca się badaniem różnorodnych cząsteczek występujących w żywych komórkach i organizmach oraz ich reakcji chemicznych, katalizatorów enzymatycznych, a także ekspresji i regulacji każdego procesu metabolicznego. Ponieważ życie zależne jest od reakcji biochemicznych, biochemia stała się wspólnym językiem wszystkich nauk biologicznych.

• Chociaż w tej książce skupiono się na biochemii człowieka, biochemia zajmuje się pełnym zakresem form życia, od prostych wirusów, bakterii i roślin do bardzo skomplikowanych eukariotów, takich jak istota ludzka.

• Biochemia i medycyna oraz inne dyscypliny dotyczące opieki zdrowotnej są ściśle ze sobą związane. Zdrowie każdego gatunku zależy od harmonijnej równowagi reakcji biochemicznych zachodzących w organizmie, a choroby są oznaką odchyleń od normy dotyczących cząsteczek biologicznych oraz reakcji i procesów biochemicznych.

• Osiągnięcia wiedzy biochemicznej rzuciły nowe światło na różne zagadnienia z zakresu wielu dziedzin medycyny, a badanie chorób w wielu przypadkach ujawniło nieoczekiwane aspekty biochemiczne.

• Podejście biochemiczne jest niejednokrotnie kluczowe w rozpoznawaniu przyczyn chorób i w opracowywaniu odpowiedniej terapii, a różne biochemiczne testy laboratoryjne stanowią integralny składnik diagnostyki i monitorowania terapii.

• Znajomość biochemii i pokrewnych dziedzin nauki jest dziś podstawą racjonalnej praktyki w medycynie i naukach o zdrowiu.

• Wyniki Programu Poznania Genomu Ludzkiego (Human Genome Project, HGP) i badań w pokrewnych dziedzinach będą miały głęboki wpływ na przyszłość biologii, medycyny i innych nauk o zdrowiu.

• Badania genomiczne na organizmach modelowych, takich jak drożdże, muszka owocowa D. melanogaster, nicień C. elegans i ryba danio pręgowany, pozwalają lepiej zrozumieć choroby człowieka.

SŁOWNICZEK

Bioetyka: Obszar etyki skupiony na zastosowaniu zasad etycznych i moralnych w biologii i medycynie.

Biofizyka: Zastosowanie fizyki i jej technik w biologii i medycynie.

Bioinformatyka: Dyscyplina związana z gromadzeniem, przechowywaniem i analizą danych biologicznych, głównie dotyczących sekwencji DNA i białek.

Bioinżynieria: Zastosowanie inżynierii w biologii i medycynie.

Biologia komórki macierzystej: Komórki macierzyste są niezróżnicowanymi komórkami, które mają potencjał do samoodnowy i różnicowania się w dorosłe komórki organizmu. Biologia komórki macierzystej dotyczy biologii komórek macierzystych oraz ich potencjału do leczenia różnych chorób (dostępne są komórki macierzyste z krwi pępowinowej – przyp. tłum.).

Biologia syntetyczna: Obszar, który łączy techniki biomolekularne z inżynierią w celu budowania nowych biologicznych funkcji i systemów.

Biologia systemowa: Obszar dotyczący złożonych układów biologicznych badanych jako zintegrowana całość.

Biotechnologia: Obszar, w którym techniki biochemiczne, inżynieria i inne techniki są wykorzystywane w celu rozwoju produktów biologicznych stosowanych w medycynie i przemyśle.

Diagnostyka molekularna: Odnosi się do zastosowań narzędzi molekularnych, takich jak sondy DNA, w celu wsparcia diagnostyki różnych stanów patologicznych: biochemicznych, genetycznych, immunologicznych, mikrobiologicznych i innych.

Farmakogenomika: Zastosowanie informacji genomicznej w celu optymalizacji projektowania oraz rozwoju nowych leków i cząsteczek docelowych dla leków.

Genomika: Genom to kompletny zestaw genów organizmu, a genomika to dogłębna analiza struktury i funkcji genomu.

Glikomika: Glikom to pełny profil wszystkich cukrów prostych i złożonych w organizmie. Glikomika to systemowa analiza struktury i funkcji glikomu, np. glikomu ludzkiego.

Lipidomika: Lipidom to pełny profil wszystkich lipidów w organizmie. Lipidomika to kompleksowe badania struktury i funkcji wszystkich składników lipidomu oraz ich oddziaływań w warunkach zdrowia i choroby.

Metabolomika: Metabolom to pełny profil wszystkich metabolitów (związków drobnocząsteczkowych zaangażowanych w metabolizm) w organizmie. Metabolomika to kompleksowe badania ich struktury, funkcji i ich zmian w różnych stanach metabolicznych.

Nanotechnologia: Rozwój i zastosowanie w medycynie i innych dziedzinach struktur takich jak nanopowłoki, o rozmiarze jedynie kilku nanometrów (10–9 m = 1 nm).

Nutrigenomika: Systematyczne badania nad wpływem składników odżywczych na ekspresję genów i wpływem zmian genetycznych na metabolizm składników odżywczych.

Proteomika: Proteom to pełny profil wszystkich białek organizmu. Proteomika to systematyczne badania struktury i funkcji proteomu i ich zmian w zdrowiu i chorobie.

Terapia genowa: Odnosi się do wykorzystania genów zsyntezowanych technikami inżynierii genetycznej w celu leczenia różnych chorób.

Transkryptomika: Kompleksowe badania transkryptomu, tj. pełnego zestawu transkryptów RNA wytwarzanych z genomu w określonym czasie.

2

Woda i pH

Peter J. Kennelly, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

CELE

Po zapoznaniu się z treścią tego rozdziału Czytelnik powinien:

• Przedstawić właściwości wody, które odpowiadają za jej napięcie powierzchniowe, lepkość i stan ciekły w temperaturze otoczenia oraz zdolność rozpuszczania substancji.

• Przedstawić struktury związków organicznych, które mogą służyć jako donory lub akceptory wiązań wodorowych.

• Wyjaśnić rolę entropii w asocjacji oraz orientacji hydrofobowych i amfipatycznych cząsteczek w środowisku wodnym.

• Wykazać udział ilościowy mostków solnych, oddziaływań hydrofobowych i sił van der Waalsa w stabilizacji konformacji makrocząstek.

• Wyjaśnić relację pH do kwasowości, zasadowości i ilościowych wyznaczników, które cechują słabe i mocne kwasy.

• Obliczyć zmianę pH, która towarzyszy dodaniu określonej objętości kwasu lub zasady do roztworu buforowego.

• Opisać funkcję buforów, sposób ich działania oraz warunki, w których bufor wykazuje najwyższą efektywność w stanach fizjologicznych i innych.

• Wykorzystać równanie Hendersona–Hasselbalcha do wyliczenia ładunku polielektrolitu w określonym pH.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Woda stanowi główny składnik chemiczny organizmów żywych. Jej niezwykłe właściwości fizyczne i chemiczne, do których należy zdolność rozpuszczania wielu organicznych i nieorganicznych związków, wynikają z dipolowej struktury cząsteczki wody i wyjątkowej zdolności tworzenia wiązań wodorowych. Sposób oddziaływania wody z rozpuszczalnymi biocząsteczkami wpływa na strukturę biocząsteczek i samej wody. Woda, będąc doskonałym czynnikiem nukleofilowym, służy jako reagent bądź produkt wielu reakcji metabolicznych. Złożona regulacja równowagi wodnej zależy od mechanizmów podwzgórza kontrolujących pragnienie, od hormonu antydiuretycznego (antidiuretic hormone, ADH), zatrzymywania czy wydalania wody przez nerki oraz utraty wody przez parowanie. Nerkopochodna moczówka prosta, która objawia się niezdolnością zatężania moczu lub dostosowania się do subtelnych zmian osmolarności płynu pozakomórkowego, jest następstwem braku odpowiedzi nerkowych osmoreceptorów na ADH.

Woda wykazuje słabą skłonność do dysocjacji na jony wodorotlenowe i wodoru. Kwasowość roztworów wodnych jest ogólnie wyrażana za pomocą skali logarytmicznej. Wodorowęglan i inne bufory utrzymują właściwe pH płynu pozakomórkowego, które wynosi 7,35–7,45. Podejrzenia o zaburzenia równowagi kwasowo-zasadowej weryfikuje się, mierząc pH krwi tętniczej i zawartość CO₂ we krwi żylnej. Najczęstsze przyczyny kwasicy (wartość pH krwi < 7,35) to ketonemia cukrzycowa i kwasica mleczanowa. Zasadowica (pH krwi > 7,45) może wystąpić np. po wymiotach kwaśną treścią żołądkową.

WODA STANOWI IDEALNY ROZPUSZCZALNIK DLA PROCESÓW BIOLOGICZNYCH

Cząsteczki wody tworzą dipole

Cząsteczka wody ma budowę nieregularnego, nieco pochylonego czworościanu, w którego centrum znajduje się atom tlenu (ryc. 2-1).

Rycina 2-1. Tetraedryczna struktura cząsteczki wody.

Dwa atomy wodoru i wolne pary elektronowe pozostałych dwóch orbitali zhybrydyzowanych sp³ znajdują się w narożach czworościanu. Kąt 105° między dwoma atomami wodoru jest nieco mniejszy od kąta w idealnym tetraedrze (109,5°). Silnie elektroujemny atom tlenu odciąga elektrony od atomów wodoru, nadając im cząstkowy ładunek dodatni, natomiast jego dwie wolne pary elektronowe stanowią region o cząstkowym ładunku ujemnym. Cząsteczka z ładunkiem elektrycznym rozłożonym asymetrycznie w jej strukturze nazywa się dipolem.

Silny dipol wody jest odpowiedzialny za jej wysoką stałą dielektryczną. Zgodnie z prawem Coulomba siła F oddziaływania między przeciwnie naładowanymi cząstkami jest odwrotnie proporcjonalna do stałej dielektrycznej e otaczającego środowiska. Stała dielektryczna próżni wynosi 1, heksanu – 1,9, etanolu – 24,3, a wody w 25°C – 78,5. W roztworze wodnym siły przyciągania między naładowanymi i polarnymi cząstkami znacznie się osłabiają w porównaniu z bezwodnymi środowiskami, charakteryzującymi się małymi wartościami stałych dielektrycznych. Silna dipolowość cząsteczek i duża stała dielektryczna wody umożliwiają jej rozpuszczanie dużych ilości naładowanych związków, takich jak sole.

Cząsteczki wody tworzą wiązania wodorowe

Odsłonięte częściowo jądro atomu wodoru związanego kowalencyjnie z odciągającym elektrony atomem tlenu lub azotu może oddziaływać z wolną parą elektronową innego atomu tlenu bądź azotu, tworząc wiązania wodorowe. Ponieważ cząsteczki wody wykazują obie cechy, wiązania wodorowe sprzyjają asocjacji cząsteczek wody w uporządkowaną sieć (ryc. 2-2).

Rycina 2-2. Wzór z lewej strony: asocjacja dwóch dipolowych cząsteczek wody. Linia kropkowana – wiązanie wodorowe. Wzór z prawej strony: asocjacja cząsteczki wody (środkowej) z czterema innymi cząsteczkami wody. Należy zauważyć, że woda może służyć zarówno jako donor, jak i akceptor wodoru.

Wiązanie wodorowe znacznie wpływa na fizyczne właściwości wody i jej wyjątkowo wysoką lepkość, napięcie powierzchniowe oraz temperaturę wrzenia. Każda cząsteczka wody w stanie ciekłym asocjuje dzięki wiązaniom wodorowym średnio z trzema i pół innymi cząsteczkami. Wiązania te są względnie słabe i nietrwałe, wykazują bowiem okres połowicznego rozpadu wynoszący około kilku pikosekund. Rozerwanie wiązania wodorowego w wodzie (w stanie ciekłym) wymaga tylko około 4,5 kcal/mol, czyli mniej niż 5% energii wymaganej do zerwania wiązania kowalencyjnego O—H. Ta wyjątkowa zdolność relatywnie małej cząstki (18 g/mol) do tworzenia wiazań wodorowych ma kluczowe znaczenie dla właściwości fizykochemicznych wody, wpływając na wysoką lepkość, napięcie powierzchniowe i temperaturę wrzenia.

Dzięki tworzeniu wiązania wodorowego woda może rozpuszczać wiele organicznych biocząsteczek zawierających takie grupy funkcyjne, które mogą uczestniczyć w wiązaniu wodorowym. Atomy tlenu aldehydów, ketonów i amidów dostarczają par elektronów, które mogą służyć np. jako akceptory wodoru. Alkohole, kwasy karboksylowe i aminy mogą być zarówno akceptorami wodoru, jak i donorami nieosłoniętych atomów wodoru w tworzeniu wiązań wodorowych (ryc. 2-3).

Rycina 2-3. Dodatkowe grupy polarne uczestniczą w wiązaniach wodorowych. Na rycinie przedstawiono powstawanie wiązań wodorowych między cząsteczkami etanolu i wody, między dwiema cząsteczkami etanolu oraz między atomem tlenu grupy karbonylowej i grupą N—H w sąsiadujących peptydach.

ODDZIAŁYWANIE BIOCZĄSTECZEK Z WODĄ WPŁYWA NA ICH STRUKTURĘ

Cząsteczki biologiczne są stabilne dzięki wiązaniom kowalencyjnym i niekowalencyjnym

Wiązanie kowalencyjne jest najsilniejszym wiązaniem utrzymującym strukturę cząsteczek (tab. 2-1). Oddziaływania niekowalencyjne, mimo mniejszej siły, dominują w stabilizacji złożonego, trójwymiarowego ukształtowania przestrzennego peptydów i innych makrocząstek, co jest kluczowe dla ich funkcji (zob. rozdz. 5) oraz budowy struktur zbudowanych z wielu makrocząstek. Przykładami tego ostatniego są: łączenie podjednostek polipeptydowych tworzących tetramer hemoglobiny (zob. rozdz. 6), łączenie dwóch nici polinukleotydowych tworzących podwójną spiralę DNA (zob. rozdz. 34) czy łączenie miliardów fosfolipidów, glikosfingolipidów, cholesterolu i innych cząstek w dwuwarstwę stanowiącą fundament błon w komórkach zwierzęcych (zob. rozdz. 40). Te oddziaływania, które mogą być przyciągające lub odpychające, zachodzą zarówno w obrębie makrocząsteczki, jak i z wodą, która tworzy zasadniczy element otaczającego środowiska.

Tabela 2-1. Energie wiązań dla atomów o znaczeniu biologicznym

Typ wiązania

Energia [kcal/mol]

Typ wiązania

Energia [kcal/mol]

O—O

34

O=O

96

S—S

51

C—H

99

C—N

70

C=S

108

S—H

81

O—H

110

C—C

82

C=C

147

C—O

84

C=N

147

N—H

94

C=O

164

W wodzie biocząsteczki przybierają kształt, który pozycjonuje ugrupowania hydrofobowe w swoim wnętrzu

Większość biocząsteczek jest amfipatyczna, co oznacza, że zawierają one regiony bogate w naładowane lub polarne grupy oraz regiony o charakterze hydrofobowym. Białka wykazują tendencję do przyjmowania konformacji, w której hydrofobowe łańcuchy boczne aminokwasów są zwrócone do wnętrza cząsteczki. Aminokwasy z naładowanymi lub polarnymi łańcuchami bocznymi (np. arginina, kwas glutaminowy, seryna – zob. tab. 3-1) zwykle znajdują się na powierzchni białka w bezpośrednim kontakcie z wodą. Podobny układ występuje w dwuwarstwie fosfolipidowej, w której naładowane grupy (głowy) fosfatydyloseryny czy fosfatydyloetanoloaminy stykają się z wodą, natomiast ich hydrofobowe łańcuchy boczne kwasów tłuszczowych skupiają się razem, wypychając wodę (zob. ryc. 40-5). Taki schemat zmniejsza energetycznie niekorzystny kontakt między wodą i grupami hydrofobowymi. To zwiększa również możliwość występowania energetycznie korzystnych oddziaływań: ładunek–dipol, dipol–dipol i za pośrednictwem wiązań wodorowych między polarnymi grupami biocząsteczek i wodą.

Oddziaływania hydrofobowe

Oddziaływanie hydrofobowe przedstawia się jako tendencję niepolarnych związków do samoasocjacji (self-association) w środowisku wodnym. Samoasocjacja nie wynika z wzajemnego przyciągania się ani z tego, co czasem błędnie nazywa się „wiązaniami hydrofobowymi”, a z potrzeby zmniejszenia energetycznie niekorzystnych oddziaływań między niepolarnymi grupami i wodą.

Wprawdzie atomy wodoru niepolarnych grup, takich jak grupy metylenowe węglowodorów, nie tworzą wiązań wodorowych, wpływają jednak na strukturę wody, która je otacza. Cząsteczki wody przylegające do grupy hydrofobowej mają ograniczoną możliwość orientacji (mała liczba stopni swobody), co pozwala im uczestniczyć w maksymalnej liczbie energetycznie korzystnych wiązań wodorowych. Wysoka zdolność tworzenia wielu wiązań wodorowych może być podtrzymywana tylko przez rosnące uporządkowanie przylegających cząsteczek wody, czemu towarzyszy zmniejszenie entropii.

Z drugiego prawa termodynamiki wynika, że optymalna entalpia swobodna mieszaniny węglowodór–woda jest funkcją zarówno największej entalpii (wiązania wodorowego), jak i największej entropii (największa liczba stopni swobody). Niepolarne cząsteczki dążą zatem do tworzenia kropelek o małym polu eksponowanej powierzchni, zmniejszając liczbę oddziałujących na nie cząsteczek wody (ryc. 2-4). Z tej samej przyczyny w środowisku wodnym żywej komórki hydrofobowe części biopolimerów wykazują tendencję do chowania się we wnętrzu cząsteczki lub dwuwarstwy lipidowej, co ogranicza ich kontakt z wodą.

Rycina 2-4. Oddziaływania hydrofobowe są kształtowane przez otaczające cząsteczki wody. Cząsteczki wody są reprezentowane przez jedną czerwoną (tlen) i dwie niebieskie (wodór) kropki. Hydrofobowe powierzchnie cząsteczek substancji rozpuszczonej są szare, a hydrofilowe, tam gdzie występują, zaznaczono na zielono. A. Gdy sześć pokazanych hydrofobowych sześcianów jest rozproszonych w wodzie (po lewej), otaczające cząsteczki wody angażują się w entropicznie niekorzystne oddziaływania ze wszystkimi 36 ścianami sześcianów. Gdy jednak sześć hydrofobowych sześcianów łączy się ze sobą (po prawej), liczba odsłoniętych ścian zmniejsza się do 22. Tworzy się agregat, a jego stabilność jest utrzymywana nie przez siłę przyciągania, ale dlatego, że agregacja zmniejsza liczbę cząsteczek wody w niekorzystnym oddziaływaniu o prawie 40%. B. Cząsteczki amfipatyczne łączą się ze sobą z tego samego powodu. Struktura powstałego kompleksu (np. miceli lub warstwy podwójnej) jest jednak zdeterminowana przez geometrię obszarów hydrofobowych (szary) i hydrofilowych (zielony).

Oddziaływania elektrostatyczne

Oddziaływania między naładowanymi grupami pomagają kształtować strukturę biocząsteczek. Oddziaływania elektrostatyczne między przeciwnie naładowanymi grupami wewnątrz biocząsteczek oraz między nimi są nazywane mostkami solnymi lub oddziaływaniami jonowymi. Siła mostków solnych jest porównywalna do siły wiązań wodorowych, z tym że mogą one działać z większych odległości. Dzięki temu oddziaływania te często ułatwiają wiązanie naładowanych cząsteczek i jonów z białkami i kwasami nukleinowymi.

Siły van der Waalsa

Siły van der Waalsa wynikają z przyciągania się dipoli przejściowych, powstających na skutek szybkiego ruchu elektronów wszystkich obojętnych atomów. Są one znacznie słabsze niż wiązania wodorowe, lecz występują dość powszechnie. Ich moc zmniejsza się proporcjonalnie do odległości między atomami podniesionej do potęgi szóstej (ryc. 2-5). Działają one zatem na bardzo krótkich odległościach, zwykle 0,2–0,4 nm (2–4 Å).

Rycina 2-5. Siła oddziaływania van der Waalsa zmienia się wraz z odległością R. Siła oddziaływania między wchodzącymi w interakcję dipolami rośnie wraz ze spadkiem odległości między nimi, aż do ich rozdzielenia przez odległość styku (strzałka A). Odpychanie wystąpi jako wynik interakcji między chmurą elektronową każdego atomu czy cząsteczki. Chociaż indywidualne siły van der Waalsa są niezwykle słabe, ich sumaryczne znaczenie jest istotne w przypadku takich cząsteczek, jak DNA i białka, których wiele atomów pozostaje w bliskim kontakcie.

Biocząsteczki są stabilizowane przez różnorodne siły

Podwójna helisa DNA jest przykładem makrocząsteczki, którą stabilizują różnorodne siły. Podczas gdy każdy z łańcuchów DNA jest utrzymywany przez wiązania kowalencyjne, oba łańcuchy helisy są utrzymywane wyłącznie przez oddziaływania niekowalencyjne. Te niekowalencyjne oddziaływania obejmują wiązania wodorowe między zasadami nukleotydów (według reguł parowania Watsona i Cricka) oraz oddziaływania van der Waalsa między ustawionymi w stosy parami zasad purynowych i pirymidynowych (tzw. oddziaływania stakingowe). Podwójna helisa stanowi szkielet naładowanych grup fosforanowych i polarnych reszt cukru – rybozy, skierowanych do wody, natomiast względnie hydrofobowe zasady są ukryte wewnątrz. Wydłużony szkielet maksymalnie oddala od siebie ujemnie naładowane reszty fosforanowe, zmniejszając niekorzystne oddziaływania elektrostatyczne (zob. ryc. 34-2).

WODA JEST DOSKONAŁYM CZYNNIKIEM NUKLEOFILOWYM

Reakcje metaboliczne często wymagają ataku wolnych par elektronów bogatych w elektrony cząsteczek zwanych nukleofilami na ubogie w elektrony atomy nazywane elektrofilami. Nukleofile i elektrofile nie muszą mieć formalnego ładunku ujemnego czy dodatniego. Woda, której dwie wolne pary elektronów sp³ niosą cząstkowy ujemny ładunek (zob. ryc. 2-1), jest doskonałym nukleofilem. Do innych biologicznie ważnych nukleofilów zaliczają się atomy tlenu w fosforanach, alkoholach i kwasach karboksylowych, atomy siarki tioli, atomy azotu amin i pierścień imidazolowy histydyny. Powszechnie występujące elektrofile to m.in. atomy węgla grup karbonylowych w amidach, estrach, aldehydach i ketonach, a także atomy fosforu w estrach fosforanowych.

Atak nukleofilowy wody ogólnie prowadzi do rozszczepienia wiązań amidowych, glikozydowych czy estrowych, które utrzymują strukturę biopolimerów. Proces ten nazywa się hydrolizą. Odwrotnie – jeśli jednostki monomerów łączą się, to tworzą biopolimery, takie jak białka czy glikogen. Jak pokazano dalej, woda stanowi produkt uboczny tworzenia wiązania peptydowego między dwoma aminokwasami.

Chociaż hydroliza jest reakcją uprzywilejowaną pod względem termodynamicznym, to jednak wiązania amidowe i fosfoestrowe polipeptydów i oligonukleotydów są stabilne w środowisku wodnym komórki. To pozornie paradoksalne zjawisko odzwierciedla fakt, że termodynamika rządząca równowagą reakcji nie określa szybkości, z jaką reakcja przebiega. Katalizatory białkowe występujące w komórce, nazywane enzymami, przyspieszają reakcje hydrolityczne, kiedy jest to potrzebne. Proteazy katalizują hydrolizę białek do ich składników – aminokwasów, natomiast nukleazy katalizują hydrolizę wiązań fosfodiestrowych w DNA i RNA. Niezbędna jest ostrożna kontrola aktywności tych enzymów, w tym sekwestracja w organellach komórkowych, aby działały one tylko w warunkach fizjologicznych, w których dany biopolimer ma być syntetyzowany lub degradowany.

Wiele reakcji metabolicznych przebiega z przeniesieniem grup

W reakcjach przeniesienia grup grupa G jest przenoszona z donora D na akceptor A i tworzy kompleks akceptorowy A–G:

Hydroliza i fosforoliza glikogenu reprezentują reakcje przeniesienia grup, w których grupy glukozylowe są przenoszone na wodę lub na ortofosforan. Stała równowagi hydrolizy wiązań kowalencyjnych sprzyja powstawaniu produktów rozszczepienia. Odwrotnie – wiele reakcji przeniesienia grup odpowiedzialnych za biosyntezę makrocząsteczek wykorzystuje termodynamicznie niekorzystne tworzenie wiązań niekowalencyjnych. Katalizatory enzymatyczne odgrywają kluczową rolę w przezwyciężaniu tych barier dzięki ich zdolności do bezpośredniego łączenia dwóch oddzielnych reakcji. Przez powiązania reakcji transferu energetycznie niekorzystnych grup z termodynamicznie korzystną reakcją, taką jak hydroliza ATP, nowa sprzężona reakcja może być wygenerowana, a zmiana jej wolnej energii sprzyja syntezie biopolimerów.

Cząsteczki wody wykazują nieznaczną, lecz ważną skłonność do dysocjacji

Zdolność wody do dysocjacji, choć słabej, ma kluczowe znaczenie dla życia. Ponieważ woda może reagować zarówno jako kwas, jak i jako zasada, jej dysocjacja może być przedstawiona jako międzycząsteczkowe przeniesienie protonu tworzącego jon hydroniowy (H₃O⁺) i jon wodorotlenowy (OH–):

Przenoszony proton asocjuje z ugrupowaniem cząsteczek wody i występuje w roztworze nawet nie jako H₃O⁺, lecz czasami jako H₅O₂⁺ czy H₇O₃⁺. Chociaż w praktyce proton jest prawie zawsze zapisywany jako H⁺, nie należy zapominać, że faktycznie jest on silnie hydratowany.

Ponieważ jony hydroniowy i wodorotlenowy są w ciągłym ruchu, tworząc cząsteczki wody i dysocjując, trudno określić, czy pojedynczy atom wodoru lub tlenu występuje jako jon czy jako część cząsteczki wody. W danym momencie może on być jonem, a w następnym – częścią cząsteczki. Jonów oraz cząsteczek wody nie rozpatruje się pojedynczo. Wiedząc, że 1 g wody zawiera 3,46 × 10²² cząsteczek, jonizację wody można opisać statystycznie. Należy znać prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonu lub części cząsteczki wody. Jeśli prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonu wynosi 0,01, oznacza to, że atom wodoru ma 1 szansę na 100 bycia jonem, a 99 szans na 100 istnienia w cząsteczce wody. Faktyczne prawdopodobieństwo znalezienia atomu wodoru w postaci jonu w czystej wodzie wynosi około 1,8 × l0–9. Zatem jest on prawie zawsze częścią cząsteczki wody. Wynika z tego, że w czystej wodzie na każdy jon wodorowy czy wodorotlenowy przypada 0,56 miliarda czy 0,56 × 10⁹ cząsteczek wody. Jony wodorowe i wodorotlenowe mają jednak znaczny wpływ na właściwości wody. Dysocjację wody wyraża się następująco:

W nawiasach przedstawiono stężenia molowe (ściśle rzecz ujmując, aktywności molowe, a wartość K jest stałą dysocjacji). Aby obliczyć stałą dysocjacji wody, należy przypomnieć, że 1 mol cząsteczek wody ma masę 18 g. Jeden litr (L, 1000 g) wody zawiera zatem 1000 : 18 = 55,56 mol/L. Stężenie molowe czystej wody wynosi więc 55,56 mol. Ponieważ prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonowej wynosi 1,8 × 10–9, stężenie molowe jonu H⁺ (lub jonów OH–) w wodzie oblicza się, mnożąc prawdopodobieństwo 1,8 × 10–9 przez stężenie molowe wody, tj. 55,56, co daje wynik = 1,0 × 10–7 mol/L.

Teraz można wyliczyć wartość K dla wody:

Duże stężenie molowe wody (55,56) prawie nie ulega zmianie w wyniku dysocjacji. Dlatego wygodnie jest rozpatrywać stężenie wody niezdysocjowanej jako wartość stałą. Stała ta może być włączona do stałej dysocjacji K, co daje nową stałą Kw, zwaną iloczynem jonowym wody. Zależność między Kw i K jest następująca:

Stałą K wyraża się w molach na litr, a Kw – w molach na litr do kwadratu. Z nazwy wynika, że iloczyn jonowy Kw jest liczbowo równy iloczynowi stężeń molowych jonów H⁺ i OH–:

W temperaturze 25°C Kw = (10–7)² = 10–14 (mol/L)². W temperaturach poniżej 25°C wartość Kw jest mniejsza, powyżej zaś 25°C – większa niż 10–14. W ramach ustalonych granic wpływu temperatury wartość Kw = 10–14(mol/L)² dla wszystkich roztworów wodnych, nawet dla tych, które zawierają kwasy lub zasady. W dalszej części rozdziału stała ta będzie wykorzystywana do obliczania wartości pH roztworów kwaśnych i zasadowych.

pH STANOWI UJEMNY LOGARYTM STĘŻENIA JONÓW WODOROWYCH

Termin pH wprowadził w 1909 roku Sören P. Sörensen, definiując pH jako ujemny logarytm stężenia jonów wodorowych:

pH = -log [H⁺]

Definicja ta, aczkolwiek niezbyt ścisła, jest wystarczająca do celów biochemicznych. Aby obliczyć pH roztworu, należy:

• oznaczyć stężenie jonów wodorowych [H⁺];

• obliczyć logarytm dziesiętny z wartości liczbowej stężenia [H⁺];

• zdefiniować pH jako ujemną wartością znalezioną w poprzednim punkcie.

Na przykład dla czystej wody w temperaturze 25°C:

pH = –log [H⁺] = –log 10⁻⁷ = –(–7) = 7,0

Ta wartość jest znana również jako power (ang.), puissant (franc.) czy potennz (niem.) wykładnika potęgi, dlatego używa się skrótu „p”.

Małe wartości pH odpowiadają dużym stężeniom jonów H⁺, a duże – małym stężeniom H⁺.

Kwasy określa się dawcami (donorami) protonów, a zasady – biorcami (akceptorami) protonów. Wyróżnia się mocne kwasy (np. HCl, H₂SO₄), całkowicie zdysocjowane nawet przy bardzo niskim pH, oraz słabe kwasy, częściowo tylko dysocjujące w roztworach kwaśnych. Podobnie można wyróżnić mocne zasady, np. KOH, NaOH, i słabe zasady, np. Ca(OH)₂. Tylko mocne zasady są całkowicie zdysocjowane przy dużych wartościach pH. Większość związków organicznych w komórkach to słabe kwasy. Wyjątek stanowią ufosforylowane związki pośrednie, które zawierają silnie kwasową grupę kwasu fosforowego.

Poniższe przykłady ilustrują sposób obliczania pH roztworów kwaśnych i zasadowych:

Przykład 1. Jakie jest pH roztworu, w którym stężenie jonu wodorowego wynosi 3,2 × 10–4mol/L?

Przykład 2. Jakie jest pH roztworu, w którym stężenie jonu wodorotlenowego wynosi 4,0 × 10–4 mol/L?

Aby rozwiązać to zadanie, należy określić ilościowo wartość pOH, które jest równe –log [OH–]; wartość tę można wyprowadzić z definicji Kw:

Kw = [H⁺] [OH–] = 10–14

zatem

log [H⁺] + log [OH–] = log 10–14 lub

pH + pOH = 14

następnie:

i teraz

pH = 14 – pOH = 14 – 3,4 = 10,6

W przykładach 1 i 2 przedstawiono, w jaki sposób skala logarytmiczna ułatwia zapis i porównywanie stężeń jonów wodorowych, które różnią się rzędami wielkości, np. 0,00032 M (pH 3,5) i 0,000000000025 M (pH 10,6).

Przykład 3. Jakie jest pH roztworu: (a) 2,0 × 10–2 mol/L KOH, (b) 2,0 × 10–6 mol/LKOH?

W roztworach tych jony OH– pochodzą z dwóch źródeł: KOH i wody. Ponieważ pH określa całkowite stężenie jonów [H⁺] (a pOH – całkowite [OH–]), należy oba źródła brać pod uwagę. W pierwszym przypadku (a) udział wody w całkowitej puli [OH–] jest nieistotny, czego nie można powiedzieć o drugim przypadku (b):

Stężenie [mol/L]

(a)

(b)

Molowość KOH

2,0 × 10–2

2,0 × 10–6

[OH–] z KOH

2,0 × 10–2

2,0 × 10–6

[OH–] z wody

1,0 × 10–7

1,0 × 10–7

Całość [OH–]

2,00001 × 10–2

2,1 × 10–6

Jeśli podejmie się decyzję o znaczeniu udziału wody, pH można wyliczyć jak powyżej.

W przedstawionych przykładach przyjęto założenie, iż mocna zasada KOH jest w pełni zdysocjowana, a stężenie molowe jonów OH– równa się stężeniu molowemu KOH. Założenie to jest słuszne dla względnie rozcieńczonych roztworów mocnych zasad i kwasów, lecz nie dotyczy słabych zasad i kwasów. Ze względu na fakt, że te słabe elektrolity tylko w niewielkim stopniu dysocjują w roztworach, należy przed obliczeniem całkowitego [H⁺] (lub całkowitego [OH–]) oraz pH obliczyć stężenie H⁺ (lub stężenie OH–) z danego stężenia molowego kwasu (lub zasady), wykorzystując stałą dysocjacji.

Grupy funkcyjne, które oddziałują jak słabe kwasy, mają istotne znaczenie fizjologiczne

Wiele związków organicznych w żywych komórkach ma grupy funkcyjne typowe dla słabych kwasów lub słabych zasad. Grupy karboksylowe, aminowe oraz fosforanowe, które powstają w wyniku drugiego stopnia dysocjacji, występują w białkach i kwasach nukleinowych, w większości koenzymów oraz metabolitów pośrednich. Aby zrozumieć wpływ wewnątrzkomórkowego pH na budowę i aktywność biochemiczną tych związków, należy poznać sposób dysocjacji grup funkcyjnych słabo kwaśnych i słabo zasadowych. W laboratoriach badawczych i klinicznych rozdział oparty na wartości ładunku (elektroforeza, chromatografia jonowymienna) i identyfikacja tych związków opierają się na znajomości przebiegu dysocjacji ich grup funkcyjnych.

Omawiając słabe kwasy, często określamy protonowaną formę (HA lub R—SH) jako kwas, a nieprotonowaną formę (A⁻ lub R—S⁻) jako sprzężoną z nim zasadę. Podobnie, formę zdeprotonowaną możemy określać jako zasadę (A− lub R—COO−), a formę protonowaną – jako sprzężony z nią kwas (HA lub R—COOH).

Poniżej podano równania na stałą dysocjacji (Ka) dla typowego słabego kwasu, R—COOH, a także sprzężonego kwasu, R—NH₃⁺, słabej zasady R—NH₂:

Ponieważ wartości Ka dla słabych kwasów są liczbami o wykładniku ujemnym, wygodniej jest wyrażać Ka jako pKa, gdzie:

pKa = –log Ka

Należy odnotować, że pKa odnosi się do Ka, tak jak pH – do stężenia H⁺. Mocniejsze kwasy wykazują mniejsze wartości pKa.

Kilka słabych kwasów (lewa strona), sprzężone z nimi zasady (środek) i wartości pKa (prawa strona) przedstawiono poniżej:

Wartość pKa jest stosowana do wyrażania względnej mocy kwasów i zasad. Z każdym słabym kwasem jest sprzężona mocna zasada, natomiast z mocną zasadą jest sprzężony słaby kwas. Względna moc zasad jest wyrażana jako pKa sprzężonych z nimi kwasów. Dla związków poliprotonowych, zawierających więcej niż jeden oddysocjowujący proton, pKa dla każdego stopnia dysocjacji opatruje się indeksem dolnym w kolejności rosnącej kwasowości. Dla dysocjacji typu:

R—NH₃⁺ → R—NH₂ + H⁺

pKa stanowi takie pH, przy jakim stężenie kwasu R—NH⁺ równa się stężeniu zasady R—NH₂.

Z powyższych równań, odnoszących Ka do [H⁺] i do stężenia niezdysocjowanego kwasu i sprzężonej z nim zasady, wynika, że jeśli:

[R—COO–] = R—COOH

lub jeśli:

[R—NH₂] = [R—NH₃⁺]

to:

Ka = [H⁺]

Można to wyrazić słowami: jeśli forma zasocjowana (protonowana) i zdysocjowana (sprzężona zasada) występują w równych stężeniach, stężenie jonów wodorowych [H⁺] jest liczbowo równe stałej dysocjacji Ka.

Jeśli obie strony powyższego równania zlogarytmuje się i następnie pomnoży przez –1, to:

Ka = [H⁺]

–log Ka = –log [H⁺]

Z definicji –log Ka opisuje się jako pKa, a –log [H⁺] jako pH. W związku z tym można ostatnie równanie zapisać:

pKa = pH

tj. pKa grupy kwasowej jest takim pH, w którym stężenia postaci protonowanej i nieprotonowanej są równe. Wartość pKa kwasu można oznaczyć doświadczalnie przez dodanie 0,5 równoważnika zasady na równoważnik kwasu. Powstałe w ten sposób końcowe pH będzie odpowiadać pKa kwasu.

Zachowanie się słabych kwasów i buforów opisuje równanie Hendersona–Hasselbalcha

Poniżej przedstawiono wyprowadzenie równania Hendersona–Hasselbalcha. Słaby kwas HA dysocjuje w następujący sposób:

Stała dysocjacji dla tej reakcji dysocjacji wynosi:

Po pomnożeniu na krzyż:

[H⁺] [A–] = Ka [HA]

Po podzieleniu obu stron przez [A–]:

Po zlogarytmowaniu obu stron:

Po pomnożeniu przez –1

Po podstawieniu zamiast –log [H⁺] i –log Ka odpowiednio pH i pKa otrzymuje się [HA]:

Odwrócenie ostatniego członu równania usuwa znak minus i daje równanie Hendersona–Hasselbalcha:

Równanie Hendersona–Hasselbalcha ma duże znaczenie w określaniu wartości równowagi protonowej, np.:

1. Kiedy kwas jest zobojętniony dokładnie w połowie, tj. [A–] = [HA]. W tych warunkach:

Zatem w przypadku zobojętnienia w połowie pH = pKa.

2. Kiedy stosunek [A–] ∕ [HA] wynosi 100 : 1

3. Kiedy stosunek [A–] / [HA] wynosi 1 : 10

pH = pKa+ log 1∕10 = pKa+ (–1)

Jeśli równanie zastosuje się dla różnych stosunków [A–] ∕ [HA] w zakresie od 10³ do 10–3 i przedstawi na wykresie wyliczone wartości pH, to otrzymany wynik opisuje krzywą miareczkowania słabego kwasu (ryc. 2-6).

Rycina 2-6. Krzywa miareczkowania kwasu typu HA. Kropka wskazuje pKa o wartości 5,0.

Słabe kwasy mogą być wykorzystane do ustalenia i utrzymania pH roztworów wodnych

Roztwory słabych kwasów i sprzężonych z nimi zasad (lub słabych zasad i sprzężonych z nimi kwasów) wykazują zdolność buforowania, tj. utrzymywania wartości pH na stałym poziomie mimo dodawania silnych kwasów lub zasad. Buforowanie jest potrzebne, ponieważ wiele reakcji metabolicznych przebiega z uwalnianiem lub pobieraniem protonów. Metabolizm tlenowy dostarcza CO₂, bezwodnika kwasu węglowego, który przy braku buforowania spowodowałby ciężką kwasicę. Biologiczne znaczenie utrzymywania stałego pH obejmuje buforowanie przez fosforany, wodorowęglany i białka, które pobierają lub oddają protony, uniemożliwiając zmianę pH. W doświadczeniach przeprowadzonych z wykorzystaniem ekstraktów tkankowych czy enzymów stała wartość pH jest utrzymywana przez dodawanie takich buforów, jak MES (kwas [2-N-morfolino]etanosulfonowy, pKa 6,1), nieorganiczny ortofosforan (pKa2 7,2), HEPES (kwas N-hydroksypiperazyno-N’-etanosulfonowy, pKa 6,8) czy Tris (tris [hydroksymetylo]amino-metan, pKa 8,3). Wybierając bufor, uwzględnia się wartość pKa zależnie od pH, przy jakim buforowanie jest wskazane.

Buforowanie można monitorować przez miareczkowanie słabego kwasu lub zasady przy użyciu pH-metru (zob. ryc. 2-6). Można również obliczyć przesunięcie pH, które następuje w wyniku dodawania kwasu lub zasady do zbuforowanego roztworu. W przedstawionym przykładzie zbuforowany roztwór (mieszanina słabego kwasu i sprzężonej z nim zasady, pKa = 5,0) wykazuje początkowo jedną z czterech wartości pH. Można obliczyć przesunięcie pH, jakie nastąpi, jeśli zostanie dodany 0,1 mmol (milirównoważnik) KOH na 1 milirównoważnik kwasu w roztworze (o stężeniu 1 mol/L).

Początkowe pH

5,00

5,37

5,60

5,86

[A−]początkowe

0,50

0,70

0,80

0,88

[HA]początkowe

0,50

0,30

0,20

0,12

([A−]/[HA])poczatkowe

1,00

2,33

4,00

7,33

Dodanie 0,1 mmol KOH powoduje

[A−]końcowe

0,60

0,80

0,90

0,98

[HA]końcowe

0,40

0,20

0,10

0,02

([A−]/[HA]końcowe

1,50

4,00

9,00

49,0

log ([A−]/[HA])końcowe

0,18

0,60

0,95

1,69

Końcowe pH

5,18

5,60

5,95

6,69

ΔpH

0,18

0,60

0,95

1,69

Należy zauważyć, że zmiana pH po dodaniu 1 mmola (milirównoważnika) jonów OH– zależy od początkowego pH. Przy wartościach pH zbliżonych do pKa roztwory buforowe utrzymują pH skuteczniej. Roztwór słabego kwasu i sprzężonej z nim zasady buforuje najefektywniej w zakresie pH odpowiadającym pKa ± 1,0.

Na rycinie 2-6 przedstawiono także ładunek elektryczny 1 cząsteczki kwasu jako funkcję pH. Ładunek 0,5 nie oznacza, że pojedyncza cząsteczka jest obdarzona ładunkiem ułamkowym, lecz wyraża prawdopodobieństwo, z jakim cząsteczka ma ładunek jednostkowy w danym czasie. Rozważanie ładunku elektrycznego makrocząsteczek jako funkcji pH stanowi podstawę technik rozdziału, takich jak chromatografia jonowymienna i elektroforeza (zob. rozdz. 4).

Moc kwasów zależy od struktury cząsteczkowej

Wiele kwasów o znaczeniu biologicznym zawiera więcej niż jedną grupę dysocjującą. Obecność sąsiadującego ujemnego ładunku hamuje uwalnianie protonu z pobliskiej grupy, podnosząc jej pKa. Zjawisko to jest wyraźne, jeśli porównuje się wartości pKa trzech dysocjujących grup kwasu fosforowego i kwasu cytrynowego (tab. 2-2). Wpływ sąsiadującego ładunku zmniejsza się ze wzrostem odległości. Wartość pKa2 kwasu bursztynowego, który zawiera dwie grupy metylenowe między jego grupami karboksylowymi, wynosi 5,6, a pKa2 kwasu glutarowego – z dodatkową grupą metylenową – 5,4.

Tabela 2.2. Względna moc wybranych kwasów o znaczeniu biologicznym. W tabeli przedstawiono wartości pKa (–log stałej dysocjacji) wybranych jedno-, dwu- i trójzasadowych kwasów

Kwasy jednozasadowe

Mrówkowy

pKa

3,75

Mlekowy

pKa

3,86

Octowy

pKa

4,76

Jon amonowy

pKa

9,25

Kwasy dwuzasadowe

Węglowy

pKa1

6,37

pKa2

10,25

Bursztynowy

pKa1

4,21

pKa2

5,64

Glutarowy

pKa1

4,34

pKa2

5,41

Kwasy trójzasadowe

Fosforowy

pKa1

2,15

pKa2

6,82

pKa3

12,38

Cytrynowy

pKa1

3,08

pKa2

4,74

pKa3

5,40

Wartości pKa zależą od właściwości środowiska

Na wartość pKa określonej grupy funkcyjnej w sposób istotny wpływa także środowisko. Może ono albo zwiększać, albo zmniejszać pKa, w zależności od tego, czy niezdysocjowany kwas i sprzężona z nim zasada są obdarzone ładunkiem. Wpływ stałej dielektrycznej na pKa można zaobserwować po dodaniu etanolu do wody. Wartość pKa kwasu karboksylowego wzrasta, natomiast dla aminy maleje, ponieważ etanol zmniejsza zdolność wody do rozpuszczania naładowanych grup. Wartości pKa dysocjujących grup we wnętrzu białek w dużym stopniu zależą od ich otaczającego środowiska, w tym obecności lub braku wody.

STRESZCZENIE

• Dzięki wiązaniom wodorowym woda tworzy skupienia cząsteczek własnych lub z innymi donorami bądź akceptorami atomów wodoru. Wiązania wodorowe odpowiadają za napięcie powierzchniowe, lepkość i stan ciekły wody w temperaturze pokojowej oraz jej zdolność rozpuszczania substancji.

• Związki, które zawierają O lub N, mogą służyć jako donory bądź akceptory wiązań wodorowych.

• Entropia decyduje o tym, że amfipatyczne makrocząsteczki ukrywają regiony niepolarne przed wodą.

• Mostki solne (jonowe), oddziaływania hydrofobowe i siły van der Waalsa uczestniczą w tworzeniu kompleksów biomolekuł i utrzymaniu struktury molekularnej.

• pH stanowi ujemny logarytm stężenia [H⁺]. Niskie pH mają roztwory kwasowe, a wysokie – zasadowe.

• Moc słabych kwasów przedstawia się jako wartość pKa – ujemny logarytm stałej dysocjacji kwasu. Mocne kwasy wykazują małe wartości pKa, a słabe kwasy – duże.

• Bufory chronią przed zmianami pH, kiedy w roztworze przybywa lub ubywa protonów. Największa zdolność buforowania występuje w zakresie pH odpowiadającym ±1 pKa po każdej stronie pKa. Fizjologiczne bufory zawierają wodorowęglan, ortofosforan i białka.

PIŚMIENNICTWO

Reese K.M.: Whence came the symbol pH. Chem. Eng. News 2004; 82: 64.

Segel I.M.: Biochemical Calculations. Wiley, 1968.

Skinner J.L.: Following the motions of water molecules in aqueous solutions. Science 2010; 328(5981): 985–986.

Stillinger F.H.: Water revisited. Science 1980; 209(4455): 451–457.

Suresh S.J., Naik V.M.: Hydrogen bond thermodynamic properties of water from dielectric constant data. J. Chem. Phys. 2000; 113(21): 9727–9732.

Wiggins P.M.: Role of water in some biological processes. Microbiol. Rev. 1990; 54(4): 432–449.

3

Aminokwasy i peptydy

Peter J. Kennelly, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

CELE

Po zapoznaniu się z treścią tego rozdziału Czytelnik powinien:

• Napisać wzór strukturalny oraz podać symbole trzy- i jednoliterowe każdego aminokwasu występującego w białkach.

• Opisać wpływ każdej grupy R aminokwasów występujących w białkach na ich właściwości chemiczne.

• Wymienić dodatkowe kluczowe funkcje aminokwasów i wyjaśnić, w jaki sposób niektóre aminokwasy nasion roślin mogą wpływać na zdrowie człowieka.

• Podać nazwy zjonizowanych grup aminokwasów białkowych i wymienić ich średnie wartości pKa w postaci wolnych aminokwasów w roztworze wodnym.

• Obliczyć pH niezbuforowanych wodnych roztworów aminokwasów wielofunkcyjnych i zmiany w ich pH, które wystąpią po wprowadzeniu określonych objętości silnych kwasów czy zasad.

• Zdefiniować pojęcie pI i wyjaśnić jego relację do ładunku w wielofunkcyjnych elektrolitach.

• Wyjaśnić, w jaki sposób wartości pKa i pI w określonym pH mogą być zastosowane w przewidywaniu ruchliwości polielektrolitów, takich jak aminokwasy, w stałym polu elektrycznym.

• Opisać orientację, nomenklaturę i strukturę pierwszorzędową peptydów.

• Opisać konsekwencje konformacyjne częściowo podwójnego charakteru wiązania peptydowego.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Oprócz dostarczania monomerycznych jednostek, z których syntetyzowane są długie łańcuchy polipeptydowe białek, L-α-aminokwasy i ich pochodne uczestniczą w tak różnych funkcjach komórkowych, jak przewodzenie impulsów nerwowych czy biosynteza porfiryn, puryn, pirymidyn oraz mocznika. Układ neuroendokrynny wykorzystuje krótkie polimery aminokwasów, zwane peptydami, jako hormony, czynniki uwalniające hormony, neuromodulatory i neuroprzekaźniki. Ludzie i wiele zwierząt nie są w stanie syntetyzować 10 L-α-aminokwasów obecnych w białkach w ilościach wystarczających do wspierania wzrostu niemowląt lub utrzymania zdrowia w wieku dorosłym. W związku z tym dieta człowieka musi zawierać odpowiednie ilości tych niezbędnych aminokwasów odżywczych. Każdego dnia nerki filtrują ponad 50 g wolnych aminokwasów z krwi tętniczej nerkowej. Jednak w moczu zazwyczaj pojawiają się jedynie śladowe ilości wolnych aminokwasów, ponieważ aminokwasy są prawie całkowicie wchłaniane zwrotnie w kanaliku proksymalnym, co pozwala im zachować je do syntezy białek i innych ważnych funkcji. Niektóre mikroorganizmy wydzielają wolne D-aminokwasy czy peptydy zawierające zarówno D-, jak i L-α-aminokwasy. Niektóre z tych peptydów bakteryjnych mają wartość terapeutyczną, w tym antybiotyki – bacytracyna i gramicydyna A – oraz lek przeciwnowotworowy – bleomycyna. Inne peptydy bakteryjne są znane jako czynniki toksyczne. Peptydy sinicowe, mikrocystyna i nodularyna, są śmiertelne w dużych dawkach, podczas gdy małe ilości sprzyjają powstawaniu guzów wątroby. Spożycie niektórych aminokwasów obecnych w nasionach roślin strączkowych z rodzaju Lathyrus może prowadzić do latyryzmu, tragicznej, nieodwracalnej choroby, w której pacjenci tracą kontrolę nad kończynami. Pewne inne aminokwasy z nasion roślin również zostały powiązane z chorobą neurodegeneracyjną, na którą cierpią rdzenni mieszkańcy Guamu.

WŁAŚCIWOŚCI AMINOKWASÓW

Kod genetyczny określa 20 L-α-aminokwasów

Spośród 300 występujących w przyrodzie aminokwasów białka są syntezowane wyłącznie z 20 L-α-aminokwasów kodowanych przez trójki nukleotydowe, zwane kodonami (tab. 3-1). Chociaż trójliterowy kod genetyczny mógłby pomieścić więcej niż 20 aminokwasów, jego degeneracja sprowadza dostępne kodony do 20 podstawowych L-α-aminokwasów, podanych w tabeli 3-1. W zapisie reszt aminokwasowych w peptydach można stosować dwie formy skrótów – jedno- i trójliterową dla każdego aminokwasu (tab. 3-1). Te aminokwasy można podzielić na hydrofilowe i hydrofobowe (tab. 3-2). Wskazane właściwości wpływają na ich lokalizację w dojrzałych, zwiniętych białkach (zob. rozdz. 5). Niektóre białka zawierają dodatkowe aminokwasy, będące wynikiem modyfikacji potranslacyjnych aminokwasów już obecnych w peptydzie. Przykłady obejmują zamianę reszt proliny i lizyny na reszty 4-hydroksyproliny i 5-hydroksylizyny oraz peptydyloglutaminianu na γ-karboksyglutaminian, a także metylację, formylację, acetylację, prenylację i fosforylację niektórych reszt aminokwasowych. Modyfikacje te poszerzają biologiczną różnorodność białek, zmieniając ich rozpuszczalność, stabilność, aktywność katalityczną i oddziaływania z innymi białkami.

Tabela 3-1. l-α-aminokwasy występujące w białkach

Nazwa

Symbol

Wzór strukturalny

pK₁

pK₂

pK₃

Aminokwasy z alifatycznymi łańcuchami bocznymi

α-COOH

α-NH₃⁺

Grupa R

Glicyna

Gly [G]

2,4

9,8

Alanina

Ala [A]

2,4

9,9

Walina

Val [ V]

2,2

9,7

Leucyna

Leu [L]

2,3

9,7

Izoleucyna

Ile [I]

2,3

9,8

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym grupy hydroksylowe (OH)

Seryna

Ser [S]

2,2

9,2

Około 13

Treonina

Thr [T]

2,1

9,1

Około 13

Tyrozyna

Tyr [Y]

Zob. s. 20

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym atomy siarki

Cysteina

Cys [C]

1,9

10,8

8,3

Metionina

Met [M]

2,1

9,3

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym grupy karboksylowe (kwasowe) lub ich amidy

Kwas asparginowy

Asp [D]

2,0

9,9

3,9

Asparagina

Asn [N]

2,1

8,8

Kwas glutaminowy

Glu [E]

2,1

9,5

4,1

Glutamina

Gln [Q]

2,2

9,1

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym grupy zasadowe

Arginina

Arg [R]

1,8

9,0

12,5

Lizyna

Lys [K]

2,2

2,2

10,8

Histydyna

His [H]

1,8

9,3

6,0

Aminokwasy zawierające pierścień aromatyczny

Histydyna

His [H]

Zob. wyżej

Fenyloalanina

Phe [F]

2,2

9,2

Tyrozyna

Tyt [Y]

2,2

9,1

10,1

Tryptofan

Trp [W]

2,4

9,4

Iminokwasy

Prolina

Pro [P]

2,0

10,6

Tabela 3-2. Aminokwasy hydrofilowe i hydrofobowe

Hydrofilowe

Hydrofobowe

Arginina

Alanina

Asparagina

Fenyloalanina

Cysteina

Izoleucyna

Glicyna

Leucyna

Glutamina

Metionina

Histydyna

Prolina

Kwas asparaginowy

Tryptofan

Kwas glutaminowy

Tyrozyna

Lizyna

Walina

Seryna

Treonina

Podział jest oparty na tendencji do asocjacji bądź zmniejszania kontaktu przez środowisko wodne.

Selenocysteina, 21. L-α-aminokwas białkowy

Selenocysteina (ryc. 3-1) jest aminokwasem zidentyfikowanym w niektórych białkach związanych z funkcjonowaniem organizmów żywych. U ludzi zidentyfikowano ponad 20 selenobiałek – znajdują się wśród nich niektóre peroksydazy i reduktazy, selenoproteina P, krążąca w osoczu, oraz dejodazy jodotyroninowe odpowiadające za przemianę prohormonu tyroksyny (T₄) do 3,3′,5-tri-jodotyroniny (T₃), hormonu tarczycy (zob. rozdz. 41). Nazwa wskazuje, że atom selenu zastępuje siarkę w jej strukturalnym analogu, cysteinie. Selenocysteina nie jest produktem modyfikacji potranslacyjnej, lecz jest włączana do rosnącego polipeptydu podczas translacji. Dlatego selenocysteina jest określana jako 21. aminokwas. W przeciwieństwie do pozostałych 20 aminokwasów włączenie selenocysteiny jest określane przez duży i złożony genetycznie element niezwykłego tRNA, opisywanego jako tRNASec, który wykorzystuje kodon UGA, stanowiący prawidłowo sygnał STOP. Niemniej aparat syntezy białek może identyfikować selenocysteinylospecyficzny kodon UGA dzięki obecności towarzyszącego elementu insercyjnego o strukturze stem-loop w rejonie nieulegającym translacji mRNA (zob. rozdz. 27).

Rycina 3-1. Cysteina (po lewej) i selenocysteina (po prawej). pK₃, dla protonu selenylowego seleno-cysteiny wynosi 5,2. Ponieważ jest to wartość o 3 jednostki pH mniejsza niż dla cysteiny, selenocysteina stanowi lepszy czynnik nukleofilowy przy albo poniżej pH 7,4.

Stereochemia aminokwasów białkowych

Z wyjątkiem glicyny atom węgla α każdego aminokwasu jest chiralny. Chociaż niektóre aminokwasy białkowe są prawoskrętne, a niektóre lewoskrętne, wszystkie mają wspólną konfigurację absolutną L-gliceraldehydu i dlatego są definiowane jako L-α-aminokwasy. Chociaż prawie wszystkie aminokwasy białkowe są (S), brak użycia (R) lub (S) do wyrażenia stereochemii absolutnej nie jest jedynie historyczną aberracją. L-cysteina jest (R), ponieważ masa atomowa atomu siarki przy węglu C3 przewyższa masę atomową grupy aminowej przy węglu C2. Co ważniejsze, u ssaków reakcje biochemiczne L-α-aminokwasów, ich prekursorów i katabolitów są katalizowane przez enzymy działające wyłącznie na izomery L, niezależnie od ich konfiguracji absolutnej.

Potranslacyjne modyfikacje nadają dodatkowe właściwości

Podczas gdy niektóre organizmy prokariotyczne włączają pirolizynę w białka, a rośliny mogą włączać kwas azetydyno-2-karboksylowy, analog proliny, zestaw 21 L-α-aminokwasów pozwala w pełni wyjaśnić tworzenie większości białek. Potranslacyjne modyfikacje mogą jednak generować nowe ugrupowania R, które nadają jeszcze inne właściwości. Na przykład w kolagenie wbudowane do białek reszty proliny i lizyny są zmieniane na 4-hydroksyprolinę i 5-hydroksylizynę (ryc. 3-2). Karboksylacja reszt glutamylowych białek kaskady krzepnięcia do reszt karboksyglutamylowych tworzy ugrupowanie chelatujące jon wapnia, istotne w krzepnięciu krwi (ryc. 3-3). Aminokwasy łańcuchów bocznych histonów podlegają licznym modyfikacjom, w tym acetylacji i metylacji (lizyna) oraz metylacji i deaminacji (arginina) (zob. rozdz. 35 i 38). Obecnie stało się możliwe wprowadzenie w laboratorium na drodze inżynierii genetycznej wielu nienaturalnych aminokwasów do białek, syntezując białka przez ekspresję rekombinowanych genów z nowymi lub poprawionymi właściwościami i dostarczając nowych sposobów wyjaśniania relacji struktura–funkcja białek.

Rycina 3-2. 4-hydroksyprolina i 5-hydroksylizyna.

Rycina 3-3. Kwas γ-karboksyglutaminowy.

W meteorytach wykryto pozaziemskie aminokwasy

Istnienie pozaziemskich aminokwasów po raz pierwszy odnotowano w 1969 roku po analizie słynnego meteorytu Murchison z południowo-wschodniej Australii. Obecność aminokwasów w innych meteorytach, w tym w niektórych niezanieczyszczonych okazach z Antarktydy, została obecnie w pełni potwierdzona. W przeciwieństwie do aminokwasów syntetyzowanych przez organizmy na Ziemi meteoryty te zawierają racemiczne mieszaniny izomerów D i L wielu aminokwasów białkowych, a także biologicznie ważnych niebiałkowych α-aminokwasów, takich jak N-metyloglicyna (sarkozyna) i β-alanina. Odkryto również kilka nowych aminokwasów, którym brakuje ziemskich odpowiedników pochodzenia biotycznego. W meteorytach wykryto ponadto zasady kwasów nukleinowych, aktywowane fosforany i cząsteczki zbliżone strukturalnie do cukrów. Odkrycia te oferują potencjalny wgląd w prebiotyczną chemię Ziemi i mają wpływ na poszukiwania życia pozaziemskiego. Niektórzy spekulują, że meteoryty mogły się przyczynić do powstania życia na naszej planecie (przypuszczenie to określa się mianem panspermii), dostarczając na nią pozaziemskie cząsteczki organiczne lub nawet nienaruszone mikroorganizmy.

L-α-aminokwasy pełnią dodatkowe funkcje metaboliczne

L-α-aminokwasy mają istotne funkcje metaboliczne, oprócz tego, że pełnią funkcje „cegiełek” budulcowych białek. Na przykład ornityna i cytrulina są kluczowymi pośrednikami w cyklu mocznikowym (zob. ryc. 28-16), a S-adenozylometionina jest donorem grupy metylowej w wielu reakcjach katalizowanych przez enzymy. Tyrozyna to prekursor hormonu tarczycy, a zarówno tyrozyna, jak i fenyloalanina są metabolizowane do epinefryny, norepinefryny i dihydroksyfenyloalaniny (DOPA). Glutaminian jest zarówno neuroprzekaźnikiem, jak i prekursorem drugiego neuroprzekaźnika, kwasu γ-aminomasłowego (gamma aminobutyric acid, GABA).

Niektóre roślinne L-α-aminokwasy mogą wpływać niekorzystnie na zdrowie człowieka

Spożycie niektórych aminokwasów niebiałkowych występujących w roślinach może niekorzystnie oddziaływać na zdrowie człowieka. Spożycie nasion i produktów z nasion trzech gatunków roślin strączkowych Lathyrus wpływa na powstawanie neurolatyryzmu, poważnego neurologicznego zaburzenia charakteryzującego się nieodwracalnym niedowładem spastycznym nóg. Latyryzm pojawia się często podczas klęsk głodowych, kiedy nasiona Lathyrus stanowią główny składnik diety. L-α-aminokwasy, które odgrywają rolę w rozwoju zaburzeń neurologicznych u człowieka, a w szczególności neurolatyryzmu, zawierają L-homoargininę i kwas β-N-oksalil-α-β-diaminopropionowy (β-ODAP; tab. 3-3). Nasiona rośliny strączkowej Lathyrus (słodki groszek) zawierają γ-glutamylo-β-aminopropionylonitryl (BAPN), pochodną glutamylową β-aminopropionylonitrylu (struktury nie przedstawiono). Nasiona niektórych gatunków Lathyrus zawierają także kwas α,γ-diaminomasłowy, analog ornityny, który hamuje wątrobowy enzym cyklu mocznikowego transkarbamoilazę ornitynową. To zaburzenie cyklu mocznikowego prowadzi do nagromadzenia toksycznego amoniaku. Wreszcie stwierdzono, że β-metyloaminolalanina, neurotoksyczny aminokwas występujący w nasionach sagowca Cycad, jest czynnikiem rozwoju ryzyka chorób neurodegradacyjnych, w tym zespołu stwardnienie zanikowe boczne–parkinsonizm–zespół otępienny (stwardnienie zanikowe boczne zachodniego Pacyfiku), występującego u mieszkańców wyspy Guam, którzy spożywają tzw. nietoperze owocowe (fruit bats), zjadające owoce sagowca, lub mąkę z nasion sagowca.

D-aminokwasy

Do D-aminokwasów występujących w przyrodzie należą D-seryna i D-asparaginian, znajdujące się w tkance mózgowej, D-alanina i D-glutaminian, obecne w ścianach komórkowych bakterii Gram-dodatnich, a także D-aminokwasy, znajdujące się w niektórych peptydach, oraz antybiotyki produkowane przez bakterie, grzyby, gady i inne gatunki poza ssakami. Bacillus subtilis wydziela D-metioninę, D-tyrozynę, D-leucynę i D-tryptofan wyzwalające rozpad biofilmu, a Vibrio cholerae włącza D-leucynę i D-metioninę do peptydowego składnika we własnej warstwie peptydoglikanu.

Tabela 3-3. Potencjalnie toksyczne l-α-aminokwasy

L-α-aminokwas niebiałkowy

Znaczenie medyczne

Homoarginina

Aminokwas rozkładany przez arginazę do L-argininy i mocznika.

Odpowiedzialny za neurolatyryzm

Kwas β-N-oksalildiaminopro-pionowy (β-ODAP)

Neurotoksyna odpowiedzialna za neurolatyryzm

β-N-glutamyloaminopro-pionylo-nitryl (BAPN)

Osteolatyrogen

Kwas 2,4-diaminomasłowy

Hamuje transkarbamoilazę ornitynową, powodując zatrucia amoniakiem

β-metyloamino-L-alanina

Możliwy czynnik ryzyka rozwoju chorób neurodegeneracyjnych

WŁAŚCIWOŚCI GRUP FUNKCYJNYCH AMINOKWASÓW

Cząsteczki aminokwasów mogą wykazywać dodatni, ujemny lub zerowy ładunek

Naładowane i nienaładowane formy zdolnych do jonizacji słabo kwaśnych grup —COOH i NH₃⁺ występują w roztworach wodnych w stanie równowagi reakcji dysocjacji kwasowo-zasadowej:

R—COOH R—COO– + H⁺

R—NH₃⁺ R—NH₂ + H⁺

Oba związki – R—COOH i R—NH₃⁺ – są słabymi kwasami, lecz R—COOH jest mocniejszym kwasem niż R—NH₃⁺. W fizjologicznym pH (pH 7,4) grupy karboksylowe występują prawie wyłącznie jako R—COO–, a grupy aminowe – głównie jako R—NH₃⁺. Grupa imidazolowa histydyny i grupa guanidynowa argininy występują jako hybrydy rezonansowe z dodatnim ładunkiem rozłożonym między dwa atomy azotu (histydyna) lub wszystkie trzy atomy azotu (arginina) (ryc. 3-4).

Rycina 3-4. Rezonansowe hybrydy u protonowanych form grup R histydyny (u góry) i argininy (u dołu).

Rycina 3-5. Dysocjacja kwasowo-zasadowa kwasu asparaginowego.

Na rycinie 3-5 przedstawiono wpływ pH środowiska wodnego na stan zjonizowania kwasu asparaginowego.

Cząsteczki, które zawierają jednakowe liczby zjonizowanych grup o przeciwnym ładunku, zatem nie są obdarzone wypadkowym ładunkiem, nazywa się jonami obojnaczymi. Wolne aminokwasy we krwi i w większości tkanek powinny być przedstawione wzorem A:

Struktura B nie może występować w roztworze wodnym, ponieważ przy dostatecznie niskim pH, przy jakim dochodzi do protonowania grupy karboksylowej, grupa aminowa będzie występować także w formie protonowanej. Podobnie, przy pH dostatecznie wysokim, aby grupa aminowa występowała w formie nienaładowanej, grupa karboksylowa będzie występować jako R—COO–. Wzór B stosuje się jednak często w równaniach, w których rozważanie dysocjacji kwasowo-zasadowej nie jest potrzebne.

Wartości pK wyrażają moc słabych kwasów i zasad

Moc słabych kwasów wyraża się jako ich stałe dysocjacji pKa. W przypadku cząsteczek z wieloma dysocjującymi protonami pKa dla każdej grupy kwasowej oznacza się, zastępując indeks dolny „a” liczbą. Moc słabych zasad wyraża się zazwyczaj jako pKa ich sprotonowanej, czyli sprzężonej formy kwasu. Umożliwia to porównanie względnej mocy wszystkich grup zdolnych do dysocjacyjnego wiązania białek w jednej, ciągłej skali. Terminy „słaby kwas” i „słaba zasada” stanowią zatem dowolne oznaczenia, ponieważ w każdej równowadze protonowej muszą uczestniczyć zarówno formy kwasowe, jak i zasadowe. Ładunek wypadkowy aminokwasu – algebraiczna suma wszystkich obecnych grup o ładunku dodatnim i ujemnym – zależy od wartości pKa jego grup funkcyjnych oraz pH otaczającego środowiska. W laboratorium zmiana ładunku aminokwasów i ich pochodnych poprzez zmianę pH ułatwia fizyczny rozdział aminokwasów, peptydów i białek (zob. rozdz. 4).

W punkcie izoelektrycznym (pI) cząsteczka aminokwasu nie jest obdarzona ładunkiem

Forma izoelektryczna cząsteczki zawiera jednakowe liczby dodatnich i ujemnych ładunków, zatem jest elektrycznie obojętna. Punkt izoelektryczny (pI) jest to wartość pH równa średniej arytmetycznej wartości pKa form znajdujących się po obu stronach formy izoelektrycznej. W przypadku aminokwasu, np. alaniny, zawierającego tylko dwie grupy zjonizowane nie ma niejasności w wyliczeniu pI. Pierwsza wartość pKa (R—COOH) wynosi 2,35, a druga wartość pKa (R—NH₃⁺) to 9,69. W ten sposób punkt izoelektryczny alaniny wynosi:

Dla aminokwasów poliprotonowych istotne jest najpierw zidentyfikowanie form jonowych. Na przykład pI kwasu asparaginowego wynosi:

Dla lizyny pI wylicza się ze wzoru:

Podobne rozważania stosuje się do wszystkich kwasów poliprotonowych (np. białek), niezależnie od liczby obecnych grup zdysocjowanych. W laboratorium klinicznym znajomość wartości pI jest niezbędna do wyboru warunków rozdziału elektroforetycznego. Elektroforeza przy pH 7,0 pozwoli na rozdzielenie dwóch cząsteczek o wartościach pI 6,0 i 8,0, ponieważ cząsteczka o pI 6,0 będzie miała sumaryczny ładunek ujemny, a cząsteczka o pI 8,0 – sumaryczny ładunek dodatni. Podobne rozważania leżą u podstaw rozdziałów chromatograficznych z zastosowaniem nośników jonowych, takich jak dietyloaminoetyloceluloza (DEAE). (zob. rozdz. 4).

Wartości pKa zależą od środowiska

Środowisko dysocjującej grupy wpływa na jej pKa (tab. 3-4).

Niepolarne środowisko, które wykazuje mniejszą zdolność niż woda dla stabilizacji naładowanych grup, podnosi wartość pKa grupy karboksylowej, czyniąc ją słabszym kwasem, ale zmniejsza pKa grupy aminowej, czyniąc ją mocniejszym kwasem. Obecność przylegających przeciwnie naładowanych grup może stabilizować lub podobnie naładowane grupy mogą destabilizować wywoływany ładunek. Dlatego wartości pKa grup R wolnych aminokwasów w roztworze wodnym (zob. tab. 3-1) dostarczają tylko przybliżonych wskazówek co do pKa tych samych aminokwasów, kiedy występują w białkach. Wartość pKa dysocjującej grupy R będzie zależeć od jej położenia w białku. Na przykład wartości pKa, które odbiegają od „wartości typowych” niekiedy aż o 3 jednostki pH, są charakterystyczne dla centrów aktywnych enzymów. Krańcowy przykład dotyczy kwasu asparaginowego ukrytego w cząsteczce tioredoksyny, dla którego wartość pKa wynosi ponad 9, zatem przesunięcie przekracza 6 jednostek pH!

Tabela 3-4. Typowy zakres wartości pKa dla zjonizowanych grup w białkach

Grupa dysocjująca

Zakres pKa

α-karboksylowa

3,5–4,0

Nie α-karboksylowa Asp czy Glu

4,0–4,8

Imidazolowa His

6,5–7,4

—SH Cys

8,5–9,0

—OH Tyr

9,5–10,5

α-aminowa

8,0–9,0

ε-aminowa Lys

9,8–10,4

Guanidynowa Arg

~12,0

Rozpuszczalność aminokwasów odzwierciedla ich charakter jonowy

Naładowane grupy funkcyjne aminokwasów gwarantują, że rozpuszczają się one z łatwością w rozpuszczalnikach polarnych, takich jak woda i etanol, lecz nie rozpuszczają się w rozpuszczalnikach niepolarnych, takich jak benzen, heksan lub eter.

Aminokwasy nie absorbują światła widzialnego, są więc bezbarwne. Tyrozyna, fenyloalanina, a w szczególności tryptofan absorbują jednak światło nadfioletowe (250–290 nm). Ponieważ tryptofan absorbuje światło UV około 10-krotnie efektywniej niż fenyloalanina czy tyrozyna, aminokwas ten warunkuje zdolność większości białek do absorpcji światła o długości fali 280 nm (ryc. 3-6).

Rycina 3-6. Widma absorpcji w ultrafiolecie tryptofanu, tyrozyny i fenyloalaniny.

GRUPY R PRZY ATOMIE WĘGLA α OKREŚLAJĄ WŁAŚCIWOŚCI AMINOKWASÓW

Każda grupa funkcyjna aminokwasu ma zdolność uczestniczenia we wszystkich charakterystycznych dla niej reakcjach chemicznych. Dla grup karboksylowych reakcje te obejmują tworzenie estrów, amidów i bezwodników kwasowych, dla grupy aminowej – acylację, amidację, a dla grup —OH i —SH – utlenianie i estryfikację. Ponieważ najmniejszy z aminokwasów, glicyna, może się „wpasować” w miejsca niedostępne dla innych aminokwasów, często występuje w obszarach, gdzie peptydy ulegają silnemu zwinięciu. Hydrofobowe grupy R alaniny, waliny, leucyny i izoleucyny oraz aromatyczne grupy R fenyloalaniny, tyrozyny i tryptofanu występują głównie wewnątrz białek cytosolowych. Naładowane grupy R aminokwasów zasadowych i kwasowych stabilizują specyficzne konformacje białek przez oddziaływania jonowe, tzw. mostki solne. Wiązania te uczestniczą w układach „przekazywania ładunku” (charge relay) podczas katalizy enzymatycznej i transportu elektronów w łańcuchu oddechowym. Histydyna odgrywa wyjątkową rolę w trakcie katalizy enzymatycznej. Wartość pKa grupy imidazolowej pozwala jej działać w obojętnym pH jako katalizator zasadowy lub kwasowy bez potrzeby jakiejkolwiek zmiany wywołanej przez środowisko. Pierwszorzędowa grupa tiolowa (—SH) cysteiny, której pKa wynosi 8,3, jest doskonałym czynnikiem nukleofilowym i pełni taką funkcję podczas katalizy enzymatycznej. Wartość pK₃ selenocysteiny, 5,2, jest o trzy jednostki mniejsza niż cysteiny, w związku z tym w kwaśnym środowisku jest lepszym czynnikiem nukleofilowym. Pierwszorzędowa grupa alkoholowa seryny funkcjonuje jako czynnik nukleofilowy centrum aktywnego trypsyny i innych proteaz serynowych. Drugorzędowa grupa alkoholowa treoniny jednak, choć jest dobrym czynnikiem nukleofilowym, nie pełni analogicznej funkcji katalitycznej. Grupy –OH seryny, tyrozyny i treoniny często służą jako miejsce kowalencyjnego przyłączenia reszt fosforanowych, które regulują funkcje białek (zob. rozdz. 9).

Sekwencja aminokwasowa określa strukturę pierwszorzędową

Aminokwasy są ze sobą połączone wiązaniami peptydowymi.

Liczba i kolejność wszystkich reszt aminokwasowych w polipeptydzie określają jego strukturę pierwszorzędową. Jednostki aminokwasów występujące w peptydach nazywa się resztami aminokwasowymi i podaje ich nazwy, zamieniając końcówkę nazwy wolnego aminokwasu -yna (-ina) na -yl (np. alanyl, aspartyl, tyrozyl). Nadając nazwy peptydom, traktuje się je jako pochodne C-końcowej reszty aminoacylowej. Na przykład Lys-Leu-Tyr-Gln nosi nazwę lizylo-leucylo-tyrozylo-glutamina. Końcówka -ina glutaminy wskazuje, że α-karboksylowa grupa tego aminokwasu nie jest zaangażowana w tworzenie wiązania peptydowego. Trójliterowe symbole połączone prostymi kreskami przedstawiają jasno strukturę pierwszorzędową peptydu. Kreski te pomija się w symbolach jednoliterowych:

Przedrostki, takie jak tri- i okta-, oznaczają peptydy zbudowane, odpowiednio, z trzech i ośmiu reszt aminokwasowych, a nie te z trzema czy ośmioma wiązaniami peptydowymi. Umownie peptydy zapisuje się w taki sposób, że ich wolna grupa α-aminowa znajduje się po lewej stronie. Ten system przyjęto, zanim odkryto, że synteza peptydów in vivo przebiega od końcowej grupy aminowej.

Wzory peptydów można przedstawić w prosty sposób

Aby przedstawić strukturę peptydu, najpierw rysuje się jego główny łańcuch – szkielet – jako zygzak. Następnie dodaje się kolejno atomy łańcucha głównego, które pojawiają się w powtarzającej się sekwencji: atom azotu α, atom węgla α, atom węgla grupy karbonylowej. Potem dopisuje się atomy wodoru do każdego atomu węgla α i do każdego atomu azotu tworzącego wiązanie peptydowe oraz atom tlenu grupy karbonylowej. Na końcu dodaje się właściwe grupy R (obszar zaciemniony) do każdego atomu węgla α:

Niektóre peptydy zawierają nietypowe aminokwasy

U ssaków hormony peptydowe zwykle zawierają tylko 20 kodowanych, białkowych α-aminokwasów połączonych standardowymi wiązaniami peptydowymi. Niektóre peptydy mogą jednak zawierać niebiałkowe aminokwasy, ich pochodne lub aminokwasy połączone nietypowym wiązaniem peptydowym. Na przykład N-końcowy kwas glutaminowy glutationu, uczestniczącego w fałdowaniu białek i w metabolizmie ksenobiotyków (zob. rozdz. 47), nie wiąże się z cysteiną wiązaniem α-peptydowym, lecz wykorzystującym grupę karboksylową łańcucha bocznego (ryc. 3-7). N-końcowa reszta kwasu glutaminowego – hormonu uwalniającego tyreotropinę (thyrotropin releasing hormone, TRH) – ulega cyklizacji do reszty kwasu piroglutaminowego, a grupa karboksylowa C-końcowej reszty proliny ulega amidacji. Antybiotyki tyrocydyna i gramicydyna S są cyklicznymi peptydami, które zawierają D-fenyloalaninę i ornitynę. Siedmiopeptydowe opiaty – dermorfina i deltoforyna, występujące w skórze południowoamerykańskich żab drzewnych, zawierają D-tyrozynę i D-alaninę.

Rycina 3-7. Glutation (γ-glutamylocysteinyloglicyna). Glu i Cys łączy nie-α-peptydowe wiązanie.

Wiązania peptydowe mają częściowo charakter wiązania podwójnego

Chociaż we wzorach strukturalnych peptydów występuje pojedyncze wiązanie między atomem węgla α grupy karboksylowej i atomem azotu α, w rzeczywistości to wiązanie ma częściowo charakter podwójnego wiązania:

Brak tutaj swobody rotacji wokół wiązania, które łączy atom węgla grupy karbonylowej i atom azotu wiązania peptydowego, bo wymagałoby to rozerwania częściowo podwójnego wiązania. Wskutek tego wszystkie cztery atomy (O, C, N, i H) wiązania peptydowego są koplanarne. Wymuszone usztywnienie wiązania peptydowego ma poważny wpływ na uporządkowanie struktur wyższego rzędu białek. Kółka z brązowymi strzałkami oznaczają wiązania pozwalające na swobodną rotację pozostałych wiązań szkieletu polipeptydowego (ryc. 3-8).

Rycina 3-8. Wymiary w pełni rozciągniętego łańcucha polipeptydowego. Cztery atomy wiązania peptydowego są kopolarne. Rotacja swobodna zachodzi wokół wiązań łączących atom węgla α z atomem azotu α i atomem węgla grupy karbonylowej (brązowe strzałki). Rozciągnięty łańcuch polipeptydowy stanowi więc strukturę półsztywną, w której ²/₃ atomów jego szkieletu jest utrzymywanych w stałych wzajemnych powiązaniach płaszczyznowych. Odległość między przyległymi atomami węgla a wynosi 0,36 nm (3,6 Å). Podano również odległości międzyatomowe i kąty między wiązaniami, które nie są równoważne.

Źródło: opracowano na podstawie L. Pauling, L.P. Corey, H.R. Branson, Two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1951; 37(4): 205–211.

Konformacje peptydów są wymuszane przez siły niekowalencyjne

Fałdowanie łańcucha peptydowego prawdopodobnie przebiega jednocześnie z jego biosyntezą (zob. rozdz. 37). Dojrzała, fizjologicznie aktywna konformacja peptydu odzwierciedla łączny udział sekwencji aminokwasowej, oddziaływań niekowalencyjnych (np. wiązania wodorowe, oddziaływania hydrofobowe) i zmniejszenie przeszkody sterycznej między resztami aminokwasowymi. Na ogół konformacje zawierają prawoskrętne α-helisy i struktury β-kartki (zob. rozdz. 5).

Peptydy są polielektrolitami

Wiązanie peptydowe nie ma ładunku w żadnym środowisku odpowiadającym fizjologicznemu pH. Powstawaniu peptydów z aminokwasów towarzyszy utrata jednego ładunku dodatniego i jednego ujemnego na jedno tworzone wiązanie peptydowe. Peptydy w fizjologicznym pH są jednak obdarzone ładunkiem elektrycznym dzięki ładunkom ich końcowych grup – karboksylowej i aminowej, oraz kwaśnych i zasadowych grup R, jeżeli takie występują. Podobnie jak w przypadku aminokwasów wypadkowy ładunek (netto) peptydu zależy od pH otaczającego go środowiska i od wartości pKa jego dysocjujących grup.

STRESZCZENIE

• Białka są syntetyzowane wyłącznie z L-α-aminokwasów, jednak w przyrodzie występują D-aminokwasy oraz aminokwasy z grupą nie-α-aminową. D-aminokwasy pełnią funkcje metaboliczne, nie tylko u bakterii, lecz także u ludzi.

• Poza biosyntezą białek L-α-aminokwasy pełnią inne istotne metaboliczne funkcje, np. w biosyntezie mocznika, hemu, kwasów nukleinowych oraz hormonów, takich jak epinefryna, i neurotransmiterów, takich jak DOPA.

• Obecność w meteorytach śladowych ilości wielu aminokwasów białkowych uwiarygodnia hipotezę, że uderzenia asteroidów mogły się przyczynić do powstania życia na Ziemi.

• Niektóre L-α-aminokwasy występujące w roślinach i nasionach roślin mogą wykazywać szkodliwy wpływ na zdrowie ludzi, wywołując np. latyryzm.

• Grupy R aminokwasów określają ich specyficzne funkcje biochemiczne. Właściwości grup R stały się podstawą klasyfikacji aminokwasów na zasadowe, kwasowe, aromatyczne, alifatyczne i zawierające siarkę.

• Charakter częściowo podwójnego wiązania łączącego atom węgla grupy karbonylowej i atom azotu peptydu powoduje koplanarność czterech atomów wiązania peptydowego i ogranicza liczbę możliwych konformacji peptydu.

• O nazwie peptydów decyduje liczba występujących w nich aminokwasów oraz fakt, że są one pochodnymi C-końcowych reszt aminokwasowych. Strukturę pierwszorzędową peptydu stanowi jego sekwencja aminokwasowa, rozpoczynająca się od N-końcowego aminokwasu. Jest to kierunek, w którym białka są syntetyzowane in vivo.

• Wszystkie aminokwasy zawierają przynajmniej dwie słabo kwasowe grupy funkcyjne, R—NH₃⁺ i R—COOH. Część z nich zawiera dodatkowo słabo kwasowe grupy funkcyjne: hydroksyfenylową tyrozyny lub tiolową, guanidynową czy imidazolową, odpowiednio cysteiny, histydyny czy argininy.

• Wartości pKa wszystkich grup funkcyjnych aminokwasów czy peptydów decydują o ich ładunku przy określonym pH. Punkt izoelektryczny, pI, stanowi pH, przy którym aminokwasy nie wykazują ładunku i nie przesuwają się w stałym polu elektrycznym.

• Wartości pKa wolnych aminokwasów mogą w najlepszym wypadku zbliżać się do wartości pKa w białku, które bywają bardzo zróżnicowane, co wynika z wpływu otoczenia tego białka.

PIŚMIENNICTWO

Bender D.A.: Amino Acid Metabolism (wyd. 3). Wiley, 2012.

Diaz-Parga P., Goto J.J., Krishnan V.V.: Chemistry and chemical equilibrium dynamics of BMAA and its carbamate adducts. Neurotox. Res. 2018; 33(1): 76–86.

Koga T., Naraoka H.: A new family of extraterrestrial amino acids in the Murchison meteorite. Sci. Rep. 2017; 7(1): 636.

Osinski G.R., Cockell C.S., Pontefract A. i wsp.: The role of meteorite impacts in the origin of life. Astrobiology 2020; 20(9): 1121–1149.

Seckler J.M., Lewis S.J.: Advances in D-amino acids in neurological research. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21(19): 7325.

Wu G. (red.): Amino Acids in Nutrition and Health. Springer, 2020.

Yoshimura T., Nishikawa T., Homma H. (red.): D-Amino Acids: Physiology, Metabolism, and Application. Springer, 2016.

4

Białka: określanie struktury pierwszorzędowej

Peter J. Kennely, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

CELE

Po zapoznaniu się z treścią tego rozdziału Czytelnik powinien:

• Podać trzy przykłady modyfikacji potranslacyjnych, które powszechnie występują podczas dojrzewania nowo syntetyzowanego polipeptydu.

• Wymienić cztery metody chromatograficzne powszechnie stosowane do izolacji białek z materiałów biologicznych.

• Opisać, jak elektroforeza w żelach poliakryloamidowych może być wykorzystana do określenia czystości białka, jego względnej masy i punktu izoelektrycznego.

• Opisać zasadę, na podstawie której spektrometr kwadropulowy i spektrometr czasu przelotu (TOF) określają masę cząsteczkową.

• Opisać, w jaki sposób dostępność sekwencji genomu ułatwiła określenie struktury pierwszorzędowej białka.

• Wyjaśnić, co oznacza termin „proteom”, i podać przykłady jego potencjalnego znaczenia.

• Opisać zalety i ograniczenia chipów genowych jako narzędzi do monitorowania ekspresji białek.

• Przedstawić trzy strategie wyodrębniania indywidualnych białek i peptydów ze złożonych próbek biologicznych, aby ułatwić ich identyfikację przez spektrometrię mas (MS).

• Skomentować wkład genomiki, algorytmów komputerowych i baz danych do identyfikacji otwartych ramek odczytu (ORF), które kodują dane białka.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Białka pod względem fizycznym i funkcjonalnym są złożonymi makrocząsteczkami, które pełnią wiele nadzwyczaj ważnych funkcji. Na przykład wewnętrzna sieć białek tworząca cytoszkielet (zob. rozdz. 51) utrzymuje kształt i integralność fizyczną komórki. Filamenty aktyny i miozyny tworzą aparat kurczliwy mięśni (zob. rozdz. 51). Hemoglobina transportuje tlen (zob. rozdz. 6), natomiast krążące przeciwciała bronią przed obcymi „napastnikami” (zob. rozdz. 52). Enzymy katalizują reakcje, które wytwarzają energię, syntetyzują i degradują biocząsteczki, replikują i transkrybują geny, przetwarzają mRNA itp. (zob. rozdz. 7). Receptory umożliwiają komórkom reakcję i odpowiedź na różne hormony oraz inne czynniki zewnątrzkomórkowe (zob. rozdz. 41 i 42). Białka ulegają wielu fizycznym i funkcjonalnym przemianom odzwierciedlającym cykl życiowy organizmu, w którym się znajdują. Typowe białko powstaje w procesie translacji (zob. rozdz. 37), dojrzewa w procesach potranslacyjnych, takich jak częściowa proteoliza (zob. rozdz. 9 i 37), oscyluje między stanem aktywnym i spoczynkowym przez oddziaływania z czynnikami regulacyjnymi (zob. rozdz. 9), starzeje się wskutek utleniania, deamidacji itp. (zob. rozdz. 57) oraz po degradacji do aminokwasów składowych (zob. rozdz. 28). Ważnym celem medycyny molekularnej jest identyfikacja biomarkerów, takich jak białka i/lub modyfikacje białek, których obecność, brak lub niedobór związane są z określonymi stanami fizjologicznymi bądź chorobami (ryc. 4-1).

Rycina 4-1. Schemat cyklu życiowego hipotetycznego białka. (1) Jego cykl życia zaczyna się od syntezy na rybosomie łańcucha polipeptydowego, którego sekwencja dyktowana jest przez mRNA. (2) W miarę postępowania syntezy polipeptyd zaczyna się zwijać (tj. fałdować) do swojej natywnej konformacji (kolor niebieski). (3) Zwijaniu mogą towarzyszyć procesy modyfikacji, takie jak proteolityczne odcięcie N-końcowej sekwencji sygnałów (Met-Asp-Phe-Gln-Val) lub tworzenie wiązań disulfidowych (disiarczkowych; S—S). (4) Następne modyfikacje kowalencyjne mogą prowadzić np. do przyłączenia cząsteczki kwasu tłuszczowego w celu (5) przemieszczenia modyfikowanego peptydu do błony komórkowej. (6) Wiązanie efektorów allosterycznych (czerwony okrąg) może powodować przyjęcie konformacji katalitycznie aktywnej. (7) W miarę upływu czasu białka zostają uszkodzone przez atak chemiczny, deamidację lub denaturację i (8) mogą być „znakowane” przez kowalencyjne przyłączenie różnych cząsteczek ubikwityny (Ub). (9) Ubikwitynowane białko następnie jest degradowane do jego składowych aminokwasów, które mogą być wykorzystane do syntezy nowych białek.

BIAŁKA I PEPTYDY MUSZĄ ZOSTAĆ OCZYSZCZONE PRZED ANALIZĄ

Chociaż pojawiły się nowe techniki umożliwiające badanie niektórych białek w żywej komórce, generalnie pozyskanie wysoko oczyszczonego białka pozostaje niezbędne do szczegółowego zbadania jego właściwości fizycznych i funkcjonalnych. Wyizolowanie konkretnego białka ze źródła naturalnego w ilościach wystarczających do analizy stanowi ogromne wyzwanie, ponieważ organizmy żywe zawierają tysiące różnych białek, z których każde występuje w bardzo zróżnicowanych ilościach. Zatem uzyskanie czystego białka może wymagać sukcesywnego zastosowania wielu technik separacyjnych. Selektywna precypitacja wykorzystuje różnice we względnej rozpuszczalności poszczególnych białek przy różnych wartościach pH (strącanie izoelektryczne), polarności (strącanie acetonem lub etanolem) oraz stężenia soli (wysalanie siarczanem amonu). Techniki chromatograficzne oddzielają jedno białko od innego na podstawie różnicy rozmiarów ich cząsteczek (chromatografia wykluczania), ładunków (chromatografia jonowymienna), hydrofobowości (chromatografia oddziaływań hydrofobowych) lub zdolności do wiązania specyficznego ligandu (chromatografia powinowactwa).

Chromatografia kolumnowa

W chromatografii kolumnowej faza stacjonarna składa się z małych kulistych ziaren upakowanych w cylindryczny szklany, plastikowy lub stalowy pojemnik nazywany kolumną. Przepuszczalna dla cieczy struktura utrzymuje kuleczki w tej przestrzeni, jednocześnie umożliwiając przepływ ruchomej fazy ciekłej lub jej przesączanie przez kolumnę.

Ziarna fazy stacjonarnej mogą być modyfikowane chemicznie, żeby na ich powierzchni znalazły się grupy kwaśne, zasadowe, hydrofobowe lub ligandy, których oddziaływania hydrofobowe bądź powinowactwa, są wykorzystywane w chromatografii jonowymiennej. Gdy faza mobilna pojawia się u wylotu kolumny, jest automatycznie zbierana w serię małych porcji nazywanych frakcjami. Na rycinie 4-2 przedstawiono podstawowy układ prostego systemu chromatograficznego.

Rycina 4-2. Elementy typowego aparatu do chromatografii ciekłej. Przedstawiono kluczowe elementy programowalnego systemu chromatografii cieczowej, składającego się z: A – zbiorników cieczy fazy ruchomej (żółty, jasnoniebieski); B – pomp sterowanych mikroprocesorem (fioletowy); C – komory mieszania (czerwony); D – portu iniekcyjnego do wprowadzania analitu (ciemnoniebieski); E – szklanej, metalowej lub plastikowej kolumny zawierającej matrycę fazy stacjonarnej (szary); F – detektora spektrofotometrycznego, fluorymetrycznego, refrakcyjnego lub elektrochemicznego (pomarańczowy); G – kolektora frakcji, do zbierania części, zwanych frakcjami, eluentu (zielony) w szeregu oddzielnych probówek, fiolek lub studzienek na płytce mikrotitracyjnej. Mikroprocesor można zaprogramować tak, aby pompował ciecz tylko z jednego zbiornika (elucja izokratyczna), przełączał zbiorniki w określonym z góry punkcie w celu wygenerowania gradientu schodkowego albo mieszał ciecze z dwóch zbiorników w proporcjach zmieniających się w czasie, generując gradient wielostopniowy lub ciągły.

HPLC – wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa

Matryce kolumn chromatograficznych pierwszej generacji składały się z długich, splecionych polimerów oligosacharydów uformowanych w kuliste ziarna, o średnicy w przybliżeniu dziesiątych części milimetra. Niestety ich względnie duży rozmiar zaburzał przepływ fazy ruchomej. Teoretycznie rozdzielczość można było zwiększyć poprzez zmniejszenie rozmiaru cząstek. Wyższe ciśnienia wymagane do pokonania zwiększonego oporu gęściej upakowanej matrycy miażdżyły jednak miękkie i gąbczaste perełki polisacharydowe, a później poliakrylamidowe. Ostatecznie pojawiły się małe, kuliste cząsteczki krzemu, które były fizycznie wytrzymałe i porowate, o dużej powierzchni do przyłączania różnych grup chemicznych. Cząsteczki te umieszczano następnie w kolumnach ze stali nierdzewnej, wytrzymujących wysokie ciśnienia niezbędne do przepchnięcia cieczy przez bardziej zwężone kanały utworzone przez mniejsze, gęsto upakowane peletki. Duża powierzchnia i większa jednorodność tych kulek krzemionkowych zapewniają systemom chromatografii cieczowej wysokociśnieniowej (high-performance liquid chromatography, HPLC) zdolność rozdzielczą o rzędy wielkości wyższą niż w przypadku niegdyś znanych szklanych kolumn i ich matryc polisacharydowych.

Filtracja żelowa

Chromatografia wykluczenia (size exclusion chromatography), czyli filtracja żelowa (gel filtration), służy do rozdzielania cząsteczek na podstawie ich promieni Stokesa, tj. efektywnych promieni kul, za które można uznać cząsteczki białka migrujące w roztworze. Promień Stokesa jest funkcją masy cząsteczkowej oraz kształtu cząsteczki. Podczas szybkiego opadania wydłużone białko efektywnie zajmuje, niczym wirujące śmigło, większą objętość efektywną niż białko globularne o tej samej masie. Chromatografia wykluczania wykorzystuje porowate kulki (ryc. 4-3), których otwory są analogiczne do wgłębień w brzegu rzeki. Jeśli obiekt dryfujący w dół rzeki wpadnie w takie wgłębienie, jego ruch jest hamowany, aż do momentu, gdy powróci do nurtu. Podobnie białka o promieniach Stokesa zbyt dużych, aby wejść w pory (białka wykluczone – excluded proteins), pozostają w głównym strumieniu fazy ruchomej i wyłaniają się przed białkami zdolnymi do przedostania się do niektórych lub wszystkich porów, gdzie ich ruch jest opóźniony. Ułamek porów dostępnych dla danego białka, a tym samym stopień opóźnienia jego ruchu, rośnie wraz ze zmniejszaniem się jego rozmiaru. Białka wyłaniają się zatem z kolumny filtracji żelowej w kolejności malejącej, zgodnie z ich promieniami Stokesa.

Rycina 4-3. Chromatografia wykluczenia (filtracja żelowa). (A) Mieszaninę dużych cząsteczek (brązowy) i małych cząsteczek (czerwony) nanosi się na szczyt kolumny filtracyjnej. (B) Po wejściu do kolumny małe cząsteczki wnikają w pory w matrycy fazy stacjonarnej (szary). W miarę jak faza ruchoma (niebieska) spływa w dół kolumny, pozostają one w tyle za dużymi cząsteczkami, które są wykluczane.

Chromatografia jonowymienna

W chromatografii jonowymiennej białka oddziałują z fazą stacjonarną poprzez oddziaływania typu ładunek–ładunek. Białka o dodatnim ładunku netto przy danym pH będą się wiązać z kuleczkami zawierającymi ujemnie naładowane grupy funkcyjne, takie jak karboksylany lub siarczany (wymieniacze kationowe). Z kolei białka o ujemnym ładunku netto będą się wiązać z kuleczkami zawierającymi dodatnio naładowane grupy funkcyjne, zazwyczaj trzeciorzędowe lub czwartorzędowe aminy (wymieniacze anionowe). Niezwiązane białka przepływają przez kolumnę i są wypłukiwane. Związane białka można selektywnie eluować przez stopniowe zwiększanie siły jonowej fazy ruchomej, co osłabia oddziaływania elektrostatyczne. Proces oczyszczania można zoptymalizować, manipulując pH fazy ruchomej, które wpływa na wielkość, a nawet znak ładunku netto poszczególnych składników mieszaniny białek.

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych służy do rozdzielania białek na podstawie ich różnej tendencji do asocjacji z fazą stacjonarną z grupami hydrofobowymi (np. fenylosefaroza, oktylosefaroza). Białka, które eksponują swoje powierzchnie hydrofobowe, przylegają do złoża dzięki oddziaływaniom hydrofobowym, które są wzmacniane przez ruchomą fazę ciekłą o wysokiej sile jonowej. Gdy białka niezwiązane zostaną wypłukane, zmniejsza się polarność fazy ruchomej przez stopniowe obniżanie stężenia soli. Jeśli oddziaływania białka z fazą stacjonarną są szczególnie silne, do fazy ruchomej może być dodany etanol lub glicerol, aby dalej obniżyć jej polarność i osłabić oddziaływania hydrofobowe z fazą stacjonarną.

Chromatografia powinowactwa

Chromatografia powinowactwa wykorzystuje wysoką selektywność, jaką enzymy i inne białka wykazują wobec ligandów, takich jak substraty, produkty, kofaktory, inhibitory lub ich analogi. Teoretycznie, po nałożeniu mieszaniny białek na matrycę ze związanym kowalencyjnie określonym ligandem, wiązaniu ulegają jedynie te białka, które specyficznie rozpoznają dany ligand. Związane białka są następnie eluowane – albo w wyniku konkurencji z wolnym, rozpuszczalnym ligandem, albo, mniej selektywnie, poprzez zakłócenie interakcji białko–ligand za pomocą wysokich stężeń soli lub innych czynników. Rekombinowane białka są często oczyszczane dzięki fuzji ich genu z dodatkowym segmentem DNA, kodującym wygodną domenę wiążącą ligand (zob. rozdz. 7).

Czystość białka jest określana za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym

Najpowszechniej stosowaną metodą określania składu białkowego próbki jest SDS-PAGE – elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) w obecności detergentu anionowego – dodecylosiarczanu sodu (sodium dodecyl sulfate, SDS). Elektroforeza rozdziela naładowane biocząsteczki na podstawie szybkości ich migracji przez porowatą matrycę w przyłożonym polu elektrycznym. W przypadku SDS-PAGE białka migrują jako kompleksy SDS-polipeptyd przez matrycę poliakrylamidową. Wiązanie SDS powoduje, że większość polipeptydów ulega rozfałdowaniu lub denaturacji. W połączeniu z 2-merkaptoetanolem lub ditiotreitolem w celu redukcji i rozerwania wiązań disiarczkowych (ryc. 4-4) SDS-PAGE rozdziela polipeptydy składowe białek multimerycznych. Średnio, każdy kompleks SDS–polipeptyd zawiera jedną cząsteczkę SDS na każde dwa wiązania peptydowe. Duża liczba anionowych cząsteczek SDS, z których każda ma ładunek –1, przytłacza wkład ładunku grup funkcyjnych aminokwasów endogennych dla typowego polipeptydu, co sprawia, że stosunek ładunku do masy każdego kompleksu SDS–polipeptyd jest w przybliżeniu równy. W tych okolicznościach im większy polipeptyd, tym większy opór fizyczny napotyka jego kompleks SDS–polipeptyd podczas przemieszczania się przez matrycę akrylamidową. W konsekwencji SDS-PAGE rozdziela większość polipeptydów na podstawie ich względnej masy cząsteczkowej (Mr). Po zakończeniu poszczególne polipeptydy uwięzione w żelu poliakrylamidowym są uwidocznione poprzez barwienie barwnikami takimi jak błękit Coomassie (ryc. 4-5).

Rycina 4-4. Oksydacyjne rozszczepienie przyległych łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami disiarczkowymi (pole niebieskie) za pomocą kwasu nadmrówkowego (lewa strzałka) bądź redukujące rozszczepienie za pomocą 2-merkaptoetanolu (prawa strzałka), prowadzi do utworzenia dwóch peptydów – odpowiednio – z resztą kwasu cysteinowego lub resztą cysteinylową.

Rycina 4-5. Zastosowanie elektroforezy SDS-PAGE do obserwacji sukcesywnego oczyszczania białka. Żel został zabarwiony błękitem Coomassie. Pokazano białkowy wzorzec masy o zaznaczonej masie w kDa (S), surowy ekstrakt komórkowy (E), frakcję cytozolową (C), supernatant po odwirowaniu przy wysokiej liczbie obrotów (H) oraz frakcję oczyszczoną za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE-Sefarozy (D). Oczyszczone białko charakteryzuje się masą cząsteczkową około 45 kDa.

Rycina 4-6. Elektroforeza dwukierunkowa łącząca ogniskowanie izoelektryczne z elektroforezą SDS-PAGE. Żel został wybarwiony błękitem Coomassie. Surowy ekstrakt bakteryjny poddano najpierw ogniskowaniu izoelektrycznemu (IEF) w zakresie gradientu pH 3–10. Żel IEF umieszczono następnie poziomo nad żelem zawierającym SDS, po czym przeprowadzono rozdział białek za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Można zauważyć znaczną poprawę rozdzielczości różnych polipeptydów w porównaniu ze zwykłym żelem SDS-PAGE (zob. ryc. 4-5).

Ogniskowanie izoelektryczne

Bufory jonowe, zwane amfolitami, poddane działaniu pola elektrycznego, powodują wytworzenie gradientu pH w żelu. Nałożone na taki żel białka migrują do chwili, kiedy znajdą się w miejscu o pH równym wartości punktu izoelektrycznego (pI), tj. pH, przy jakim całkowity ładunek białka jest równy zeru. Ogniskowanie izoelektryczne (isoelectric focusing, IEF) często jest stosowane razem z elektroforezą SDS-PAGE w elektroforezie dwukierunkowej, którą rozdziela się peptydy na podstawie ich punktów izoelektrycznych w jednym kierunku oraz ich mas cząsteczkowych w drugim kierunku (ryc. 4-6). Elektroforeza dwukierunkowa stanowi szczególnie odpowiednią metodę rozdziału złożonych mieszanin białek.

SANGER JAKO PIERWSZY OKREŚLIŁ SEKWENCJĘ POLIPEPTYDU

Chociaż naukowcy uznali, że określenie składu aminokwasowego oczyszczonych białek jest stosunkowo proste, to określenie proporcji każdego rodzaju aminokwasów w polipeptydzie, a także ustalenie kolejności lub sekwencji aminokwasów, okazało się trudne. Pierwszym białkiem, którego sekwencję ustalono, był hormon peptydowy insulina, to osiągnięcie przyniosło Frederickowi Sangerowi Nagrodę Nobla w 1958 roku. Dojrzała insulina składa się z 21-resztowego łańcucha A i 30-resztowego łańcucha B, połączonych wiązaniami disiarczkowymi. Sanger zredukował wiązania disiarczkowe (zob. ryc. 4-4), rozdzielił łańcuchy A i B oraz rozszczepił każdy łańcuch na coraz mniejsze peptydy za pomocą enzymów proteolitycznych trypsyny, chymotrypsyny i pepsyny, a następnie inkubował z kwasem solnym. Każdy peptyd w mieszaninie został wyizolowany, potraktowany 1-fluoro-2,4-dinitrobenzenem (odczynnikiem Sangera) i określono jego skład aminokwasowy. Odczynnik Sangera reaguje z odsłoniętymi grupami α-aminowymi reszt aminokońcowych, umożliwiając identyfikację aminokwasu aminokońcowego każdego peptydu. Grupa ε-aminowa lizyny również reaguje z odczynnikiem Sangera; ale ponieważ lizyna aminokońcowa reaguje z dwiema cząsteczkami odczynnika Sangera, można ją łatwo odróżnić od lizyny z wnętrza peptydu. Pracując od di- i tripeptydów aż do coraz większych fragmentów, Sanger był w stanie zrekonstruować pełną sekwencję insuliny. Później opracował on metodę dideoksy do sekwencjonowania DNA, za co otrzymał drugą Nagrodę Nobla w 1980 roku.

EDMAN OPRACOWAŁ PIERWSZĄ PRAKTYCZNĄ METODĘ SEKWENCJONOWANIA PEPTYDÓW

Pracochłonne podejście Sangera sprawiło, że jego zastosowanie do jakichkolwiek polipeptydów poza najmniejszymi było niezwykle trudne. Pehr Edman odkrył odczynnik, izotiocyjanian fenylu (odczynnik Edmana), który nie tylko mógł selektywnie znakować resztę aminową peptydu jako pochodną fenylotiohydantoiny (PTH), ale – w przeciwieństwie do odczynnika Sangera – umożliwiał usunięcie pochodnej PTH w łagodnych warunkach (ryc. 4-7). Nową resztę aminową można było następnie potraktować odczynnikiem Edmana i powtórzyć proces, aby umożliwić derywatyzację każdej kolejnej reszty w peptydzie.

Rycina 4-7. Reakcja Edmana. Fenyloizotiocyjanian przeprowadza N-końcową resztę peptydu w pochodną fenylotiohydantoinową. Po dodaniu kwasu w rozpuszczalnikach niehydroksylowych uwalnia się pochodna fenylotiohydantoinowa aminokwasu, którą z kolei identyfikuje się na podstawie jej ruchliwości chromatograficznej; peptyd staje się krótszy o jedną resztę aminokwasową. Proces jest następnie powtarzany.

Chociaż teoretycznie można by określić całą sekwencję polipeptydu za pomocą odczynnika Edmana, heterogeniczne właściwości chemiczne aminokwasów oznaczały, że każdy etap procedury stanowił kompromis między wydajnością dla dowolnego konkretnego aminokwasu lub zestawu aminokwasów a elastycznością potrzebną do uwzględnienia wszystkich dwudziestu. W konsekwencji każdy etap procesu działa z wydajnością mniejszą niż 100%, co prowadzi do akumulacji fragmentów polipeptydu o różnych N-końcach, to zaś ostatecznie uniemożliwia odróżnienie prawidłowego aminokwasu PTH dla danej pozycji peptydu od zanieczyszczeń poza fazą. W rezultacie długość odczytu dla sekwencjonowania Edmana waha się od 5 do 30 reszt aminokwasowych w zależności od ilości i czystości peptydu, co jest wartością ledwie wystarczającą do określenia sekwencji typowego białka. Aby określić pełną sekwencję polipeptydu o długości kilkuset reszt, białko musiało zostać pocięte na mniejsze peptydy. Następnie oczyszczono je i przeanalizowano metodą sekwencjonowania Edmana. Uzyskano w ten sposób wiele segmentów sekwencji, których położenie w białku, z wyjątkiem końca aminowego, było nieznane. Aby złożyć te krótkie sekwencje peptydowe w pełną sekwencję nienaruszonego polipeptydu, konieczne było wygenerowanie i przeanalizowanie dodatkowych peptydów w poszukiwaniu takich, których sekwencje nakładały się na siebie, umożliwiając w ten sposób połączenie większych segmentów sekwencji.

Chociaż rozwój zautomatyzowanych sekwencerów Edmana i zaawansowanych systemów HPLC do oczyszczania peptydów często sprawiał, że początkowe pozyskanie fragmentarycznej lub częściowej sekwencji było stosunkowo szybkie, znalezienie wystarczającej liczby „nakładających się” peptydów do rekonstrukcji pełnej sekwencji typowego białka za pomocą techniki Edmana wymagało zazwyczaj dużych ilości oczyszczonego białka i, co ważniejsze, kilku miesięcy lub lat dodatkowej pracy. W związku z tym ustalenie pełnej sekwencji aminokwasowej za pomocą metody Edmana było zazwyczaj ograniczone do białek o dużej liczebności i łatwych do oczyszczenia.

BIOLOGIA MOLEKULARNA ZREWOLUCJONIZOWAŁA OKREŚLANIE STRUKTURY PIERWSZORZĘDOWEJ

Sekwencja każdego białka w organizmie jest zakodowana w jego materiale genetycznym (genomie). Biologia molekularna zrewolucjonizowała analizę sekwencji aminokwasów, umożliwiając naukowcom odczytanie sekwencji białek bezpośrednio z odpowiadających im genów. Istniały ku temu dwa główne powody.

Po pierwsze, techniki rekombinacyjne pozwalają na amplifikację praktycznie nieograniczonej liczby kopii DNA, nawet z niewielkiej ilości materiału wyjściowego (zob. rozdz. 39), niezależnie od naturalnej obfitości lub możliwości oczyszczenia kodowanego białka. Po drugie, sekwencjonowanie DNA jest znacznie bardziej wydajne niż metoda Edmana – automatyczne sekwencery rutynowo odczytują fragmenty DNA o długości tysięcy nukleotydów. W konsekwencji, jeśli udało się określić choćby fragment sekwencji badanego polipeptydu metodą Edmana, możliwe było zaprojektowanie komplementarnej sondy oligonukleotydowej. Pozwalało to na identyfikację klonu DNA zawierającego gen kodujący dane białko. W efekcie opracowano podejście hybrydowe: częściową sekwencję aminokwasową uzyskiwano chemicznie, a następnie wykorzystywano ją do wyznaczenia pełnej sekwencji białka metodą klonowania i sekwencjonowania DNA.

GENOMIKA UMOŻLIWIA IDENTYFIKACJĘ BIAŁEK Z NIEWIELKIEJ ILOŚCI DANYCH DOTYCZĄCYCH SEKWENCJI

Obecnie pełną sekwencję DNA genomów określono już dla setek tysięcy organizmów. W związku z tym dla większości naukowców sekwencja genetyczna kodująca białko lub białka, które są przedmiotem ich badań, została już ustalona i znajduje się w dostępnych bazach danych, takich jak GenBank. Aby jednoznacznie zidentyfikować sekwencję aminokwasową białka, często wystarcza analiza zaledwie pięciu do sześciu kolejnych reszt aminokwasowych. Współcześnie spektrometria mas (mass spectrometry, MS), dzięki swojej wysokiej czułości i precyzji, w dużej mierze zastąpiła klasyczną metodę Edmana jako preferowana technika identyfikacji białek.

SPEKTROMETRIA MAS WYKRYWA MODYFIKACJE KOWALENCYJNE

Rozwój metod spektrometrii masowej (MS), które oferują wyższą czułość, szybkość i zdolność wykrywania modyfikacji potranslacyjnych (tab. 4-1), doprowadził do zastąpienia przez nią techniki Edmana jako metody z wyboru w identyfikacji białek.

Tabela 4-1. Przyrosty masy cząsteczkowej odpowiadające różnym modyfikacjom potranslacyjnym

Modyfikacja

Wzrost masy (Da)

Fosforylacja

80

Hydroksylacja

16

Metylacja

14

Acetylacja

42

Mirystylacja

210

Palmitoilacja

238

Glikozylacja

162

SPEKTROMETRY MAS MAJĄ RÓŻNE KONFIGURACJE

W prostym, pojedynczym kwadropulowym spektrometrze mas próbkę umieszcza się w próżni i umożliwia jej odparowanie w obecności donora protonów nadającego jej ładunek dodatni. Pole elektryczne napędza następnie kationy w kierunku zakrzywionej rury przelotu, gdzie spotykają się one z polem magnetycznym, które rozprasza je pod kątem odpowiednim do ich pierwotnego kierunku lotu (ryc. 4-8). Natężenie prądu zasilającego elektromagnes jest stopniowo zwiększane, aż ścieżka każdego jonu zostanie wystarczająco zakrzywiona, tak aby uderzyć w detektor zamontowany na końcu rury przelotowej. W przypadku jonów o identycznym ładunku siła niezbędna do zakrzywienia ścieżki do tego samego stopnia jest proporcjonalna do ich masy.

Rycina 4-8. Podstawowe elementy prostego spektrometru mas. Mieszanina cząsteczek przedstawionych jako okrąg, trójkąt i kwadrat przeprowadzana jest w komorze próbki w fazę gazową w stanie zjonizowanym. Cząsteczki te następnie przyspieszane są wewnątrz rury przelotu przez pole elektryczne przyłożone do siatki akceleratora. Elektromagnesem reguluje się siłę przykładanego pola magnetycznego, które odchyla kierunek lotu indywidualnych jonów, aż uderzą one w detektor. Im większa masa jonu, tym silniejsze pole magnetyczne konieczne jest do jego zogniskowania na detektorze.

Spektrometr czasu przelotu (time of flight, TOF) wykorzystuje liniową drogę przelotu. Po odparowaniu próbki w obecności donora protonów przykładane jest na krótko pole elektryczne w celu przyspieszenia przelotu jonów w kierunku detektora na końcu rury. Dla cząsteczek o identycznym ładunku szybkość, do której są one rozpędzane, i czas potrzebny do osiągnięcia detektora są odwrotnie proporcjonalne do ich mas. Na ogół kwadropulowe spektrometry mas są wykorzystywane do określania mas cząsteczek poniżej 4000 Da, podczas gdy spektrometry czasu przelotu używa się do określania dużych mas kompletnych białek. Różne kombinacje wielu kwadrupoli lub powrotne odbicie jonów wewnątrz rury przelotu spektrometru mas TOF są stosowane do tworzenia bardziej zaawansowanych instrumentów.

PEPTYDY DO ANALIZY MOGĄ BYĆ PRZEPROWADZONE W LOTNĄ FAZĘ JONOWĄ ZA POMOCĄ ELEKTROROZPYLANIA LUB DESORPCJI LASEROWEJ WSPOMAGANEJ MATRYCĄ

Przez wiele lat analiza peptydów i białek metodą spektrometrii mas była utrudniona ze względu na trudności z przeniesieniem tych dużych cząsteczek organicznych do fazy gazowej. Podczas gdy małe związki organiczne można było łatwo odparować przez ogrzewanie w próżni (ryc. 4-9), białka, oligonukleotydy i inne makrocząsteczki ulegały w takich warunkach rozkładowi. Dopiero opracowanie niezawodnych metod ich łagodnej jonizacji umożliwiło zastosowanie MS do analizy strukturalnej i określania sekwencji. Trzy najczęściej wykorzystywane techniki przenoszenia makrocząsteczek do fazy gazowej to: jonizacja przez elektrorozpylanie (electrospray ionization, ESI), desorpcja i jonizacja laserowa wspomagana matrycą (matrix-assisted laser desorption and ionization, MALDI) oraz bombardowanie szybkimi atomami (fast atom bombardement, FAB).

Rycina 4-9. Trzy powszechnie stosowane metody przeprowadzania cząsteczek w fazę gazową w komorze próbki spektrometru mas. MALDI – desorpcja laserowa wspomagana matrycą.

W technice ESI analizowane cząsteczki rozpuszcza się w lotnym rozpuszczalniku i wprowadza do komory jonizacyjnej cienkim strumieniem przez naładowaną sondę kapilarną (zob. ryc. 4-9). Gdy krople cieczy trafiają do komory, rozpuszczalnik szybko odparowuje, a próbka zostaje naładowana i przechodzi do fazy gazowej. Jonizacja ESI jest często stosowana do analizy peptydów i białek eluujących bezpośrednio z kolumny HPLC lub innego układu chromatograficznego. W technice MALDI próbkę miesza się z ciekłą matrycą zawierającą barwnik absorbujący światło i źródło protonów. Po wzbudzeniu mieszanki za pomocą lasera matryca gwałtownie przechodzi do fazy gazowej, co pozwala uniknąć termicznej degradacji analizowanych cząsteczek. W FAB próbkę rozprasza się w glicerolu lub innej matrycy protonowej, a następnie bombarduje strumieniem obojętnych atomów (np. ksenonu) o dużej prędkości. Łagodna jonizacja uzyskana w tym procesie umożliwia analizę nietkniętych makrocząsteczek.

Po jonizacji peptydy mogą być dalej rozbijane na mniejsze fragmenty wskutek zderzeń z atomami helu lub argonu (dysocjacja indukowana zderzeniami – collision-induced dissociation, CID), a ich masy analizowane. Ponieważ wiązania peptydowe są bardziej podatne na rozerwanie niż wiązania węgiel–węgiel, powstające fragmenty różnią się najczęściej o jeden lub dwa aminokwasy. Dzięki temu – z wyjątkiem izomerów, takich jak leucyna/izoleucyna czy glutamina/lizyna – możliwe jest odtworzenie sekwencji aminokwasowej peptydu na podstawie różnic mas jego fragmentów.

Tandemowa spektrometria mas

Złożone mieszaniny peptydów mogą być analizowane bez wcześniejszego oczyszczania za pomocą tandemowej spektrometrii mas, wykorzystującej układ odpowiadający dwóm spektrometrom mas połączonym szeregowo. Z tego powodu analiza przy użyciu tego typu aparatury określana jest często jako MS/MS lub MS².

Pierwszy spektrometr mas oddziela poszczególne peptydy na podstawie różnic w ich masie. Po odpowiednim ustawieniu pola magnetycznego pojedynczy peptyd może zostać skierowany do drugiego spektrometru, gdzie dochodzi do jego fragmentacji i pomiaru mas powstałych jonów. Alternatywnie peptydy mogą być przetrzymywane w pułapce jonowej umieszczonej między dwoma kwadrupolami i selektywnie przekazywane do drugiego kwadrupola, zamiast być odrzucane w momencie, gdy pierwszy kwadrupol ustawiony jest na inne jony.

Tandemowa spektrometria mas znajduje zastosowanie m.in. w przesiewowych badaniach noworodków, pozwalając na oznaczanie stężeń aminokwasów, kwasów tłuszczowych i innych metabolitów w próbkach krwi. Nieprawidłowości w stężeniach tych związków mogą służyć jako wskaźniki diagnostyczne chorób wrodzonych, takich jak fenyloketonuria, encefalopatia etylomalonowa czy kwasica glutarowa typu I. W ostatnich latach opracowano nową generację tandemowych spektrometrów mas, tzw. Q-TOF-MS, które łączą technologię kwadrupolową (Q) z pomiarem czasu przelotu (TOF), wykorzystując zalety obu rozwiązań.

PROTEOMIKA I PROTEOM

Celem proteomiki jest identyfikacja kompletnych zestawów białek wytwarzanych przez komórkę w różnych warunkach

Chociaż sekwencja ludzkiego genomu jest znana, obraz, jaki przedstawia, jest zarówno statyczny, jak i niepełny. W miarę jak geny są aktywowane i wyciszane, a cząsteczki mRNA poddawane alternatywnemu splicingowi (zob. rozdz. 36), zestaw syntetyzowanych białek różni się w zależności od typu komórki, etapu rozwoju lub różnicowania, a także w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Komórki mięśniowe ekspresjonują białka, których nie wytwarzają komórki nerwowe, a skład podjednostek tetrameru hemoglobiny zmienia się przed urodzeniem i po urodzeniu.

Wiele białek ulega potranslacyjnym modyfikacjom, zarówno w trakcie dojrzewania do funkcjonalnie aktywnych form, jak i jako element regulacji ich właściwości. Aby uzyskać pełniejszy i bardziej dynamiczny obraz molekularny organizmu, naukowcy dążą do scharakteryzowania proteomu – czyli zestawu wszystkich białek ekspresjonowanych przez daną komórkę w określonym czasie, wraz z ich ilością i stanem modyfikacji. Ponieważ proteom każdej komórki organizmu jest unikalny i zmienia się w czasie oraz w zależności od warunków, stworzenie kompletnej mapy ludzkiego proteomu stanowi cel o ogromnym zakresie i złożoności.

JEDNOCZESNA ANALIZA SETEK BIAŁEK STANOWI WYZWANIE TECHNICZNE

Kluczowym celem proteomiki jest identyfikacja białek, których poziomy ekspresji lub modyfikacji korelują ze zdarzeniami istotnymi medycznie. Oprócz potencjalnej roli wskaźników diagnostycznych biomarkery białkowe mogą dostarczyć istotnych wskazówek dotyczących przyczyn i mechanizmów określonych stanów fizjologicznych lub chorobowych.

Proteomika pierwszej generacji wykorzystywała elektroforezę SDS-PAGE lub dwuwymiarową elektroforezę żelową (2D-PAGE) do rozdzielania białek w próbce biologicznej, a następnie określania sekwencji aminokwasowej ich końca aminowego metodą Edmana. Tożsamość białek ustalano, przeszukując dostępne bazy danych sekwencji polipeptydowych pod kątem białek zawierających pasującą sekwencję N-końcową, zbliżoną masę cząsteczkową (Mr), a w przypadku żeli 2D – także punkt izoelektryczny (pI). Te wczesne próby były ograniczane przez niewielką liczbę dostępnych sekwencji oraz trudności w izolacji odpowiednich ilości białka z żeli do analizy metodą Edmana. Zwiększanie rozmiarów żeli w celu poprawy rozdzielczości i wydajności przyniosło tylko marginalne korzyści. Przełomem okazał się rozwój spektrometrii mas, który umożliwił oznaczanie sekwencji białek z czułością porównywalną do metod elektroforetycznych. Poznanie sekwencji genomów organizmów znacznie ułatwiło identyfikację białek, dostarczając kompletnych zestawów sekwencji polipeptydowych kodowanych przez DNA. Ponadto dane o sekwencji nukleotydowej umożliwiły tworzenie macierzy genowych (tzw. chipów DNA), zawierających setki różnych sond oligonukleotydowych. Macierze te wykorzystywano do wykrywania obecności mRNA zawierających komplementarne sekwencje. Choć zmiany w ekspresji mRNA nie zawsze przekładają się bezpośrednio na zmiany ilości odpowiadających białek, chipy DNA były mniej wymagające technicznie i bardziej czułe niż klasyczne metody proteomiczne, szczególnie w odniesieniu do białek niskiej obfitości.

Proteomika drugiej generacji połączyła nowoczesne techniki chromatografii nanoskali z MS. Białka w próbce biologicznej są najpierw trawione proteazą do mniejszych peptydów, które następnie rozdzielane są za pomocą chromatografii odwróconej fazy, jonowymiennej lub wykluczania, aby utworzyć mniejsze podzbiory bardziej podatne na analizę. Te podzbiory są analizowane poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie eluatu z kolumny do spektrometru masowego z podwójnym kwadrupolem lub TOF. Technologia MudPIT (multidimensional protein identification technology) wykorzystuje kolejne rundy chromatografii do rozdzielania peptydów złożonej próbki biologicznej na prostsze frakcje, analizowane następnie oddzielnie za pomocą MS.

Współczesne postępy w czułości i wydajności tandemowych spektrometrów mas umożliwiają bezpośrednią analizę złożonych próbek bez wcześniejszego przygotowania (proteolizy czy rozdzielania chromatograficznego). Niebawem możliwa stanie się pełna analiza proteomu pojedynczej komórki.

Bioinformatyka pomaga w ustalaniu funkcji białek

Funkcje ogromnej ilości białek kodowanych przez genom ludzki nie są obecnie znane. Kontynuowane są wysiłki w kierunku rozwijania macierzy białkowych lub chipów celem bezpośredniego testowania potencjalnych funkcji białek na skalę masową. Chociaż niektóre funkcje białek, takie jak aktywność proteaz lub esteraz, są względnie łatwe do oznaczenia, inne o wiele trudniej śledzić. Eksploracja danych (data mining) za pomocą metod bioinformatycznych umożliwia naukowcom porównywanie sekwencji aminokwasowych nieznanych białek z tymi, których funkcje zostały określone. Zapewnia to narzędzia do odkrywania tropów dotyczących potencjalnych właściwości, ról fizjologicznych i mechanizmów działania białek. Algorytmy bioinformatyczne wykorzystują dążenie przyrody do angażowania wariantów motywów strukturalnych do pełnienia podobnych funkcji w kilku białkach (np. domena Rossmanna wiążąca nukleotydy, umożliwiająca także wiązanie NAD(P)H, jądrowe sekwencje kierujące, domeny „rąk EF” wiążące jony Ca²⁺). Domeny te są zazwyczaj wykrywane w strukturze pierwszorzędowej na podstawie obecności poszczególnych reszt aminokwasowych znajdujących się w kluczowych pozycjach. Właściwości i role fizjologiczne nowo odkrytych białek mogą być zatem przewidywane na podstawie porównania ich sekwencji ze strukturą pierwszorzędową białek już znanych.

STRESZCZENIE

• Długie cząsteczki polimerów aminokwasów, czyli polipeptydy, tworzą podstawowe jednostki strukturalne białek, a z kolei struktura białek dostarcza informacji o pełnionej przez nie funkcji.

• Białka podczas swojego życia podlegają zmianom potranslacyjnym, które wpływają na ich funkcje i określają ich losy.

• Dzięki tworzeniu nowego N-końca odczynnik Edmana umożliwił określenie długich odcinków sekwencji aminokwasowych.

• Żel poliakrylamidowy zapewnia porowatą matrycę do separacji białek na podstawie ich ruchliwości w przyłożonym stałym polu elektrycznym.

• Niemal stała proporcja, z którą anionowy detergent SDS wiąże się z białkami, umożliwia elektroforezie SDS-PAGE rozdział polipeptydów, głównie na podstawie ich względnych rozmiarów.

• Ponieważ masa stanowi uniwersalną właściwość wszystkich biocząsteczek i ich pochodnych, spektrometria mas stała się wszechstronną techniką mającą zastosowanie do określania struktury pierwszorzędowej, identyfikacji modyfikacji potranslacyjnych i wykrywania nieprawidłowości metabolicznych.

• Klonowanie DNA sprzężone z chemią białek zapewnia podejście hybrydowe, które ogromnie zwiększyło szybkość i wydajność określania pierwszorzędowej struktury białek.

• Genomika, analiza pełnej sekwencji oligonukleotydowej całego materiału genetycznego organizmu, umożliwia badaczom uzyskanie wzorca każdej makrocząsteczki kodowanej genetycznie.

• Analiza proteomiczna wykorzystuje dane genomiczne w celu identyfikacji całego składu białek w próbce biologicznej na podstawie danych z częściowych sekwencji, otrzymanych w wyniku połączenia metod rozdzielania białek i peptydów oraz sekwencjonowania za pomocą spektrometrii mas.

• Głównym celem proteomiki jest identyfikacja białek i ich modyfikacji potranslacyjnych, których pojawienie się lub znikanie koreluje ze zjawiskami fizjologicznymi, starzeniem się lub specyficznymi chorobami.

• Bioinformatyka odnosi się do rozwoju algorytmów komputerowych zaprojektowanych w celu wnioskowania na temat właściwości funkcjonalnych makrocząsteczek przez porównywanie sekwencji nowych białek z innymi, których właściwości są znane.

PIŚMIENNICTWO

Aslam B., Basit M., Nisar M.A. i wsp.: Proteomics: Technologies and their applications. J. Chromatog. Sci. 2017; 55(2): 182–196.

Biemann K.: Laying the groundwork for proteomics: Mass spectrometry from 1958 to 1988. J. Proteomics 2014; 107: 62–70.

Bonner P.: Protein Purification (wyd. 2), CRC Press, 2019.

Brown K.A., Melby J.A., Roberts D.S., Ge Y.: Top-down proteomics: Challenges, innovations, and applications in basic and clinical research. Exp. Rev. Proteomics 2020; 17(10): 719–733.

Burgess R.R., Deutscher M.P. (red.): Guide to Protein Purification (wyd. 2), Methods Enzymol., t. 463, Elsevier, 2009 (cały tom).

Duarte T.T., Spencer C.T.: Personalized proteomics: The future of precision medicine. Proteomes 2016; 4(4): 29.

Jiang Z., Zhou X., Li R. i wsp.: Whole transcriptome analysis with sequencing: Methods, challenges and potential solutions. Cellular Molec. Life Sci. 2015; 72(18): 3425–3439.

Kelly R.T.: Single-cell proteomics: Progress and prospects. Mol. Cell Proteomics 2020; 19(11): 1739–1748.

Syu G.D., Dunn S., Zhu H.: Developments and applications of functional protein microarrays. Mol. Cell Proteomics 2020; 19(6): 916–927.

Van Riper S.K., de Jong E.P., Carlis J.V. i wsp.: Mass spectrometry-based proteomics: Basic principles and emerging technologies and directions. Adv. Exp. Med. Biol. 2013; 990: 1–35.

Wood D.W.: New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Curr. Opin. Struct. Biol. 2014; 26: 54–61.

5

Białka: struktury wyższego rzędu

Peter J. Kennelly, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

CELE

Po zapoznaniu się z treścią tego rozdziału Czytelnik powinien:

• Wskazać zalety i wady różnych metod klasyfikacji białek.

• Wyjaśnić i zilustrować pierwszorzędową, drugorzędową, trzeciorzędową i czwartorzędową strukturę białek.

• Zidentyfikować główne znane typy struktury drugorzędowej i wyjaśnić znaczenie elementów naddrugorzędowych.

• Opisać rodzaj i względną siłę oddziaływań, które stabilizują każdą strukturę białka poszczególnych rzędów.

• Opisać informacje zawarte na mapie Ramachandrana.

• Podsumować podstawowe zasady działania trzech głównych metod określania struktury białek: krystalografii rentgenowskiej, spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego i kriomikroskopii elektronowej.

• Opisać etapy procesu prowadzącego do przyjęcia przez białka natywnych konformacji.

• Zidentyfikować rolę fizjologiczną w dojrzewaniu białek izomerazy disiarczkowej, izomerazy cis, trans peptydyloprolinowej i białek opiekuńczych.

• Opisać podstawowe techniki biofizyczne stosowane do badania trzeciorzędowej i czwartorzędowej struktury białek.

• Wyjaśnić, w jaki sposób zaburzenia genetyczne i niedobory żywieniowe związane z dojrzewaniem kolagenu odzwierciedla bliski związek między strukturą i funkcją białek.

• Opisać podstawowe zdarzenia leżące u podstaw patologii molekularnej chorób prionowych.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

W przyrodzie funkcja jest ściśle uzależniona od struktury. Aby nowo zsyntezowany polipeptyd dojrzał i stał się biologicznie czynnym białkiem, zdolnym do katalizowania reakcji metabolicznych, uczestniczenia w ruchu komórek, tworzenia wielkocząsteczkowych „prętów” i „kabli”, które zapewniają strukturalną integralność włosów, kości, ścięgien i zębów, musi utworzyć specyficzny, trójwymiarowy układ zwany konformacją. Podczas dojrzewania białko podlega modyfikacjom potranslacyjnym, w wyniku których wprowadzane są nowe grupy chemiczne lub usuwane są przejściowo potrzebne segmenty peptydowe. Wady genetyczne lub niedobory żywieniowe, które hamują dojrzewanie białek, wywierają szkodliwy wpływ na zdrowie. Przykładami tych pierwszych są: choroba Creutzfeldta–Jakoba, scrapie, choroba Alzheimera, gąbczaste zwyrodnienie mózgu u bydła (tzw. choroba szalonych krów). Przykładami następstw niedoborów żywieniowych są: szkorbut (niedobór kwasu askorbinowego) i choroba Menkesa (defekt metabolizmu miedzi). Zarazem jednak wiele leków przeciwwirusowych nowej generacji o bezpośrednim działaniu, stosowanych w leczeniu chorób wirusowych, takich jak wirusowe zapalenie wątroby typu C czy zakażenie HIV (human immunodeficiency virus – ludzki wirus niedoboru odporności), działa poprzez hamowanie aktywności proteaz, glikozydaz i izomerazy cis–trans peptydylowej, które katalizują kluczowe etapy dojrzewania kluczowych białek wirusowych.

KONFORMACJA A KONFIGURACJA

Pojęcia konfiguracji i konformacji są często mylone. Konfiguracja określa geometryczne powiązania między danymi zbiorami atomów, np. tymi, które pozwalają odróżnić formy L- i D-aminokwasów. Wzajemne przekształcenie się obu form konfiguracyjnych wymaga rozerwania wiązań kowalencyjnych oraz ich powtórnego utworzenia. Konformacja odnosi się do przestrzennego układu wszystkich atomów w cząsteczce. Wzajemna przemiana między konformerami zachodzi bez rozrywania wiązań kowalencyjnych, z zachowaniem konfiguracji, i zazwyczaj odbywa się przez rotacje wokół wiązań pojedynczych.

BIAŁKA BYŁY POCZĄTKOWO KLASYFIKOWANE ZE WZGLĘDU NA ICH OGÓLNE WŁAŚCIWOŚCI

Związek między strukturą i funkcją białek był początkowo rozpatrywany przez klasyfikowanie ich pod względem właściwości, takich jak rozpuszczalność, kształt lub obecność grup niebiałkowych. Na przykład białka, które można wyekstrahować z komórek za pomocą wodnego roztworu o fizjologicznej sile jonowej i fizjologicznym pH, są określane jako rozpuszczalne. Ekstrakcja integralnych białek błonowych wymaga z kolei rozpuszczenia błon w roztworze detergentu. Białka globularne są zwartymi, prawie kulistymi cząsteczkami, które wykazują stosunek osiowy (stosunek ich najdłuższego wymiaru do wymiaru najkrótszego) nieprzekraczający 3. Większość enzymów stanowi właśnie białka globularne. Wiele białek strukturalnych przyjmuje natomiast bardzo rozciągnięte konformacje. Są to białka fibrylarne (włókienkowe), które wykazują stosunek osiowy wynoszący około 10 lub większy.

Lipoproteiny zawierają kowalencyjnie związane lipidy, a glikoproteiny – węglowodany. Mioglobina, hemoglobina, cytochromy i wiele innych metaloprotein zawiera silnie związane jony metali. Bardziej precyzyjne sposoby klasyfikacji białek opierają się na podobieństwie, czyli homologii, w sekwencji aminokwasowej i strukturze trójwymiarowej. Wciąż używanych jest jednak wiele terminów z wcześniejszej klasyfikacji.

BIAŁKA SĄ BUDOWANE ZGODNIE Z ZASADAMI MODULARNOŚCI

Białka pełnią złożone funkcje fizyczne i katalityczne przez umiejscowienie specyficznych grup chemicznych w ściśle określonym położeniu przestrzennym. Szkielet polipeptydowy zawierający te grupy musi przyjąć konformację, która jest funkcjonalnie sprawna i trwała fizycznie. Na pierwszy rzut oka biosynteza polipeptydów, obejmująca dziesiątki tysięcy pojedynczych atomów, wydawać się może wyjątkowym wyzwaniem. Kiedy weźmie się pod uwagę to, że typowy polipeptyd może przyjąć ponad 10⁵⁰ różnych konformacji, zwinięcie w konformację specyficzną dla jego biologicznych funkcji wydaje się jeszcze trudniejsze. Jak przedstawiono w rozdziałach 3 i 4, synteza szkieletu polipeptydowego białka angażuje mały zestaw wspólnych bloków budulcowych, tj. aminokwasów połączonych za pośrednictwem jednakowych wiązań, tj. wiązań peptydowych. Modułowa ścieżka syntezy, prowadzona krok po kroku, upraszcza fałdowanie, czyli „zwijanie” i przetwarzanie nowo zsyntezowanego polipeptydu na dojrzałe białko.

CZTERY POZIOMY ORGANIZACJI STRUKTURY BIAŁEK

Modułowa natura syntezy i zwijania łańcuchów peptydowych białek przekłada się na koncepcję czterech poziomów ich struktury. Są nimi: struktura pierwszorzędowa, tj. sekwencja aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym; struktura drugorzędowa, tj. sposób zwinięcia krótkich (od 3 do 30 reszt aminokwasowych) stykających się segmentów polipeptydowych w geometrycznie uporządkowaną jednostkę; struktura trzeciorzędowa, tj. sposób ułożenia jednostek mających strukturę drugorzędową w większe funkcjonalnie segmenty, takie jak dojrzały polipeptyd lub jego składowe domeny; struktura czwartorzędowa, tj. liczba i typy jednostek polipeptydowych budujących białko oligomeryczne oraz ich przestrzenne ułożenie.

STRUKTURA DRUGORZĘDOWA

Wiązania peptydowe ograniczają możliwe konformacje drugorzędowe

Swobodna rotacja jest możliwa jedynie wokół dwóch z trzech wiązań tworzących szkielet polipeptydowy: wiązania łączącego atom węgla α (Cα) z atomem węgla grupy karbonylowej (Co) oraz wiązania między atomem węgla Cα i atomem azotu (zob. ryc. 3-8). Częściowo podwójny charakter wiązania peptydowego łączącego Co z α-azotem wymaga, aby węgiel karbonylowy, tlen karbonylowy i α-azot pozostały współpłaszczyznowe, zapobiegając w ten sposób rotacji. Kąt wokół wiązania Cα—N nazywany jest kątem fi (ϕ), natomiast kąt wokół wiązania Co—Cα – kątem psi (ψ). W peptydach, dla aminokwasów innych niż glicyna, większość kombinacji kątów phi i psi jest niedozwolona z powodu zawady przestrzennej (ryc. 5-1). Konformacje proliny są jeszcze bardziej ograniczone, ponieważ jej struktura pierścieniowa uniemożliwia swobodną rotację jej wiązania N—Cα.

Reszty aminoacylowe w rozbudowanych segmentach polipeptydu (np. pętlach) przyjmują różnorodne kąty phi i psi. Regiony uporządkowanej struktury drugorzędowej powstają, gdy szereg reszt aminoacylowych przyjmuje podobne kąty phi i psi. Wartości kątów definiujące dwa najczęstsze typy struktury drugorzędowej, helisę α i harmonijkę β (β-kartkę), znajdują się odpowiednio w dolnym i górnym lewym kwadrancie diagramu Ramachandrana (zob. ryc. 5–1).

Rycina 5-1. Wykres Ramachandrana. Niebieskie obszary wskazują sterycznie dopuszczalne kombinacje kątów phi–psi dla aminokwasów nieglicynowych i nieprolinowych w łańcuchu polipeptydowym. Im głębszy odcień niebieski, tym bardziej korzystna termodynamicznie kombinacja phi–psi. Oznaczono kąty phi–psi odpowiadające określonym typom struktur drugorzędowych.

Helisa α

Szkielet polipeptydowy helisy α jest skręcony wokół każdego atomu węgla α o taki sam kąt phi, tj. o około –57°, oraz kąt psi, tj. o około –47°. Na pełny obrót helisy przypada średnio 3,6 reszty aminokwasowej, a odcinek, jaki przypada na jej jeden pełny obrót (tj. jej skok), wynosi 0,54 nm (ryc. 5-2). Grupy R każdej reszty aminokwasowej w helisie α wystają na zewnątrz helisy (ryc. 5-3). Białka zawierają jedynie l-aminokwasy, które tworzą bardziej trwałą prawoskrętną helisę α; występują w nich zatem jedynie helisy α prawoskrętne. Helisy α są przedstawiane na schematach struktury białek w formie zwojów lub cylindrów.

Rycina 5-2. Ułożenie głównych atomów łańcucha peptydowego wokół osi helisy α.

Rycina 5-3. Widok wzdłuż osi helisy α polipeptydu. Łańcuchy boczne (R) znajdują się na zewnątrz helisy. Obszary oddziaływań van der Waalsa atomów są większe niż pokazano na rycinie; dlatego wewnątrz helisy prawie nie ma wolnej przestrzeni.

Stabilność helisy α wynika przede wszystkim z obecności wiązań wodorowych tworzonych między atomem tlenu grupy karbonylowej wiązania peptydowego oraz atomem wodoru grupy N—H wiązania peptydowego, czwartej z kolei reszty aminokwasowej (ryc. 5-4). Zdolność tworzenia maksymalnej liczby wiązań wodorowych, wspomagana oddziaływaniami van der Waalsa występującymi w rdzeniu tej ściśle upakowanej struktury, warunkuje siłę napędową tworzenia helisy α. Ponieważ peptydowemu atomowi azotu proliny brakuje wiążącego się z nim atomu wodoru, nie może ona tworzyć wiązania wodorowego z karbonylowym atomem tlenu. Dlatego prolina może być trwale ulokowana jedynie w pierwszym zwoju helisy α. Jej obecność w dowolnym innym miejscu powoduje zagięcia. Zagięcia helisy α często wywołuje również glicyna ze względu na swój mały rozmiar.

Wiele helis α zawiera przeważnie hydrofobowe grupy R po jednej stronie osi helisy, a po drugiej – grupy hydrofilowe. Amfipatyczne helisy są dobrze przystosowane do tworzenia styku między polarnymi i niepolarnymi regionami, tak jak między hydrofobowym wnętrzem białka i jego środowiskiem wodnym. Zgrupowania amfipatycznych helis mogą tworzyć kanały lub pory, umożliwiające różnym specyficznym cząsteczkom przechodzenie przez hydrofobowe błony komórkowe.

Struktura β

Drugą (stąd „beta”) rozpoznawalną regularną strukturą drugorzędową w białkach jest harmonijka β. W przeciwieństwie do zwartego szkieletu helisy α szkielet peptydowy harmonijki β jest silnie rozciągnięty. Gdy patrzy się z boku, szkielet układa się w zygzak lub plisę, z której grupy R sąsiednich reszt aminokwasowych wystają w przeciwnych kierunkach. Podobnie jak helisa α, harmonijki β zawdzięczają swoją stabilność w dużej mierze wiązaniom wodorowym między tlenkami karbonylowymi a wodorami amidowymi wiązań peptydowych. W przeciwieństwie jednak do helisy α wiązania te powstają między sąsiednimi segmentami harmonijki β (ryc. 5-5).

Oddziałujące harmonijki β mogą być ułożone tak, że sąsiednie segmenty łańcucha polipeptydowego przebiegają w tym samym kierunku – od grupy aminowej do karboksylowej – tworząc równoległe harmonijki β, lub w przeciwnych kierunkach – tworząc antyrównoległe harmonijki β (zob. ryc. 5-5). Obie konfiguracje są stabilizowane wiązaniami wodorowymi między segmentami, czyli łańcuchami harmonijki β. Większość harmonijek β nie jest idealnie płaska, lecz ma tendencję do skręcania w prawo. Skupiska skręconych łańcuchów harmonijki β, czasami nazywane baryłkami β, tworzą rdzeń wielu białek globularnych (ryc. 5-6). Schematyczne diagramy często przedstawiają harmonijki β jako strzałki, których wierzchołki wskazują kierunek od grupy aminowej do karboksylowej.

Pętle i zagięcia

W przybliżeniu połowa reszt aminokwasowych w „typowym” białku globularnym występuje w helisach α i strukturach β, a połowa – w pętlach, zwojach, zagięciach i innych strukturach konformacyjnych. Zwoje i zagięcia odnoszą się do krótkich segmentów aminokwasowych, które łączą dwie jednostki o strukturze drugorzędowej, np. dwa sąsiednie pasma antyrównoległej struktury β. Zwój β obejmuje cztery reszty aminokwasowe, z których pierwsza jest połączona wiązaniem wodorowym z czwartą z kolei, co skutkuje ostrym zwrotem o 180° (ryc. 5-7). W zwojach β występują często prolina i glicyna.

Rycina 5-4. Wiązania wodorowe (linie kropkowane) utworzone między atomami O i H stabilizują polipeptyd w konformacji α-helikalnej.

Rycina 5-7. Zwój β łączący dwa segmenty antyrównoległej struktury β. Linia kropkowana oznacza wiązanie wodorowe między pierwszą i czwartą resztą czteroaminokwasowego segmentu Ala-Gly-Asp-Ser.

Pętle stanowią regiony zawierające więcej reszt aminokwasowych, niż jest to konieczne do połączenia przyległych fragmentów struktury drugorzędowej. Mimo że przyjmują one nieregularne konformacje, pełnią zwykle kluczowe funkcje biologiczne. W przypadku wielu enzymów pętle, które łączą domeny odpowiedzialne za wiązanie substratu, często zawierają reszty aminokwasowe uczestniczące w katalizie. Elementy helisa–pętla–helisa stanowią składniki wiążące się z oligonukleotydami w białkach oddziałujących z DNA, tak jak w przypadku represorów i czynników transkrypcyjnych. Elementy strukturalne typu helisa–pętla–helisa lub „ręka E-F” kalmoduliny (zob. rozdz. 42), będące formą przejściową między strukturą drugorzędową i trzeciorzędową, są określane niejednokrotnie jako struktury naddrugorzędowe. Liczne pętle i zagięcia występujące na powierzchni białek, a więc wyeksponowane do rozpuszczalnika, stanowią łatwo dostępne miejsca, czyli epitopy, rozpoznawane i wiążące się z przeciwciałami.

Rycina 5-5. Rozmieszczenie przestrzenne i kąty wiązań mostków wodorowych w antyrównoległych i równoległych strukturach harmonijkowych. Strzałki wskazują kierunek każdego łańcucha polipeptydowego. Wiązania wodorowe są przedstawione liniami przerywanymi między atomami azotu α (donorami wodoru) i atomami tlenu (akceptorami wodoru), zaznaczonymi odpowiednio na niebiesko i czerwono. Atomy węgla szkieletu są zaznaczone na czarno. Dla przejrzystości ryciny pominięto grupy R i atomy wodoru. Góra: Antyrównoległa struktura β. Pary wiązań wodorowych są na przemian raz blisko siebie, raz znacznie oddalone i zorientowane w przybliżeniu prostopadle do szkieletu polipeptydowego. Dół: Równoległa struktura β. Wiązania wodorowe są rozmieszczone równomiernie, lecz skośnie, w różnych kierunkach.

Rycina 5-6. Przykłady struktury trzeciorzędowej białek. Na górze: Izomeraza fosfotrioz w kompleksie z analogiem substratu, 2-fosfoglicerynianem (czerwony w centrum). Zauważalna elegancja i symetria naprzemiennego ułożenia struktur β (szare) i helis α (zielone) oraz struktur β tworzących β-baryłkę otoczony helisami. Na dole: Lizozym w połączeniu z analogiem substratu, penta-N-acetylo-chitopentozą (czerwony). Kolor łańcucha peptydowego jest stopniowany od fioletowego (N-koniec) do jasnobrązowego (C-koniec). Wklęsły kształt domeny tworzy kieszeń dla pięciocukrów, brakuje struktur β, na korzyść wysokiej proporcji pętli i zagięć.

Źródło: zaadaptowano z Protein Data Bank ID no. 1o5x (ryc. na górze); zaadaptowano za zgodą z Protein Data Bank ID no. 1 sfb (ryc. na dole).

Chociaż pętle nie wykazują regularności strukturalnej, ich specyficzna konformacja jest utrzymywana przez wiązania wodorowe, oddziaływania jonowe oraz hydrofobowe z innymi regionami białka. Nie wszystkie jednak fragmenty białek muszą mieć uporządkowaną strukturę. Białka mogą zawierać „nieuporządkowane” regiony o znacznej elastyczności konformacyjnej, często w obrębie krańcowych sekwencji aminowych lub karboksylowych. W wielu przypadkach regiony nieuporządkowane przyjmują uporządkowaną konformację dopiero po związaniu się z ligandem. Ta strukturalna elastyczność umożliwia takim polipeptydowym segmentom funkcjonowanie w charakterze „przełączników” kontrolowanych wiązaniem ligandu, który wpływa na strukturę i funkcję białka.

Struktury trzecio- i czwartorzędowa

Pojęcie „struktura trzeciorzędowa” odwołuje się do całej trójwymiarowej konformacji polipeptydu. Określa ona, jak drugorzędowe elementy struktury – helisy, pofałdowane kartki, zagięcia, zwoje i pętle – układają się w przestrzeni trójwymiarowej, tworząc domeny, i jak te domeny są ułożone względem siebie. Domena stanowi fragment struktury białka wystarczający do pełnienia określonej funkcji chemicznej lub fizycznej, takiej jak wiązanie substratu bądź innego liganda.

Większość domen ma budowę modularną, ciągłą zarówno w sekwencji pierwszorzędowej, jak i przestrzeni trójwymiarowej (ryc. 5-8). Proste białka, zwłaszcza te, które oddziałują z pojedynczym substratem, np. lizozym, izomeraza triozofosforanowa (zob. ryc. 5-6) czy mioglobina – białko magazynujące tlen (zob. rozdz. 6), składają się często z pojedynczych domen. Natomiast dehydrogenaza mleczanowa tworzy dwie domeny – domenę N-końcową wiążącą NAD⁺ i C-końcową dla drugiego substratu, pirogronianu (ryc. 5-8). Dehydrogenaza mleczanowa należy do rodziny oksydoreduktaz, które zawierają wspólną domenę N-końcową, wiążącą NAD(P)⁺, określaną zagięciem (foldem) Rossmanna. Wiele oksydoreduktaz wykorzystujących układ NAD(P)⁺/NADP(H) do utleniania i redukcji szerokiej gamy metabolitów powstało przez fuzję segmentu DNA kodującego domenę zagięcia Rossmanna z segmentami kodującymi różne domeny C-końcowe. Przykłady obejmują dehydrogenazę alkoholową, dehydrogenazą aldehydu 3-fosfoglicerynowego, dehydrogenazę jabłczanową, oksydoreduktazę chinonową, dehydrogenazę 6-fosfoglukonianową, dehydrogenazę D-glicerynianową oraz dehydrogenazę mrówczanową.

Rycina 5-8. Polipeptyd zawierający dwie domeny. Na górze: Przedstawiona jest trójwymiarowa struktura jednostki monomeru tetramerycznego enzymu, dehydrogenazy mleczanowej ze związanym substratem NADH (kolor czerwony) i pirogronianem (kolor niebieski). Nie wszystkie wiązania w NADH są pokazane. Kolor łańcucha polipeptydowego jest cieniowany od niebieskiego (N-koniec) do pomarańczowego (C-koniec). Warto zwrócić uwagę na to, jak fragment N-końcowy polipeptydu tworzy ciągłą domenę obejmującą lewą część enzymu odpowiedzialną za wiązanie NADH. Podobnie fragment C-końcowy tworzy ciągłą domenę odpowiedzialną za wiązanie pirogronianu. Na dole: Przedstawiona jest trójwymiarowa struktura katalitycznej podjednostki kinazy białkowej zależnej od cAMP (zob. rozdz. 42) ze związanym analogiem substratu, ADP (kolor czerwony) i peptydem (kolor fioletowy). Kolor łańcucha polipeptydowego jest cieniowany od niebieskiego (N-koniec) do pomarańczowego (C-koniec). Kinazy białkowe przenoszą resztę fosforanową γ z ATP na substraty białkowe i peptydowe (zob. rozdz. 9). Można zauważyć, jak fragment N-końcowy polipeptytu tworzy ciągłą domenę bogatą w struktury β wiążące ADP. Podobnie fragment C-końcowy tworzy ciągłą domenę bogatą w helisy α, odpowiedzialną za wiązanie substratu peptydowego.

Źródło: zaadaptowano za zgodą: rycina na górze z Protein Data Bank ID no. 3ldh; rycina na dole z Protein Data Bank ID no. 1jbp.

Nie wszystkie domeny wiążą się z substratami. Hydrofobowe domeny błonowe kotwiczą białka do błon lub umożliwiają im przenikanie ich struktury. Sekwencje lokalizacyjne kierują białka do specyficznych lokalizacji subkomórkowych lub pozakomórkowych, takich jak jądra, mitochondria, pęcherzyki wydzielnicze. Domeny regulacyjne wyzwalają zmiany funkcji protein w odpowiedzi na związanie z efektorami allosterycznymi lub na skutek modyfikacji kowalencyjnych (zob. rozdz. 9). Łączenie materiału genetycznego kodującego indywidualne moduły dla domen zapewnia łatwą drogę do wytwarzania białek o wielkiej złożoności strukturalnej i finezyjnym działaniu (ryc. 5-9).

Rycina 5-9. Niektóre białka zawierające wiele domen. Prostokąty reprezentują sekwencje polipeptydowe czynnika transkrypcyjnego typu forkhead; 6-fosfofrukto-2-kinaza/fruktozo-2,6-bisfosfataza, dwufunkcyjny enzym, którego aktywność jest kontrolowana w sposób odwrotny przez efektory allosteryczne i modyfikację kowalencyjną (zob. rozdz. 19); hydroksylaza fenyloalaninowa (zob. rozdz. 27 i 29), której aktywność jest stymulowana przez fosforylację jej domeny regulacyjnej; oraz receptor przedsionkowego peptydu natriuretycznego, którego domena wewnątrzkomórkowa przekazuje sygnały poprzez interakcje białko–białko z heterotrimerycznymi białkami wiążącymi GTP (zob. rozdz. 42). Domeny regulacyjne są oznaczone kolorem pomarańczowym, domeny katalityczne – kolorem niebieskim lub fioletowym, domeny interakcji białko–białko (Pr-Pr) – kolorem zielonym, domeny wiążące DNA – kolorem szarym, sekwencje lokalizacji jądrowej – kolorem czerwonym, domeny wiążące ligand – kolorem żółtym, a domeny transbłonowe – kolorem czarnym. Aktywności kinazy i bisfosfatazy 6-fosfofrukto-2-kinazy/fruktozo-2,6-bisfosfatazy katalizowane są odpowiednio przez domeny katalityczne znajdujące się w pobliżu N- (PFK-2) i C-końcowej (FBP2-azy).

Białka zawierające wiele domen mogą być również składane dzięki połączeniu wielu polipeptydów albo protomerów. Struktura czwartorzędowa określa skład polipeptydowy oligomerycznego białka i przestrzenne ułożenie jego podjednostek lub protomerów. Białka monomeryczne są zbudowane z pojedynczego łańcucha polipeptydowego. Białka dimeryczne zawierają dwa łańcuchy. Homodimery obejmują dwie kopie tego samego łańcucha peptydowego, natomiast heterodimery – różne łańcuchy polipeptydowe. W celu rozróżnienia odmiennych podjednostek heterooligomerycznego białka oznacza się je literami greckimi (α, β, γ itd.), natomiast cyframi umieszczanymi w dolnym indeksie – liczbę podjednostek danego typu. Na przykład α₄ oznacza białko homotetrameryczne, a α₂β₂γ – białko zawierające pięć podjednostek trzech różnych typów.

Diagramy schematyczne podkreślają specyficzne cechy strukturalne

Do trójwymiarowej struktury dosłownie tysięcy białek można uzyskać dostęp za pośrednictwem baz danych, takich jak Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) i innych repozytoriów.

Ponieważ nawet małe białka zawierają wiele tysięcy atomów, prezentacja struktury białka, która uwzględnia położenie każdego atomu, na ogół nie jest łatwa do interpretacji. Dlatego do opisywania kluczowych cech struktury trzecio- i czwartorzędowej białka stosowane są uproszczone diagramy. Na diagramach tasiemkowych (wstęgowych; zob. ryc. 5-5 i 5-7) nakreślona jest konformacja szkieletu polipeptydowego, w którym cylindry i strzałki wskazują, odpowiednio, regiony α i β. Na jeszcze prostszym schemacie ślad szkieletu polipeptydowego jest przedstawiany w postaci linii łamanej, łączącej atomy węgla α. Takie schematyczne przedstawienie struktury często obejmuje również łańcuchy boczne wybranych aminokwasów, podkreślających specyficzne związki między strukturą i funkcją białka.

STRUKTURĘ TRZECIO- I CZWARTORZĘDOWĄ STABILIZUJE WIELE CZYNNIKÓW

Struktury białkowe wyższego rzędu są stabilizowane przede wszystkim, a często wyłącznie, przez wiązania niekowalencyjne. Do najważniejszych należą oddziaływania hydrofobowe, które kierują łańcuchy boczne hydrofobowych aminokwasów do wnętrza białka lub do obszaru, który wchodzi w kontakt z drugą podjednostką, osłaniając je w ten sposób od otaczających cząsteczek wody. Do innych znaczących oddziaływań zalicza się wiązania wodorowe oraz oddziaływania jonowe (mostki solne) między zjonizowanymi grupami karboksylowymi kwasów asparaginowego i glutaminowego oraz przeciwnie naładowanymi łańcuchami bocznymi protonowanych reszt lizyny, argininy i histydyny. Oddziaływania te, jeśli występują indywidualnie, są słabe: 1–5 kcal/mol w stosunku do typowych wiązań kowalencyjnych o energii 80–120 kcal/mol. Podobnie jednak jak popularne zapięcie „na rzepy” wykorzystujące skumulowaną siłę wielu słabych, ale licznych oddziaływań plastikowych pętelek i haczyków, zapewniają wysoki stopień stabilności biologicznie funkcjonalnych konformacji białek.

Niektóre białka zawierają również wiązania disulfidowe (mostki disiarczkowe, S—S), łączące grupy tiolowe (sulfhydrylowe) reszt cysteinowych. Ich tworzenie opiera się na utlenieniu grup sulfhydrylowych i wymaga czynników utleniających. Wiązania disulfidowe wewnątrz łańcucha polipeptydowego dodatkowo umacniają zwiniętą konformację, natomiast wiązania disulfidowe między różnymi łańcuchami peptydowymi stabilizują strukturę czwartorzędową niektórych białek oligomerycznych.

TRÓJWYMIAROWA STRUKTURA JEST OKREŚLANA ZA POMOCĄ TECHNIK BIOFIZYCZNYCH

Krystalografia rentgenowska

Podążając za wyjaśnieniem trójwymiarowej struktury mioglobiny przez Johna Kendrew w 1960 roku, krystalografia rentgenowska pozwoliła ujawnić strukturę tysięcy makrocząsteczek biologicznych: od polipeptydów do białek i wirusów. W celu rozszyfrowania struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej białko wytrąca się z roztworu o składzie, umożliwiającym tworzenie dobrze uporządkowanych kryształów. Należy także ustalić odpowiednie warunki, wykonując próby krystalizacji z kilkumikrolitrowymi objętościami roztworu białka i różnymi kombinacjami zmiennych parametrów (temperatury, pH, obecności soli lub składników organicznych, np. glikolu polietylenowego); dzięki temu można określić optymalne warunki tworzenia się kryształów. Kryształy o odpowiedniej wielkości są następnie wystawiane na wiązki promieni X w celu uzyskania obrazu dyfrakcyjnego powstającego w wyniku kolizji z jądrami atomów badanego białka.

Wcześni krystalografowie gromadzili wzory utworzone przez ugięte promienie rentgenowskie jako serię plamek na kliszy. Aby obliczyć położenie każdego atomu, należy najpierw określić fazy ugiętych promieni rentgenowskich. Tradycyjne podejście do rozwiązania „problemu fazowego” wykorzystuje przesunięcie izomorficzne, w którym atom o silnej i charakterystycznej „sygnaturze” rentgenowskiej, taki jak rtęć lub uran, jest wprowadzany do kryształu w znanych pozycjach w strukturze pierwszorzędowej białka. Alternatywnie ekspresja rekombinacyjna może być wykorzystana do zastąpienia metioniny selenocysteiną, której atom selenu również posiada charakterystyczną sygnaturę rentgenowską. Jeśli analizowane białko jest homologiczne do białka, którego struktura została już rozwiązana, można uzyskać dane z dyfrakcji fazowej bez użycia ciężkich atomów, przeprowadzając zamianę molekularną, z wykorzystaniem istniejącej struktury jako rusztowania.

Początkowo ekstrapolacja położenia poszczególnych atomów w białku wymagała ręcznego pomiaru położenia każdej plamki na obrazie dyfrakcyjnym, a następnie serii czasochłonnych obliczeń ręcznych. Obecnie wzory te są rejestrowane elektronicznie za pomocą detektora powierzchni, a następnie analizowane za pomocą metody matematycznej zwanej transformacją (syntezą) Fouriera. Czy białka wewnątrz tych kryształów występują w tej samej konformacji, co w roztworze swobodnym? Konsensus jest taki, że tak. Wniosek ten jest poparty zdolnością wielu enzymów do katalizowania reakcji chemicznych w stanie krystalicznym.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (nuclear magnetic resonance, NMR) mierzy absorbcję energii elektromagnetycznej o częstotliwości radiowej przez określone jądra atomowe. Izotopy „aktywne w NMR” pierwiastków biologicznie istotnych obejmują ¹H, ¹³C, ¹⁵N i ³¹P. Częstotliwość, czyli przesunięcie chemiczne, przy którym dane jądro absorbuje energię, jest funkcją samego izotopu, a także obecności i bliskości innych jąder aktywnych w NMR. W jednowymiarowym NMR monitorowany jest pojedynczy izotop, np. ¹³C. Uzyskane dane dotyczące przesunięcia chemicznego mogą posłużyć do identyfikacji grupy funkcyjnej, w której znajduje się każdy atom, np. -CH₂- lub -CHOH-, a także obecności wszelkich związanych z nim jąder aktywnych w NMR. Dwuwymiarowy NMR wykorzystuje sprzężenie jąder aktywnych w NMR w przestrzeni, zwane efektem jądrowego Overhausera (nuclear Overhauser effect, NOE), w celu określenia bliskości dwóch różnych jąder aktywnych w NMR, np. ¹H i ¹³C lub ¹H i ¹⁵N, względem siebie. Na podstawie tych informacji relacje przestrzenne między atomami składowymi można wykorzystać do zbudowania struktury trójwymiarowej.

Ponieważ spektroskopia NMR analizuje białka w roztworach wodnych, może być ona wykorzystywana do obserwacji zmian konformacji białek towarzyszących wiązaniu ligandu lub katalizie w czasie rzeczywistym. Umożliwia również określenie struktur trójwymiarowych białek, których krystalizacja jest trudna lub niemożliwa. Nieinwazyjny i nieniszczący charakter NMR pozwoli w przyszłości na obserwację struktury i dynamiki białek w żywych komórkach.

Mikroskopia krioelektronowa

Biochemicy od dawna marzyli o obserwowaniu białek i innych makrocząsteczek biologicznych w taki sam sposób, w jaki mikroskopy optyczne umożliwiają mikrobiologom i biologom komórkowym bezpośrednią obserwację żywych komórek. Rozdzielczość mikroskopów optycznych jest jednak ograniczona długością fali światła widzialnego (4 do 7 × 10⁻⁷ m) używanego do badania próbki. W połowie XX wieku naukowcy odkryli, jak wykorzystać wiązki elektronów jako źródło promieniowania elektromagnetycznego. Niższa długość fali wiązek elektronów (1 × 10⁻¹² m do 10 × 10⁻¹² m) umożliwiła mikroskopom elektronowym (electron microscopes, EM) uzyskanie powiększeń ponad milion razy większych niż mikroskop optyczny – wystarczających do uwidocznienia dużych makrocząsteczek, takich jak rybosomy i plazmidy DNA, pokryte powłoką z gęstego pierwiastka, takiego jak uran w octanie uranu. Wysokoenergetyczna wiązka elektronów miała jednak tendencję do szybkiej degradacji wielu biologicznych makrocząsteczek.

W 2017 roku Jacques Dubochet, Joachim Frank i Richard Henderson otrzymali Nagrodę Nobla za rozwój kriomikroskopii elektronowej (Cryo-EM). Kriomikroskopia elektronowa wykorzystuje ultrazimne media, takie jak ciekły azot (temperatura około −195°C), ciekły etan lub ciekły hel, do stabilizacji biocząsteczek w stanie uwodnionym i ochrony przed nagrzewaniem podczas bombardowania wiązką elektronów. Technika ta umożliwia wizualizację dużych makrocząsteczek i kompleksów makrocząsteczkowych za pomocą mikroskopii elektronowej. Ekstremalnie niskie temperatury przyniosły dodatkową korzyść w postaci stabilizacji makrocząsteczek w jednym stanie konformacyjnym. Badanie zbioru makrocząsteczek często ujawnia różne konformacje strukturalne, jakie mogą one osiągnąć. Tomografia wykorzystuje fakt, że poszczególne biologiczne makromolekuły i ich kompleksy leżą w wielu orientacjach, pozwalając na tworzenie złożonych obrazów trójwymiarowych z zestawu obrazów dwuwymiarowych. W ten sposób można określić i porównać wpływ czynników wywołujących zmiany w stanie konformacyjnym. Kriomikroskopia elektronowa szybko wypiera krystalografię rentgenowską jako metodę z wyboru do określania trójwymiarowych struktur białek i innych makrocząsteczek biologicznych.

Modelowanie molekularne

Cennym uzupełnieniem empirycznego określania trójwymiarowej struktury białek jest wykorzystanie technik komputerowych do modelowania molekularnego. Gdy struktura trójwymiarowa jest znana, do symulacji dynamiki konformacyjnej białka i sposobu, w jaki czynniki takie jak temperatura, pH, siła jonowa czy substytucje aminokwasów wpływają na te zmiany, mogą być zastosowane programy dynamiki molekularnej. Do analizy interakcji zachodzących, gdy białko napotyka substrat, inhibitor lub inny ligand, można z kolei wykorzystywać programy symulujące dokowanie molekularne. Komputerowo wspomagane projektowanie leków, czyli wirtualne badanie przesiewowe cząsteczek, które mogą oddziaływać z kluczowymi miejscami białka o znaczeniu biomedycznym, jest szeroko stosowane w celu ułatwienia odkrywania potencjalnych terapeutyków.

Modelowanie molekularne jest również wykorzystywane do wnioskowania o strukturze białek, dla których struktury krystalograficzne rentgenowskie lub NMR nie są jeszcze dostępne. Algorytmy struktury drugorzędowej oceniają skłonność określonych reszt do wbudowywania się w helisy α lub harmonijki β we wcześniej badanych białkach, aby przewidzieć strukturę drugorzędową innych polipeptydów. W modelowaniu homologicznym znana trójwymiarowa struktura białka jest używana jako szablon do zbudowania modelu prawdopodobnej struktury pokrewnego białka. Dzięki najnowszym postępom w uczeniu maszynowym przewidywanie trójwymiarowej konformacji białka bezpośrednio na podstawie jego sekwencji pierwszorzędowej może wkrótce stać się rutyną.

FAŁDOWANIE BIAŁEK

Białka to cząsteczki o dynamicznej konformacji, które mogą się zwinąć do swojej funkcjonalnej, kompetentnej konformacji w zaledwie kilka milisekund. Co więcej, często mogą się zwinąć ponownie, jeśli ich konformacja zostanie zaburzona – w procesie zwanym renaturacją. Jak osiąga się niezwykłą szybkość i dokładność fałdowania białek? W naturze fałdowanie do stanu natywnego zachodzi zbyt szybko, aby było wynikiem losowego, chaotycznego poszukiwania wszystkich możliwych układów. Zdenaturowane białka to nie tylko losowy układ cząsteczek. Preferowane są natywne układy, a obszary natywnej struktury utrzymują się nawet w stanie zdenaturowanym. Dalej przedstawiono czynniki, które ułatwiają i stanowią podstawowe aspekty mechanizmów pierwotnego i powtórnego zwijania łańcuchów peptydowych białek.

Natywna konformacja białka jest uprzywilejowana termodynamicznie

Ponieważ biologicznie istotna – lub natywna – konformacja białka jest zazwyczaj najbardziej preferowana energetycznie, informacja o natywnej konformacji jest określona w sekwencji pierwotnej. Jednakże liczba różnych kombinacji kątów phi i psi, które potencjalnie może przyjąć nawet stosunkowo mały – 100 aminokwasów – polipeptyd, jest niewiarygodnie ogromna: 3¹⁹⁸. Zatem osiągnięcie natywnej konformacji przez polipeptyd wymagałoby miliardów lat, gdyby fałdowanie odbywało się poprzez losową eksplorację wszystkich możliwych konformacji. Oczywiste jest, że w naturze fałdowanie białek przebiega w bardziej uporządkowany i kontrolowany sposób.

Zwijanie przebiega modułowo

Fałdowanie białek zazwyczaj przebiega etapowo. Na pierwszym etapie, gdy nowo syntetyzowany polipeptyd wyłania się z rybosomu, krótkie segmenty fałdują się w drugorzędowe jednostki strukturalne. Rozpoczęcie fałdowania w sposób kontranslacyjny, czyli w trakcie syntezy białka, upraszcza proces fałdowania, w którym powstające segmenty zorganizowanej struktury stanowią rusztowanie wspomagające fałdowanie kolejnych segmentów w kierunku natywnej konformacji, unikając nieproduktywnych alternatyw. Na drugim etapie hydrofobowe regiony początkowego zestawu elementów drugorzędowych i naddrugorzędowych segregują się, oddalając od wody i tworząc hydrofobowy rdzeń „stopionej kuli”. Wewnątrz stopionej kuli moduły struktury drugorzędowej ulegają reorganizacji, a nawet przekształcają się w inne typy drugorzędowych form strukturalnych, aż do osiągnięcia dojrzałej konformacji białka. Proces ten, choć uporządkowany, nie jest sztywno ustalony. W przypadku białek oligomerycznych poszczególne protomery mają tendencję do fałdowania się, zanim połączą się z innymi podjednostkami.

Białka pomocnicze wspomagają zwijanie

W odpowiednich warunkach laboratoryjnych wiele białek może samoczynnie powrócić do natywnej konformacji, po uprzedniej denaturacji (tj. rozwinięciu) wywołanej kwasem lub zasadą, czyli czynnikiem chaotropowym, lub detergentem. W przeciwieństwie jednak do procesu zwijania in vivo powtórne fałdowanie w warunkach laboratoryjnych zachodzi znacznie wolniej, trwając minuty lub godziny. Co więcej, wiele białek nie jest zdolnych do powtórnego zwinięcia się in vitro i często tworzą nierozpuszczalne agregaty, nieuporządkowane kompleksy, niezwinięte lub częściowo pofałdowane polipeptydy, utrzymywane razem dzięki oddziaływaniom hydrofobowym. Chociaż naturalna konformacja może być termodynamicznie korzystna, agregaty zazwyczaj przybierają kształt zdeterminowany lokalnymi stanami równowagi energetycznej, a proces ten jest trudno odwrócić. Stanowią one nieproduktywne i często cytotoksyczne ślepe zaułki procesu fałdowania. Komórki wykorzystują białka pomocnicze, aby przyspieszyć proces fałdowania i skierować jego trajektorię z dala od formowania agregatów w kierunku funkcjonalnych struktur.

Białka opiekuńcze (czaperony)

Białka opiekuńcze, czyli czaperonowe (chaperons), uczestniczą w zwijaniu łańcuchów polipeptydowych ponad połowy wszystkich białek ssaków. Rodzina białek szoku termicznego Hsp70 (heat shock protein, o masie cząsteczkowej 70 kDa) wiąże krótkie sekwencje hydrofobowych aminokwasów nowo zsyntezowanego polipeptydu, osłaniając je od rozpuszczalnika. Czaperony zapobiegają agregacji, zapewniając w ten sposób możliwość utworzenia elementów o odpowiedniej strukturze drugorzędowej oraz ich późniejsze scalenie w fazie „stopionej kuli”. Sekwencje i struktura rodziny białek czaperonowych Hsp60, czasami określanych czaperoninami, różnią się zarówno od białek Hsp70, jak i od jego homologów. Białko Hsp60 funkcjonuje podczas późniejszych etapów procesu zwijania, często jednak razem z Hsp70. Centralna jama oligomeru Hsp60 tworzy osłonięte, niepolarne środowisko, w którym nieprawidłowo złożony polipeptyd może się rozwinąć, a następnie ponownie złożyć do swojej fizjologicznie funkcjonalnej konformacji.

Izomeraza disiarczkowa białek

Wiązania disiarczkowe pomiędzy polipeptydami oraz wewnątrz nich stabilizują struktury trzeciorzędowe i czwartorzędowe. Proces ten jest inicjowany przez enzym białkową oksydazę sulfhydrylową, która katalizuje utlenianie reszt cysteiny z utworzeniem wiązań disiarczkowych. Tworzenie wiązań disiarczkowych jest jednak niespecyficzne – dana cysteina może utworzyć wiązanie disiarczkowe z dowolną dostępną resztą cysteiny. Katalizując wymianę disiarczkową, rozerwanie wiązania S—S i jego ponowne utworzenie z inną cysteiną, izomeraza disiarczkowa białka ułatwia tworzenie wiązań disiarczkowych, które stabilizują natywną konformację białka. Ponieważ wiele eukariotycznych białkowych oksydaz sulfhydrylowych jest zależnych od flawiny, niedoborowi ryboflawiny w diecie często towarzyszy zwiększone ryzyko nieprawidłowego fałdowania białek zawierających disiarczki.

Izomeryzacja cis, trans-prolinowa

Wszystkie wiązania peptydowe X-Pro, gdzie X oznacza dowolną resztę aminokwasową, są syntezowane w konfiguracji trans, jednak około 6% wiązań X-Pro w dojrzałych białkach ma konfigurację cis. Konfiguracja cis szczególnie często występuje w skrętach β. Izomeryzacja formy trans do cis jest katalizowana przez izomerazy cis, trans-prolinowe, rodzinę enzymów znaną także jako cyklofiliny (ryc. 5-10). Oprócz wspierania dojrzewania białek natywnych, cyklofiliny biorą także udział w zwijaniu białek wytwarzanych przez atakujące wirusy. Cyklofiliny stanowią więc cel dla rozwoju takich leków, jak cyklosporyna i alisporiwir, stosowanych w leczeniu zakażenia HIV, wirusowego zapalenia wątroby typu C lub innych chorób przenoszonych przez wirusy.

Rycina 5-10. Izomeryzacja prolilowego wiązania peptydowego N-α, z konfiguracji cis do trans względem szkieletu polipeptydowego.

ZABURZENIA KONFORMACJI BIAŁEK MOGĄ MIEĆ PATOLOGICZNE KONSEKWENCJE

Priony

Zakaźne encefalopatie gąbczaste, czyli choroby prionowe, są śmiertelnymi chorobami neurozwyrodnieniowymi, które charakteryzują się zmianami gąbczastymi, glejakami astrocytarnymi, a także utratą neuronów spowodowaną odkładaniem się nierozpuszczalnych agregatów białkowych w układzie nerwowym. Do chorób prionowych zalicza się chorobę Creutzfeldta–Jakoba występującą u ludzi, scrapie u owiec oraz zwyrodnienie gąbczaste u bydła (tzw. choroba szalonych krów). Odmiana choroby Creutzfeldta–Jakoba (variant Creutzfeldt–Jakob disease, vCJD), która dotyka młodszych pacjentów, jest związana z wczesnymi objawami psychiatrycznymi oraz zaburzeniami zachowania. Choroby prionowe mogą się ujawniać jako choroby zakaźne, genetyczne lub sporadyczne. Długo jednak nie można było zidentyfikować bakteryjnego lub wirusowego pochodzenia białek prionowych, dlatego źródło i mechanizm zakażenia chorób prionowych pozostawały w sferze domysłów.

Obecnie wiadomo, że choroby prionowe są chorobami konformacji białek przenoszonymi przez zmianę konformacji, zatem i właściwości fizycznych, białek endogennych gospodarza, takich jak ludzkie białko prionowe (PrP). Cząsteczka PrP jest glikoproteiną kodowaną na krótkim ramieniu chromosomu 20. W zdrowym organizmie jest to białko monomeryczne, bogate w helisy α. Patologiczne białka prionowe służą jako matryce dla przemiany konformacyjnej prawidłowego białka PrP, określanego jako PrPc, do białka patologicznego, PrPsc (PrP scrapie). Cząsteczka PrPsc obfituje z kolei w struktury β, z łańcuchami bocznymi wielu hydrofobowych aminokwasów skierowanymi w stronę rozpuszczalnika. Gdy tworzona jest każda nowa cząsteczka PrPsc, w konformacyjnej reakcji łańcuchowej, wyzwala generowanie kolejnych patologicznych wariantów. Ponieważ cząsteczki PrPsc silnie ze sobą asocjują poprzez wyeksponowane regiony hydrofobowe, nagromadzenie jednostek PrPsc prowadzi do tworzenia agregatów odpornych na działanie proteaz. Jedna cząsteczka patologicznego białka prionowego lub białka spokrewnionego z prionami może służyć jako matryca dla przemiany konformacyjnej wielu prawidłowych cząsteczek białka PrPc, przekształcanych w odmiany patologiczne. Wskutek tego choroby prionowe mogą być przenoszone przez samo białko bez udziału DNA lub RNA.

Choroba Alzheimera

Blaszki starcze i pęczki neurofibrylarne, składające się głównie z agregatów β-amyloidu, są charakterystyczną cechą choroby Alzheimera. β-amyloid to polipeptyd o masie cząsteczkowej 4,3 kDa, powstający w wyniku proteolitycznego rozszczepienia większego białka endogennego dla tkanki mózgowej, znanego jako białko prekursorowe amyloidu. U pacjentów z chorobą Alzheimera ilość β-amyloidu wzrasta, a białko to ulega transformacji konformacyjnej ze stanu bogatego w rozpuszczalną helisę α do stanu bogatego w harmonijkę β, podatnego na samoagregację. Chociaż pierwotna przyczyna choroby Alzheimera pozostaje nieuchwytna, jedna z izoform apolipoproteiny E (ApoE4, uwarunkowana genotypem APOE4) jest związana z tą transformacją konformacyjną.

Beta-talasemie

Talasemie są spowodowane przez defekty genetyczne upośledzające syntezę jednej z polipeptydowych podjednostek hemoglobiny (zob. rozdz. 6). Podczas nasilonej syntezy hemoglobiny towarzyszącej dojrzewaniu erytrocytów specyficzny czaperon, określany jako białko stabilizujące hemoglobinę α (α-hemoglobin stabilizing protein, AHSP), wiąże się z wolną podjednostką α hemoglobiny, oczekującą na włączenie do tetrameru Hb. Przy braku tego czaperonu wolne podjednostki α-hemoglobiny ulegają agregacji, a wynikająca stąd precypitacja wywiera efekt cytotoksyczny na rozwijający się erytrocyt. Badania z zastosowaniem genetycznie zmodyfikowanych myszy sugerują udział białka AHSP w modulowaniu ostrości przebiegu β-talasemii u człowieka.

KOLAGEN ILUSTRUJE ROLĘ MODYFIKACJI POTRANSLACYJNYCH W DOJRZEWANIU BIAŁEK

Dojrzewanie białek często angażuje tworzenie i zrywanie wiązań kowalencyjnych

Dojrzewaniu białek do ich końcowej struktury towarzyszy często rozrywanie i/lub tworzenie wiązań kowalencyjnych, tj. modyfikacje potranslacyjne. Wiele polipeptydów jest początkowo syntezowanych jako większe prekursory, określane mianem proprotein. Ich dodatkowe segmenty polipeptydowe służą często jako sekwencje prowadzące, kierujące białko do określonej organelli komórkowej, ułatwiają jego przejście przez błonę komórkową lub służą jako rusztowanie ułatwiające fałdowanie białka. Niektóre segmenty polipeptydowe gwarantują, że potencjalnie toksyczna aktywność danego białka, np. proteazy trypsyna lub chymotrypsyna, pozostaje zablokowana aż do momentu, gdy białka te osiągną swoje docelowe miejsce. Po spełnieniu przejściowej funkcji ochronnej zbędne regiony peptydowe są usuwane w wyniku selektywnej proteolizy. Oprócz tego mogą zachodzić inne modyfikacje kowalencyjne, w wyniku których do białka są dodawane nowe grupy chemiczne. Dojrzewanie kolagenu obejmuje oba typy tych procesów.

Kolagen jest białkiem włókienkowym (fibrylarnym)

Kolagen jest najpowszechniej występującym białkiem spośród białek włókienkowych, stanowiąc ponad 25% masy białek w organizmie ludzkim. Inne ważne białka fibrylarne to keratyna oraz miozyna. Białka te są podstawowym źródłem wytrzymałości strukturalnej komórki (tj. cytoszkieletu) oraz tkanek (macierz zewnątrzkomórkowa). Skóra zawdzięcza swoją wytrzymałość i elastyczność przeplatającej się sieci kolagenu i włókien keratynowych, a struktura kości i zębów jest podtrzymywana przez sieć włókien kolagenowych, położonych podobnie jak pręty stalowe w zbrojonym betonie. Kolagen występuje również w tkance łącznej, np. więzadłach i ścięgnach. Duża wytrzymałość włókien kolagenowych na rozciąganie wymaga obecności wydłużonych cząsteczek białek o powtarzającej się sekwencji aminokwasowej i regularnej strukturze drugorzędowej.

Kolagen tworzy unikatowe potrójne helisy

Dojrzałe włókno kolagenowe formuje wydłużony pręt o stosunku osiowym równym około 200. Tropokolagen stanowiący podstawową jednostkę włókien kolagenowych składa się z trzech łańcuchów polipeptydowych, zawierających mniej więcej po 1000 aminokwasów, zwiniętych razem w unikatową konformację – potrójną helisę kolagenu (ryc. 5-11). Trzy lewoskrętne helisy polipeptydowe owijają się wzajemnie w prawą stronę, aby utworzyć potrójną helisę jednostek kolagenu. Przeciwne skręcenia całej superhelisy i jej składników polipeptydowych powodują, że jest ona bardzo odporna na rozwijanie, podobnie jak liny stalowe stosowane w wiszących mostach. Na jeden obrót potrójnej helisy kolagenu przypada 3,3 reszty aminokwasowej, a skok helisy przypadający na jedną resztę jest blisko dwukrotnie większy niż w helisie α. Grupy R każdego łańcucha polipeptydowego potrójnej helisy są upakowane tak ściśle, że aby możliwe było ich dopasowanie, jedną z nich musi być atom wodoru. Właśnie dlatego co trzecią resztą jest reszta glicyny. Lekkie wygięcie potrójnej helisy umożliwia odpowiednie usytuowanie kluczowych reszt glicyny wzdłuż całej jej długości. Kolagen obfituje również w prolinę i hydroksyprolinę w formie powtarzających się sekwencji Gly-X-Y (ryc. 5-11), w których Y zazwyczaj jest proliną lub hydroksyproliną.

Rycina 5-11. Pierwszorzędowa, drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura kolagenu. Y – reszta proliny lub hydroksyproliny.

Potrójne helisy kolagenowe są utrzymywane przez wiązania wodorowe między resztami w różnych łańcuchach polipeptydowych. W międzyłańcuchowych wiązaniach wodorowych biorą również udział grupy hydroksylowe reszt hydroksyproliny. Dodatkową stabilność zapewniają kowalencyjne wiązania formowane między zmodyfikowanymi resztami lizyny, zarówno w obrębie jednego łańcucha, jak i między różnymi łańcuchami polipeptydowymi.

Kolagen jest syntezowany jako większy prekursor

Kolagen jest pierwotnie syntezowany jako większy prekursorowy polipeptyd, tj. prokolagen. Liczne reszty prolilowe i lizylowe prokolagenu są następnie hydroksylowane przez oksygenazę hydroksylującą reszty proliny i lizyny (hydroksylazę prolilową i lizylową), enzymy wymagające kwasu askorbinowego (witaminy C; zob. rozdz. 27 i 44). Reszty hydroksyprolilowe i hydroksylizylowe zapewniają dodatkową zdolność tworzenia wiązań wodorowych, które stabilizują dojrzałe białko. Ponadto transferaza glukozylowa i galaktozylowa dołączają reszty glukozy lub galaktozy do grup hydroksylowych określonych reszt hydroksylizyny.

Środkowa część prekursorowego polipeptydu łączy się następnie z innymi jego cząsteczkami, tworząc charakterystyczną potrójną helisę. Procesowi temu towarzyszy usunięcie globularnego amino- i karboksykońcowego fragmentu prekursorowego polipeptydu wskutek selektywnej proteolizy. Określone reszty lizynowe są także modyfikowane przez oksydazę lizylową, białko związane z jonami miedzi, które przekształca grupy ε-aminowe do aldehydowych. Te aldehydowe grupy mogą ulegać albo kondensacji aldolowej, tworząc wiązania podwójne C=C, albo kondensacji do zasad Schiffa (imin) w wyniku reakcji z grupami ε-aminowymi niezmodyfikowanych reszt lizyny, które następnie ulegają redukcji do pojedynczych wiązań C—N. Wiązania kowalencyjne łączą poprzecznie poszczególne polipeptydy i nadają włóknom kolagenu wyjątkową wytrzymałość oraz sztywność.

Niedobory pokarmowe oraz defekty genetyczne mogą upośledzać dojrzewanie kolagenu

Złożony ciąg wydarzeń w procesie dojrzewania kolagenu stanowi przykład ilustrujący konsekwencje biologiczne niekompletnej dojrzałości polipeptydu. Najlepiej znanym defektem syntezy kolagenu jest szkorbut (gnilec), spowodowany niedoborami pokarmowymi witaminy C, niezbędnej do aktywności hydroksylaz prolilowej i lizylowej. Wynikający z nich brak odpowiedniej liczby reszt hydroksyprolilowych i hydroksylizylowych zaburza trwałość konformacyjną włókien kolagenowych, co prowadzi do krwawień z dziąseł, puchnięcia stawów, upośledzenia gojenia ran, a nawet śmierci. Zespół Menkego, charakteryzujący się silnie poskręcanymi włosami i opóźnieniem wzrostu, odzwierciedla niedobory pokarmowe miedzi niezbędnej do aktywności oksydazy lizylowej, która katalizuje kluczowy etap tworzenia kowalencyjnych połączeń wzmacniających włókna kolagenowe.

Zaburzenia genetyczne syntezy kolagenu obejmują kilka postaci wrodzonej łamliwości kości (osteogenesis imperfecta), charakteryzującej się ich znaczną kruchością. W zespole Ehlersa–Danlosa, tj. grupie zaburzeń tkanki łącznej, która obejmuje upośledzenie spójności struktur podtrzymujących, defekt genów kodujących α kolagen-1, N-peptydazę prokolagenu lub hydroksylazę lizylową, skutkuje upośledzeniem ruchomości stawów lub nieprawidłowościami skóry (zob. rozdz. 50).

STRESZCZENIE

• Białka mogą być klasyfikowane na podstawie ich rozpuszczalności, kształtu cząsteczki, funkcji biologicznej lub obecności grup prostetycznych, takich jak hem.

• Pierwszorzędowa struktura łańcucha polipeptydowego określa jego sekwencję aminokwasową kodowaną przez geny. Struktura drugorzędowa wynika z pofałdowania polipeptydu w motywy strukturalne utrzymywane wiązaniami wodorowymi, takie jak helisa α, struktura β, skręty β i pętle. Kombinacja tych motywów tworzy strukturę naddrugorzędową.

• Struktura trzeciorzędowa określa związki między domenami struktury drugorzędowej. Struktura czwartorzędowa białek składających się z dwóch lub większej liczby łańcuchów polipeptydowych (białka oligomeryczne) dotyczy relacji przestrzennych między tymi łańcuchami.

• Struktury pierwszorzędowe są stabilizowane przez kowalencyjne wiązania peptydowe. Struktury wyższego rzędu są utrzymywane przez słabe oddziaływania – liczne wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne (jonowe) oraz asocjacje hydrofobowych grup R.

• Kąt phi (Φ) w peptydzie to kąt torsyjny wokół wiązania Cα—N, natomiast kąt psi (Ψ) to kąt wokół wiązania Cα—Co. Większość kombinacji kątów phi-psi jest niedozwolona ze względu na przeszkody steryczne. Kąty phi-psi, charakteryzujące helisę α oraz strukturę β, znajdują się – odpowiednio – w dolnej lub górnej lewej ćwiartce diagramu Ramachandrana.

• Fałdowanie białek jest procesem słabo poznanym. W ogólnym zarysie krótkie segmenty nowo zsyntezowanego polipeptydu zwijają się w jednostki struktury drugorzędowej. Siły, które utrzymują regiony hydrofobowe z dala od rozpuszczalnika, przekształcają częściowo zwinięty polipeptyd w „stopioną kulę”, w której moduły struktury drugorzędowej przemieszczają się tak, aby powstała natywna konformacja białka.

• Do białek, które pomagają w fałdowaniu łańcucha polipeptydowego, należą disiarczkowe izomerazy białkowe, izomerazy cis, trans-prolilowe oraz białka opiekuńcze (czaperony), które uczestniczą w procesie fałdowania ponad połowy białek u ssaków. Czaperony chronią nowo zsyntezowane polipeptydy przed kontaktem z rozpuszczalnikiem i zapewniają odpowiednie środowisko elementom struktury drugorzędowej, które wyłaniają się, a następnie scalają w „stopionej kuli”.

• Obecnie prowadzone badania biomedyczne mają na celu opracowanie związków chemicznych, które oddziałują na proces zwijania białek wirusowych i prionowych, jako leki na wirusowe zapalenie wątroby typu C i wiele chorób neurodegeneracyjnych.

• Krystalografia rentgenowska i spektroskopia NMR stanowią kluczowe techniki służące do analizy wyższych poziomów struktury białek.

• Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) ujawniła się jako potężne narzędzie do makromolekularnej analizy dynamiki biologicznych makrocząsteczek w heterogennych próbkach mimo braku rozdzielczości atomowej krystalografii rentgenowskiej czy spektroskopii NMR.

• Patogenne białka prionowe działają autonomicznie, bez udziału DNA lub RNA, powodując śmiertelne zakaźne encefalopatie gąbczaste, takie jak choroba Creutzfeldta–Jakoba, scrapie i gąbczasta encefalopatia bydła. Choroby prionowe wiążą się ze zmianą struktury drugorzędowo-trzeciorzędowej naturalnie występującego białka PrPc. Kiedy PrPc wchodzi w interakcję ze swoją patologiczną izoformą PrPsc, jego konformacja ulega transformacji z dominującej struktury α-helikalnej do struktury harmonijki β, charakterystycznej dla PrPsc.

• Kolagen jest przykładem ścisłego powiązania między strukturą białek i ich funkcją biologiczną. Choroby związane z dojrzewaniem kolagenu obejmują zespół Ehlersa–Danlosa oraz szkorbut, wynikający z niedoboru witaminy C.

PIŚMIENNICTWO

Aguzzi A., de Cecco E.: Shifts and drifts in prion science. Important questions remain unanswered since prions were discovered four decades ago. Science 2020; 370(6512): 32–34.

Bryan-Marrugo O.L., Ramos-Jimenez J., Barrera-Saldana H. i wsp.: History and progress of antiviral drugs: From acyclovir to direct-acting antiviral agents (DAAs) for hepatitis C. Medicina Universit. 2015; 17(68): 165–174.

Callaway E.: Revolutionary cryo-EM is taking over structural biology. Nature 2020; 578(7794): 201.

Gianni S., Jemth P.: Protein folding: Vexing debates on a fundamental problem. Biophys. Chem. 2016; 212: 17–21.

Ito S., Nagata K.: Quality control of procollagen in cells. Annu. Rev. Biochem. 2021; 90: 631–658.

Jiang Y., Kalodimos C.G.: NMR studies of large proteins. J. Mol. Biol. 2017; 429(17): 2667–2676.

Luengo T.M., Mayer M.P., Rudiger S.G.D.: The Hsp70-Hsp90 chaperone cascade in protein folding. Trends Cell. Biol. 2019; 29(2): 164–177.

Papageorgiou A.C., Mattson S.: Protein structure validation and analysis with X-ray crystallography. Meth. Mol. Biol. 2014; 1129: 397–421.

Pastore A., Temussi P.A.: The Emperor’s new clothes: Myths and truths of in-cell NMR. Arch. Biochem. Biophys. 2017; 628: 114–122.

Pennisi E.: Protein structure prediction now easier, faster. Science 2021; 373(6552): 262–263.

Rein T.: Peptidylprolylisomerases, protein folders, or scaffolders? The example of FKBP51 and FKBP52. Bioessays 2020; 42(7): 1900250.

Rosenzweig R., Nillegoda N.B., Mayer M.P., Bukau B.: The Hsp70 chaperone network. Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 2019; 20(11): 665–680.

Yamaguchi K., Kuwata K.: Formation and properties of amyloid fibrils of prion protein. Biophys. Rev. 2018; 10(2): 517–525.

Pytania sprawdzające

Część I – Struktury oraz funkcje białek i enzymów

1. Wybierz jedno z poniższych stwierdzeń, które jest NIEPOPRAWNE.

A. Fermentacja i glikoliza mają wiele wspólnych cech biochemicznych.

B. Ludwik Pasteur jako pierwszy odkrył, że bezkomórkowe preparaty drożdżowe mogą przekształcać cukry w etanol i dwutlenek węgla.

C. Organiczny ortofosforan (Pi) jest niezbędny do glikolizy.

D. ¹⁴C jest ważnym narzędziem do wykrywania produktów pośrednich metabolizmu.

E. Medycyna i biochemia dostarczają wzajemnie się uzupełniających informacji i wyzwań.

2. Wybierz jedno z poniższych stwierdzeń, które jest NIEPOPRAWNE.

A. Pochodna witaminy NAD jest niezbędna do przekształcenia glukozy w pirogronian.

B. Termin „wrodzone błędy metabolizmu” został wprowadzony przez lekarza Archibalda Garroda.

C. Skrawki tkankowe ssaków mogą włączać nieorganiczny amoniak do mocznika.

D. Uświadomienie sobie, że DNA jest podwójną helisą, pozwoliło Watsonowi i Crickowi opisać reakcję łańcuchową polimerazy (PCR).

E. Mutacje genomu „organizmu modelowego” może dać wgląd w procesy biochemiczne.

3. Wyjaśnij, w jaki sposób obserwacja Büchnera na początku XX wieku doprowadziła do odkrycia szczegółów fermentacji.

4. Wymień niektóre z najwcześniejszych odkryć, które nastąpiły po uświadomieniu sobie, że bezkomórkowy preparat z komórek drożdży może katalizować proces fermentacji.

5. Wymień niektóre rodzaje preparatów tkankowych, które biochemicy z początku XX wieku wykorzystywali do badania glikolizy i biosyntezy mocznika oraz do odkrywania roli pochodnych witamin.

6. Opisz, w jaki sposób dostępność izotopów radioaktywnych ułatwiła identyfikację pośrednich produktów metabolicznych.

7. Wymień kilka „wrodzonych błędów metabolizmu” zidentyfikowanych przez lekarza Archibalda Garroda.

8. Podaj przykład z zakresu metabolizmu lipidów, w którym połączenie podejść biochemicznych i genetycznych przyczyniło się do postępu medycyny oraz biochemii.

9. Wymień kilka organizmów modelowych, których genomy można selektywnie modyfikować, aby uzyskać wgląd w procesy biochemiczne.

10. Wybierz jedno z poniższych stwierdzeń, które jest NIEPOPRAWNE.

Skłonność cząsteczek wody do tworzenia wiązań wodorowych między sobą jest głównym czynnikiem odpowiedzialnym za wszystkie następujące właściwości wody Z WYJĄTKIEM:

A. Nietypowo wysokiej temperatury wrzenia.

B. Wysokiego ciepła parowania.

C. Wysokiego napięcia powierzchniowego.

D. Zdolności do rozpuszczania węglowodorów.

E. Rozszerzalności podczas zamarzania.

11. Wybierz jedno z poniższych stwierdzeń, które jest NIEPOPRAWNE.

A. Łańcuchy boczne aminokwasów cysteiny i metioniny absorbują światło o długości fali 280 nm.

B. Glicyna często występuje w regionach, w których polipeptyd tworzy ostre zagięcie, zmieniając kierunek polipeptydu.

C. Polipeptydy są nazywane pochodnymi reszty aminoacylowej C-końcowej.

D. Atomy C, N, O i H wiązania peptydowego są koplanarne.

E. Liniowy pentapeptyd zawiera cztery wiązania peptydowe.

12. Wybierz jedno z poniższych stwierdzeń, które jest NIEPOPRAWNE.

A. Bufory tkanek ludzkich obejmują wodorowęglany, białka i ortofosforany.

B. Słaby kwas lub słaba zasada wykazuje największą pojemność buforową, gdy pH jest równe jego pKa plus lub minus jedna jednostka pH.

C. Wartość izoelektrycznego pH (pI) lizyny można obliczyć za pomocą wzoru (pK₂ + pK₃)/2.

D. Ruchliwość monofunkcyjnego słabego kwasu w polu elektrycznym prądu stałego osiąga maksimum, gdy pH otaczającego go środowiska jest równe jego pKa.

E. Dla uproszczenia moc słabych zasad jest zazwyczaj wyrażana jako pKa sprzężonych z nimi kwasów.

13. Wybierz jedno z poniższych stwierdzeń, które jest NIEPOPRAWNE.

A. Jeśli pKa słabego kwasu wynosi 4,0, 50% cząsteczek będzie w stanie zdysocjowanym, gdy pH otaczającego środowiska wynosi 4,0.

B. Słaby kwas o pKa równym 4,0 będzie skuteczniejszym buforem przy pH 3,8 niż przy pH 5,7.

C. Przy pH równym jego pI polipeptyd nie ma żadnych naładowanych grup.

D. Silne kwasy i zasady są tak nazywane, ponieważ ulegają całkowitej dysocjacji po rozpuszczeniu w wodzie.

E. Na pKa grupy jonizowalnej mogą wpływać właściwości fizyczne i chemiczne otaczającego ją środowiska.

14. Wybierz jedno z poniższych stwierdzeń, które jest NIEPOPRAWNE.

A. Głównym celem proteomiki jest identyfikacja wszystkich białek obecnych w komórce w różnych warunkach, a także stopnia ich modyfikacji.

B. Spektrometria mas w dużej mierze zastąpiła metodę Edmana do sekwencjonowania peptydów i białek.

C. Odczynnik Sangera był ulepszeniem metody Edmana, ponieważ pierwszy generuje nowy koniec aminowy, umożliwiając przeprowadzenie kilku kolejnych cykli sekwencjonowania.

D. Ponieważ masa jest uniwersalną właściwością wszystkich atomów i cząsteczek, spektrometria mas idealnie nadaje się do wykrywania modyfikacji potranslacyjnych w białkach.

E. Spektrometry masowe z analizatorem czasu przelotu wykorzystują zależność F = mA.

15. Dlaczego oliwa z oliwek dodana do wody ma tendencję do tworzenia dużych kropel?

16. Czym różni się mocna zasada od słabej zasady?

17. Wybierz jedno z poniższych stwierdzeń, które jest NIEPOPRAWNE.

A. Chromatografia jonowymienna rozdziela białka na podstawie znaku i wielkości ich ładunku przy danym pH.

B. Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa rozdziela białka najpierw na podstawie ich wartości pI, a następnie na podstawie stosunku ładunku do masy z wykorzystaniem elektroforezy SDS-PAGE.

C. Chromatografia powinowactwa wykorzystuje selektywność oddziaływań białko–ligand do wyizolowania określonego białka ze złożonej mieszaniny.

D. Wiele białek rekombinowanych jest ekspresjonowanych z dodatkową domeną połączoną z ich N- lub C-końcem. Jednym ze wspólnych elementów tych domen fuzyjnych jest miejsce wiązania ligandu zaprojektowane specjalnie w celu ułatwienia oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa.

E. Po oczyszczeniu klasycznymi technikami tandemowa spektrometria mas jest zazwyczaj stosowana do analizy pojedynczych jednorodnych peptydów pochodzących ze złożonej mieszaniny białek.

18. Wybierz jedno z poniższych stwierdzeń, które jest NIEPOPRAWNE.

A. Fałdowanie białek jest wspomagane przez interwencję wyspecjalizowanych białek pomocniczych zwanych białkami opiekuńczymi.

B. Fałdowanie białek ma tendencję do przebiegu modułowego, przy czym najpierw tworzą się obszary lokalnej struktury drugorzędowej, a następnie łączą się w stopioną kulę.

C. Fałdowanie białek jest napędzane przede wszystkim przez termodynamikę cząsteczek wody otaczających powstający polipeptyd.

D. Tworzenie wiązań S–S w dojrzałym białku jest ułatwione przez enzym białkową izomerazę disulfidową.

E. Tylko kilka nietypowych białek, takich jak kolagen, wymaga potranslacyjnego przetwarzania poprzez częściową proteolizę, aby osiągnąć dojrzałą konformację.

19. Oszacuj pI dla polielektrolitu zawierającego trzy grupy karboksylowe i trzy grupy aminowe, którego wartości pKa wynoszą 4,0; 4,6; 6,3; 7,7; 8,9 i 10,2.

20. Wskaż jedną wadę kategoryzacji aminokwasów białkowych jako „niezbędnych” lub „endogennych”?

21. Wybierz jedno z poniższych stwierdzeń, które jest NIEPOPRAWNE.

A. Modyfikacje potranslacyjne białek mogą wpływać zarówno na ich funkcję, jak i na ich los metaboliczny.

B. Natywny stan konformacyjny to zazwyczaj stan preferowany termodynamicznie.

C. Złożone trójwymiarowe struktury większości białek powstają i są stabilizowane przez kumulatywny wpływ dużej liczby słabych oddziaływań.

D. Naukowcy wykorzystują macierze genowe do wysokoprzepustowej analizy obecności i poziomu ekspresji białek.

E. Przykładami słabych oddziaływań stabilizujących fałdowanie białek są wiązania wodorowe, mostki solne i siły van der Waalsa.

22. Wybierz jedno z poniższych stwierdzeń, które jest NIEPOPRAWNE.

A. Zmiany konfiguracji obejmują zerwanie wiązań kowalencyjnych.

B. Zmiany konformacji obejmują rotację jednego lub więcej wiązań pojedynczych.

C. Wykres Ramachandrana ilustruje stopień, w jakim zawada przestrzenna ogranicza dopuszczalne kąty wiązań pojedynczych w szkielecie peptydu lub białka.

D. Tworzenie helisy α jest stabilizowane przez wiązania wodorowe między atomem karboksylowym każdego wiązania peptydowego a grupą N–H kolejnego wiązania peptydowego.

E. W harmonijce β grupy R sąsiednich reszt są skierowane w przeciwnych kierunkach względem płaszczyzny harmonijki.

23. Wybierz jedno z poniższych stwierdzeń, które jest NIEPOPRAWNE.

A. Deskryptor α₂β₂γ₃ oznacza białko z siedmioma podjednostkami trzech różnych typów.

B. Pętle to rozszerzone regiony, które łączą sąsiednie regiony struktury drugorzędowej.

C. Ponad połowa reszt w typowym białku znajduje się w helisach α lub harmonijkach β.

D. Większość harmonijek β ma skręt prawoskrętny.

E. Priony to wirusy wywołujące choroby związane z fałdowaniem białek, atakujące mózg.

24. Jaką zaletę oferuje kwasowa grupa kwasu fosforowego związana z pK₂ w zakresie buforowania w tkankach ludzkich?

25. Stałe dysocjacji dla wcześniej niescharakteryzowanego racemicznego aminokwasu odkrytego w meteorycie zostały określone jako pK₁ = 2,0; pK₂ = 3,5; pK₃ = 6,3; pK₄ = 8,0; pK₅ = 9,8 i pK₇ = 10,9:

A. Jaka karboksylowa lub aminowa grupa funkcyjna byłaby związana z każdą dysocjacją?

B. Jaki byłby przybliżony ładunek netto tego aminokwasu przy pH 2?

C. Jaki byłby przybliżony ładunek netto tego aminokwasu przy pH 6,3?

D. Podczas elektroforezy prądem stałym przy pH 8,5, w kierunku której elektrody ten aminokwas prawdopodobnie by się przemieścił?

26. Bufor biochemiczny to związek, który ma tendencję do opierania się zmianom pH, nawet po dodaniu kwasów lub zasad. Jakie dwie właściwości musi spełniać skuteczny bufor fizjologiczny? Oprócz fosforanu, jakie inne związki fizjologiczne spełniają te kryteria?

27. Wymień dwa aminokwasy, których modyfikacja potranslacyjna nadaje białku istotne nowe właściwości.

28. Wyjaśnij, dlaczego diety ubogie w (1) miedź (Cu) lub (2) kwas askorbinowy prowadzą do niepełnego przetwarzania potranslacyjnego kolagenu.

29. Opisz rolę sekwencji sygnałowych N-końcowych w biosyntezie niektórych białek.

6

Białka: mioglobina i hemoglobina

Peter J. Kennelly, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

CELE

Po zapoznaniu się z treścią tego rozdziału Czytelnik powinien:

• Wskazać najważniejsze podobieństwa i różnice strukturalne między mioglobiną i hemoglobiną.

• Wykreślić krzywe wiązania tlenu przez mioglobinę i hemoglobinę.

• Zidentyfikować wiązania między hemem i globiną w oksymioglobinie i oksyhemoglobinie.

• Wyjaśnić, dlaczego z punktu widzenia funkcji krzywa utlenowania hemoglobiny ma przebieg sigmoidalny, a nie hiperboliczny.

• Wyjaśnić rolę zawady przestrzennej w wiązaniu tlenku węgla przez hemoglobinę.

• Zdefiniować wartość P₅₀ i jej znaczenie w transporcie tlenu.

• Opisać konformacyjne zmiany w hemoglobinie towarzyszące przyłączaniu i odłączaniu tlenu.

• Wyjaśnić rolę 2,3-bisfosfoglicerynianu (2,3-BPG) w wiązaniu i transporcie tlenu.

• Nakreślić rolę hemoglobiny w transporcie CO₂ i protonów oraz towarzyszące temu zmiany pKa odpowiednich grup imidazolowych.

• Opisać wpływ obniżenia pO₂ na strukturę hemoglobiny S (HbS).

• Określić zaburzenia metaboliczne będące konsekwencją α- i β-talasemii.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Dostarczanie tlenu z płuc do tkanek i utrzymanie jego rezerw w celu ochrony przed epizodami niedotlenienia ma dla prawidłowego funkcjonowania organizmu szczególne znaczenie. U ssaków funkcje te realizowane są przez homologiczne białka hemowe: hemoglobinę i mioglobinę. Funkcją mioglobiny, monomerycznego białka mięśni czerwonych, jest magazynowanie tlenu jako rezerwy w stanach jego niedoboru. Z kolei podjednostki hemoglobiny, będącej tetramerycznym białkiem erytrocytów, oddziałują ze sobą w sposób kooperatywny, który umożliwia uwolnienie dużej części związanego tlenu w tkankach obwodowych, jednocześnie zachowując zdolność do skutecznego wiązania go w płucach. Uwalnianie tlenu w tkankach obwodowych jest wzmocnione przez wiązanie 2,3-bisfosfoglicerynianu (2,3-BPG), który stabilizuje czwartorzędową strukturę deoksyhemoglobiny. Cyjanek i tlenek węgla (CO) stanowią śmiertelne zagrożenie, ponieważ zakłócają fizjologiczną funkcję hemoprotein: oksydazy cytochromowej i hemoglobiny.

Oprócz dostarczania O₂ hemoglobina odgrywa kluczową rolę w transporcie produktu ubocznego oddychania, CO₂, do płuc w celu jego usunięcia z organizmu. Wiązanie protonów z hemoglobiną zwiększa konwersję CO₂, głównego produktu oddychania, do rozpuszczalnego w wodzie kwasu węglowego i jego sprzężonej zasady, wodorowęglanu, przez enzym anhydrazę węglanową. W płucach uwalnianie protonów z hemoglobiny wywołane przez O₂ odwraca ten proces, ułatwiając skuteczne usuwanie w postaci gazowego CO₂. Dodatkowo CO₂ jest przenoszony w postaci kowalencyjnie związanych karbaminianów. Hemoglobina i mioglobina znakomicie ilustrują zarówno zależności między strukturą a funkcją białek, jak i molekularne podstawy chorób genetycznych, takich jak niedokrwistość sierpowatokrwinkowa i talasemia.

ZDOLNOŚĆ MAGAZYNOWANIA I TRANSPORTU TLENU WIĄŻE SIĘ Z OBECNOŚCIĄ HEMU I ŻELAZA NA DRUGIM STOPNIU UTLENIENIA

Mioglobina i hemoglobina zawierają hem – mający w swoim składzie żelazo cykliczny tetrapirol złożony z czterech cząsteczek pirolu połączonych mostkami α-metinowymi. Płaski układ sprzężonych wiązań podwójnych pochłania światło widzialne, nadając cząsteczkom hemu głęboko czerwone zabarwienie. Podstawnikami w pozycjach β pierścieni pirolowych hemu są grupy metylowe (M), winylowe (V) i propionianowe (Pr) ułożone w kolejności M, V, M, V, M, Pr, Pr, M (ryc. 6-1). Atom żelaza dwuwartościowego (Fe²⁺⁾ znajduje się w centrum płaskiego tetrapirolu. Utlenianie Fe²⁺ mioglobiny lub hemoglobiny do Fe³⁺ niszczy ich aktywność biologiczną. Inne białka z zawierającymi metale grupami prostetycznymi tetrapirolu obejmują cytochromy (Fe i Cu) i chlorofil (Mg) (zob. rozdz. 31).

Mioglobina zawiera dużą ilość struktury α-helisy

Zmagazynowany w mioglobinie mięśni czerwonych tlen jest uwalniany w warunkach jego niedoboru (np. w przypadku intensywnych ćwiczeń fizycznych) i wykorzystywany w mitochondriach mięśni do aerobowej syntezy ATP (zob. rozdz. 13). Zbudowany ze 153 reszt aminokwasowych łańcuch polipeptydowy mioglobiny (masa cząsteczkowa 17 000) jest silnie upakowaną cząsteczką o wymiarach 4,5 × 3,5 × 2,5 nm (ryc. 6-2).

Rycina 6-1. Hem. Pierścienie pirolowe, węgle mostków metinowych i żelazo (Fe²⁺) leżą praktycznie w jednej płaszczyźnie. Piąte i szóste wiązanie koordynacyjne Fe²⁺ są usytuowane prostopadle do płaszczyzny cząsteczki hemu, znajdując się nad i pod tą płaszczyzną. Na uwagę zasługują grupy metylowe (niebieskie), winylowe (zielone) i propionianowe (pomarańczowe) przy węglach β pierścieni pirolowych, centralnie położony atom żelaza oraz polarne łańcuchy boczne (na pozycji godziny 7), które są zwrócone na zewnątrz cząsteczki mioglobiny.

Rycina 6-2. Struktura trójwymiarowa mioglobiny. Kolor łańcucha polipeptydowego zmienia się zgodnie z barwami światła widzialnego od niebieskiego (N-koniec) do czerwonego (C-koniec). Grupa prostetyczna – hem – ma barwę czerwoną. Regiony α-helikalne są oznaczone literami od A do H. Dystalną (E7) i proksymalną (F8) resztę histydyny uwidoczniono odpowiednio kolorem niebieskim i pomarańczowym. Polarne propionianowe (Pr) grupy hemu są skierowane na zewnątrz cząsteczki.

Źródło: zaadaptowane z Protein Data Bank ID no. 1a6n.

Cechą szczególną tego białka jest występowanie aż 75% łańcucha w formie ośmiu prawoskrętnych, składających się z 7–20 reszt aminokwasowych helis α. Oznacza się je literami od A do H, zaczynając od końca aminowego białka. Na powierzchni cząsteczki mioglobiny, podobnie jak w przypadku innych białek globularnych, znajdują się polarne i naładowane reszty aminokwasowe, natomiast wnętrze cząsteczki zawiera, oprócz dwóch reszt, reszty niepolarne (np. Leu, Val, Phe i Met). Tymi dwoma hydrofilowymi resztami są His E7 i His F8, czyli siódma i ósma reszta aminokwasowa w helisach E i F, które znajdują się w pobliżu żelaza hemowego i biorą udział w wiązaniu tlenu.

Reszty histydyny F8 i E7 odgrywają wyjątkową rolę w wiązaniu tlenu przez mioglobinę

W mioglobinie grupa hemowa znajduje się w zagłębieniu między helisami E i F (zob. ryc. 6-2). Polarne, propionianowe łańcuchy boczne hemu są skierowane na zewnątrz cząsteczki mioglobiny, a jego pozostała część znajduje się w niepolarnym wnętrzu białka. Żelazo piątym wiązaniem koordynacyjnym wiąże się z azotem pierścienia imidazolowego His F8, określanego mianem histydyny proksymalnej. Po drugiej stronie płaszczyzny hemu w stosunku do His F8 znajduje się His E7, określana jako histydyna dystalna.

Atom żelaza przesuwa się w kierunku płaszczyzny hemu po związaniu tlenu

W mioglobinie nieutlenowanej żelazo jest wysunięte o 0,03 nm (0,3 Å) poza płaszczyznę hemu w kierunku His F8. W przypadku utlenowanej mioglobiny, w której O₂ zajmuje szóstą pozycję koordynacyjną, żelazo jest wysunięte poza płaszczyznę hemu o 0,01 nm (0,1 Å). Utlenowaniu mioglobiny towarzyszy więc ruch żelaza w kierunku płaszczyzny hemu, a w konsekwencji i His F8 oraz reszt kowalencyjnie połączonych z His F8.

Apomioglobina stanowi zawadę przestrzenną dla żelaza hemowego

Niewielkie ilości CO mogą powstawać z różnych źródeł biologicznych, w tym z katabolizmu czerwonych krwinek w organizmie człowieka. CO jest również obecny w atmosferze, głównie z powodu niepełnego spalania paliw kopalnych. CO wiąże się z żelazem w wolnej grupie hemowej 25 tysięcy razy silniej niż tlen. Jednak grupy hemowe w apoproteinach mioglobiny i hemoglobiny znajdują się w środowisku utrudniającym ich interakcję z gazowymi ligandami (ryc. 6-3). Gdy CO wiąże się z wolnym hemem, wszystkie trzy atomy (Fe, C i O) leżą prostopadle do płaszczyzny hemu. Taka geometria maksymalizuje nakładanie się wolnej pary elektronów na węglu o hybrydyzacji sp² w cząsteczce CO i żelazie Fe²⁺ (ryc. 6-4, po prawej). Natomiast O₂ ma hybrydyzację sp². W konsekwencji elektrony wiążące się z żelazem leżą pod kątem około 120° do osi podwójnego wiązania O=O (zob. ryc. 6-4, po lewej). W mioglobinie i hemoglobinie dystalna histydyna sterycznie uniemożliwia lub utrudnia preferowaną orientację CO o wysokim powinowactwie, jednocześnie umożliwiając O₂ osiągnięcie najkorzystniejszej orientacji (zob. ryc. 6-3). Wiązanie pod mniej korzystnym kątem, co zmniejsza siłę wiązania hem–CO do około 200 razy większej siły wiązania niż siła wiązania hem–O₂ (zob. ryc. 6-3, po prawej). Dlatego O₂, który występuje w dużym nadmiarze w stosunku do CO, zazwyczaj dominuje. Niemniej jednak około 1% mioglobiny u człowieka występuje w formie związanej z CO.

Rycina 6-3. Wiązanie tlenu i tlenku węgla z żelazem hemu w mioglobinie. Histydyna dystalna E7 stanowi przestrzenną zawadę dla wiązania CO pod preferowanym w stosunku do płaszczyzny hemu kątem (90°).

Rycina 6-4. Orientacja wolnych par elektronów w stosunku do wiązań O=O i C≡O w cząsteczce tlenu i tlenku węgla. W cząsteczce tlenu utworzenie podwójnego wiązania między atomami tlenu zapewnia hybrydyzacja sp² walencyjnych elektronów każdego atomu tlenu. W konsekwencji w cząsteczce tlenu dwa atomy i każda para wolnych elektronów znajdują się w jednej płaszczyźnie, a kąt między nimi wynosi około 120° (strona lewa). W tlenku węgla natomiast oba atomy są połączone trzema wiązaniami, co wymaga hybrydyzacji sp, w której wolne pary elektronów i wiązanie potrójne ułożone są liniowo, a kąt rozdziału równy jest 180° (strona prawa).

KRZYWE WIĄZANIA TLENU PRZEZ MIOGLOBINĘ I HEMOGLOBINĘ OBRAZUJĄ ICH ODMIENNE FUNKCJE FIZJOLOGICZNE

Hiperboliczna zależność między stężeniem, czyli ciśnieniem parcjalnym O₂ (pO₂), a ilością związanego O₂, wyrażoną jako krzywa nasycenia O₂ (ryc. 6-5), wyjaśnia, dlaczego mioglobina jest bardziej odpowiednia do magazynowania O₂ niż do transportu O₂. Mioglobina łatwo wiąże O₂ przy wartościach pO₂ w naczyniach włosowatych płuc (100 mm Hg). Ponieważ jednak mioglobina uwalnia jedynie niewielką część związanego O₂ przy wartościach pO₂ typowych dla aktywnych mięśni (20 mm Hg) lub innych tkanek (40 mm Hg), stanowiłaby ona nieskuteczny nośnik do dostarczania O₂. Niemniej w czasie intensywnego wysiłku fizycznego, gdy pO₂ mięśni obniża się do około 5 mm Hg, dysocjacja O₂ z mioglobiny umożliwia mitochondrialną syntezę ATP, a tym samym kontynuację aktywności mięśni.

Rycina 6-5. Krzywe wiązania tlenu przez hemoglobinę i mioglobinę. Ciśnienie cząstkowe tlenu we krwi tętniczej wynosi około 100 mm Hg; we krwi żylnej około 40 mm Hg; w naczyniach włosowatych pracujących mięśni około 20 mm Hg; minimum niezbędne dla funkcji oksydazy cytochromowej to około 5 mm Hg. Połączenie łańcuchów polipeptydowych w strukturę tetrameryczną (hemoglobina) pozwala na zwiększenie, w porównaniu z pojedynczymi łańcuchami, wydajności dostarczania tlenu.

Źródło: zmodyfikowano i reprodukowano za zgodą z: C.R. Scriver i wsp. (red.): The Molecular and Metabolic Bases of Inherited Disease (wyd. 7), McGraw-Hill, 1995.

Hemoglobina zachowuje się tak, jakby to były dwa białka. Przy wysokim pO₂ w płucach, 100 mm Hg i wyższym, wykazuje wysokie powinowactwo do tlenu, co pozwala jej wiązać tlen z niemal każdym dostępnym żelazem hemowym. Ta forma białka jest powszechnie określana jako R, od hemoglobiny w stanie rozluźnionym. Przy niższych wartościach pO₂ spotykanych w tkankach obwodowych, 40 mm Hg i niższych, hemoglobina wykazuje znacznie niższe pozorne powinowactwo do tlenu. Przejście hemoglobiny do tego stanu o niskim powinowactwie, napiętego lub T, umożliwia jej uwolnienie dużej części tlenu wcześniej wychwyconego w płucach. Ta dynamiczna wymiana między stanami R i T o wysokim i niskim powinowactwie stanowi podstawę sigmoidalnej krzywej wiązania O₂ hemoglobiny.

WŁAŚCIWOŚCI ALLOSTERYCZNE HEMOGLOBINY SĄ KONSEKWENCJĄ JEJ CZWARTORZĘDOWEJ STRUKTURY

Czwartorzędowa struktura hemoglobiny nadaje jej wyjątkowe dodatkowe właściwości, których nie ma monomeryczna mioglobina, co umożliwia temu tetramerycznemu białku odgrywanie unikatowych ról biologicznych w dwukierunkowym transporcie O₂ i CO₂ między płucami i tkankami obwodowymi.

Hemoglobina jest tetramerem

Hemoglobina jest tetramerem składającym się z dwóch par dwóch typów łańcuchów polipeptydowych, czyli podjednostek określanych literami alfabetu greckiego (ryc. 6-6). Główne typy hemoglobiny mają następujący skład tetrameru: α₂β₂ (HbA; podstawowa hemoglobina prawidłowa człowieka dorosłego), α₂γ₂ (HbF; hemoglobina płodowa), α₂βs₂ (HbS; hemoglobina sierpowatych krwinek czerwonych) i α₂δ₂ (HbA₂; hemoglobina prawidłowa człowieka dorosłego, stanowiąca niewielki odsetek Hb całkowitej). Strukturę pierwszorzędową łańcuchów β, γ i δ hemoglobin ludzkich charakteryzuje duża zachowawczość (konserwatywność) ewolucyjna.

Rycina 6-6. Hemoglobina. Struktura nieutlenowanej hemoglobiny z 2,3-bisfosfoglicerynianem (kolor ciemnoniebieski). Dwa łańcuchy α są zaznaczone ciemniejszymi odcieniami kolorów zielonego i niebieskiego, a łańcuchy β – jaśniejszymi odcieniami kolorów zielonego i niebieskiego. Grupy prostetyczne – hemy – uwidocznione są na czerwono.

Źródło: zaadoptowane z Protein Data Bank ID no. 1b86.

Mioglobina i podjednostki β hemoglobiny mają praktycznie identyczną strukturę drugorzędową i trzeciorzędową

Mimo różnic w rodzaju i liczbie reszt aminokwasowych mioglobina i łańcuchy polipeptydowe β hemoglobiny A mają praktycznie taką samą strukturę drugorzędową i trzeciorzędową. Podobieństwo to dotyczy umiejscowienia hemu i regionów helikalnych, jak również obecności aminokwasów o podobnych właściwościach w równoznacznych pozycjach w strukturze pierwszorzędowej. Łańcuch α, chociaż zawiera siedem, a nie osiem odcinków helikalnych, również wykazuje znaczne podobieństwo z mioglobiną.

Utlenowanie hemoglobiny indukuje zmiany konformacji apoproteiny

Hemoglobina wiąże do czterech cząsteczek O₂, jedną na każdy hem w tetramerze. Przyłączenie O₂ przez jeden z hemów ułatwia wiązanie kolejnych cząsteczek O₂ przez pozostałe grupy hemowe (zob. ryc. 6-5). Kooperatywne wiązanie tlenu z hemoglobiną jest właściwością pozwalającą na wiązanie maksymalnej ilości O₂ przy pO₂ w płucach oraz uwalnianie maksymalnej ilości O₂ przy pO₂ panującym w tkankach.

Miarą powinowactwa różnych hemoglobin do tlenu jest wartość P₅₀

Wartość P₅₀ odpowiada ciśnieniu cząstkowemu tlenu, przy jakim nasycenie hemoglobiny tlenem wynosi 50%. Jest ona różna dla różnych organizmów, ale zawsze większa od wartości pO₂ w tkankach. Na przykład wartość P₅₀ dla HbA wynosi 26 mm Hg, podczas gdy dla HbF: 20 mm Hg. Ta różnica umożliwia HbF pobieranie tlenu od HbA krwi matki w obrębie łożyska. Po porodzie HbF przestaje właściwie spełniać swoją funkcję, ponieważ jej duże powinowactwo do O₂ utrudnia jego oddysocjowywanie w tkankach.

Skład podjednostkowy tetrameru hemoglobiny zmienia się podczas rozwoju osobniczego. W okresie płodowym najwcześniej jest syntetyzowany tetramer ς₂ε₂. Pod koniec I trymestru ciąży podjednostki ζ i ε zostają zastąpione przez podjednostki α i γ, tworzące hemoglobinę płodową HbF (α₂γ₂). Chociaż synteza podjednostki β wchodzącej w skład HbA (α₂β₂) rozpoczyna się w III trymestrze ciąży, całkowicie zastępuje ona podjednostkę γ dopiero kilka tygodni po porodzie (ryc. 6-7).

Rycina 6-7. Profil rozwojowy struktury czwartorzędowej hemoglobiny płodu i noworodka.

Źródło: reprodukowano za zgodą z W.F. Ganong, Review of Medical Physiology (wyd. 20), McGraw-Hill, 2001.

Utlenowaniu hemoglobiny towarzyszą duże zmiany konformacji białka

Podczas wiązania pierwszej cząsteczki O₂ do deoksyHb atom żelaza, leżący około 0,04 nm poza płaszczyzną hemu w nieutlenowanej hemoglobinie, wsuwa się w płaszczyznę tetrapirolu, pociągając za sobą histydynę proksymalną (F8) i połączone z nią reszty aminokwasowe (ryc. 6-8). Powoduje to rozerwanie jonowych (solnych) wiązań poprzecznych między końcami karboksylowymi wszystkich czterech podjednostek hemoglobiny. W konsekwencji jedna para podjednostek α/β obraca się w stosunku do drugiej pary o 15°, co skutkuje większym upakowanie cząsteczki (ryc. 6-9). Zasadnicze zmiany w drugo-, trzecio- i czwartorzędowej strukturze białka towarzyszą zatem indukowanemu przez O₂ przejściu hemoglobiny z formy T (taut – naprężona), o małym powinowactwie do tlenu, w formę R (relaxed – rozluźniona), o dużym powinowactwie do tlenu. Zmiany te znacząco zwiększają powinowactwo do O₂ pozostałych nieutlenowanych grup hemowych, gdyż wymagają rozerwania mniejszej liczby wiązań poprzecznych (ryc. 6-10). Kooperatywność hemoglobiny stanowi formę zachowania allosterycznego (gr. allos – „inny”, steros – „przestrzeń”) (zob. rozdz. 19), ponieważ wiązanie O₂ z jednym hemem wpływa na powinowactwo wiązania pozostałych.

Rycina 6-8. Podczas utlenowania atom żelaza wsuwa się w płaszczyznę hemu. Razem z atomem żelaza przemieszczają się reszta histydyny F8 i związane z nią reszty aminokwasowe. Zjawisko to przedstawiono na stronie https://pdb101.rcsb.org/learn/videos/oxygen-binding-in-hemoglobin.

Rycina 6-9. W czasie przejścia formy T do formy R hemoglobiny para podjednostek α₂/β₂ (ciemnoniebieska) obraca się o 15° względem pary podjednostek α₁/β₁ (biała). Oś obrotu jest mimośrodowa, a para α₂/β₂ również nieznacznie przesuwa się w kierunku osi. Na rycinie para α₁/β₁ (biała) jest pokazana jako nieruchoma, podczas gdy para podjednostek α₂β₂ (ciemnoniebieska) zarówno przesuwa się, jak i obraca.

Rycina 6-10. Przejście ze struktury T w strukturę R. Wiązania poprzeczne (niebieskie linie) łączące podjednostki w strukturze T pękają stopniowo wraz z dodawaniem tlenu lub ulegają stopniowemu osłabieniu (falowane niebieskie linie). Przejście z T do R nie następuje po związaniu ustalonej liczby cząsteczek tlenu, lecz staje się bardziej prawdopodobne wraz z wiązaniem kolejnych cząsteczek. Na przejście między tymi dwiema strukturami wpływają protony, dwutlenek węgla, chlorki i 2,3-bisfosfoglicerynian (2,3-BPG); im wyższe ich stężenie, tym więcej tlenu musi zostać związane, aby zainicjować przejście. W pełni utlenowane cząsteczki w strukturze T i całkowicie odtlenione cząsteczki w strukturze R nie są pokazane, ponieważ są niestabilne.

Źródło: zmodyfikowano za zgodą z M.F. Perutz, Hemoglobin structure and respiratory transport. Sci. Am. 1978; 239(6): 92–125.

Hemoglobina pomaga w transporcie CO₂ do płuc

Przemianom metabolicznym w komórkach, a w szczególności procesom energetycznym towarzyszy produkcja CO₂. W związku z tym czerwone krwinki muszą być w stanie efektywnie absorbować CO₂ z tkanek, a następnie uwalniać go do płuc. Dwa kluczowe elementy tego procesu to reakcja anhydrazy węglanowej, która katalizuje hydratację CO₂ z wytworzeniem rozpuszczalnego w wodzie kwasu węglowego, H₂CO₃, oraz kooperatywne przechodzenie hemoglobiny między stanami T i R.

Anhydraza węglanowa przekształca CO₂ w rozpuszczalny w wodzie kwas węglowy i wodorowęglan

Podobnie jak w przypadku O₂, ograniczona rozpuszczalność CO₂ w wodzie przy neutralnym pH sprawia, że samo rozpuszczenie tego gazu we krwi jest całkowicie niewystarczające, aby zaspokoić potrzeby transportowe organizmu. Enzym anhydraza węglanowa, obecny w dużych ilościach w czerwonych krwinkach, katalizuje hydratację cząsteczek CO₂, tworząc rozpuszczalny w wodzie kwas węglowy (H₂CO₃). H₂CO₃ to słaby kwas, który z kolei może dysocjować, tworząc jon wodorowęglanowy, HCO₃⁻, i proton. Ponieważ pKa1 H₂CO₃, wynoszące 6,35, spada poniżej fizjologicznego pH, w czerwonych krwinkach większość wchłoniętego CO₂ jest przenoszona w postaci rozpuszczalnego w wodzie wodorowęglanu.

Wiązanie protonów z hemoglobiną stanu T zwiększa wychwyt CO₂ z tkanek

Kiedy hemoglobina przechodzi ze stanu R do stanu T, w każdym z dwóch łańcuchów β zachodzą zmiany konformacyjne, które prowadzą do utworzenia mostków poprzecznych między łańcuchami bocznymi Asp 94 i His 146. Utworzenie każdego mostka wymaga, aby hemoglobina stanu T związała proton z otaczającego środowiska. Gdy hemoglobina stanu R oddaje związany O₂ tkankom oddechowym, a następnie przechodzi do stanu T, absorpcja tych dwóch protonów buforuje pH zakwaszających się czerwonych krwinek i przesuwa równowagę między H₂CO₃ i HCO₃⁻ na korzyść wodorowęglanu, dodatkowo zwiększając ilość dwutlenku węgla absorbowanego przez czerwone krwinki z tkanek obwodowych.

Hemoglobina w stanie T wiąże dwa protony na tetramer. W tkankach aktywnych metabolicznie stężenie protonów w czerwonych krwinkach wzrasta wraz z akumulacją H₂CO₃. Większa dostępność H⁺ sprzyja z kolei przejściu hemoglobiny do stanu T, zwiększając w ten sposób uwalnianie O₂. Wiązanie protonów przez hemoglobinę w stanie T umożliwia wysokiemu stężeniu CO₂ w tkankach aktywnie oddychających stymulację uwalniania O₂ z hemoglobiny, jednocześnie zwiększając ilość absorbowanego CO₂ poprzez promowanie konwersji kwasu węglowego do wodorowęglanu. W rezultacie przejście do stanu T pomaga złagodzić spadek pH czerwonych krwinek we krwi żylnej wywołany przez CO₂.

Uwolnienie protonów z hemoglobiny w stanie R zwiększa uwalnianie CO₂ w płucach

Po dotarciu do płuc gwałtowny wzrost ciśnienia parcjalnego tlenu powoduje wiązanie O₂ z deoksyhemoglobiną. Wiązanie O₂ z kolei wyzwala przejście hemoglobiny ze stanu T do stanu R. Wynikająca z tego zmiana konformacyjna powoduje rozerwanie mostków poprzecznych w dwóch łańcuchach β i uwolnienie dwóch protonów, uprzednio związanych między Asp 94 a His 146. Po uwolnieniu protony łączą się z wodorowęglanem, zwiększając stężenie kwasu węglowego, co z kolei sprzyja katalizowanej przez anhydrazę węglanową dehydratacji H₂CO₃, tworząc CO₂, który następnie może być wydalany z wydychanym powietrzem (ryc. 6-11). To sprzężenie przejścia hemoglobiny między stanami T i R, w którym pośredniczą protony, z równowagą między CO₂, H₂CO₃ i HCO₃⁻, jest znane jako efekt Bohra.

Rycina 6-11. Efekt Bohra. Powstający w tkankach dwutlenek węgla łączy się z wodą, tworząc kwas węglowy, który dysocjuje do protonu i jonu wodorowęglanowego. Nieutlenowana hemoglobina działa jako bufor, wiążąc protony i transportując je do płuc. W płucach, w wyniku przyłączania tlenu, następuje uwalnianie protonów, które łącząc się z jonem wodorowęglanowym, tworzą kwas węglowy, przekształcany przez anhydrazę węglanową do dwutlenku węgla usuwanego w procesie oddychania.

Dodatkowy CO₂ jest transportowany w postaci karbaminianów hemoglobiny

Około 15% CO₂ we krwi żylnej jest przenoszone przez hemoglobinę w postaci karbaminianów utworzonych z azotami na końcach aminowych jej łańcuchów polipeptydowych:

Tworzeniu karbaminianu towarzyszy zmiana ładunku na końcach aminowych z dodatniego na ujemny, co umożliwia powstawanie oddziaływań elektrostatycznych i tworzenie mostków jonowych (solnych) między łańcuchami α i β. W ramach efektu Bohra wiązanie protonów przez hemoglobinę w stanie T sprzyja tworzeniu karbaminianu, podczas gdy uwolnienie protonu podczas przejścia do stanu R sprzyja rozpadowi karbaminianu i uwalnianiu CO₂.

2,3-bisfosfoglicerynian (2,3-BPG) stabilizuje strukturę T hemoglobiny

Przejście hemoglobiny do stanu T otwiera centralną przestrzeń na styku jej czterech podjednostek, zdolną do wiązania jednej cząsteczki 2,3-bisfosfoglicerynianu, 2,3-BPG (zob. ryc. 6-6). Wiązanie 2,3-BPG sprzyja zatem przejściu ze stanu R do stanu T i dalszemu uwalnianiu związanego O₂, ponieważ powrót do stanu R wymaga rozerwania dodatkowych mostków jonowych utworzonych między 2,3-BPG a Lys EF6, His H21 i końcowymi grupami aminowymi Val NA1 z obu łańcuchów β (ryc. 6-12).

Rycina 6-12. Wiązanie się 2,3-bisfosfoglicerynianu z nieutlenowaną hemoglobiną człowieka. 2,3-BPG oddziałuje z trzema dodatnio naładowanymi grupami każdego z łańcuchów β.

Źródło: zaadaptowano za zgodą z: A. Arnone, X-ray diffraction study of binding 2,3-dipho-sphoglycerate to human deoxyhemoglobin. Nature 1972; 237(5351): 146–149.

2,3-BPG jest syntetyzowany z glikolitycznego produktu pośredniego 1,3-BPG, a reakcja ta jest katalizowana przez dwufunkcyjny enzym syntazę 2,3-bisfosfoglicerynianu/2-fosfatazę (BPGM). 2,3-BPG jest hydrolizowany do 3-fosfoglicerynianu przez aktywność 2-fosfatazy BPGM oraz do 2-fosfoglicerynianu przez drugi enzym, fosfatazę wieloinozytolo-polifosforanową (MIPP). Aktywności tych enzymów, a tym samym stężenie 2,3-BPG w erytrocytach, są wrażliwe na zmiany pH. Zakwaszenie czerwonych krwinek wywołane przez CO₂ stymuluje produkcję 2,3-BPG, co z kolei wzmacnia wpływ protonów pochodzących z kwasu węglowego, przesuwając równowagę R-T na korzyść stanu T i zwiększając ilość O₂ uwalnianego w tkankach obwodowych.

W hemoglobinie płodowej reszta H21 podjednostki γ to Ser, a nie His. Ponieważ Ser nie może tworzyć mostka jonowego, 2,3-BPG wiąże się słabiej z HbF niż z HbA. Słabsza stabilizacja stanu T przez 2,3-BPG wyjaśnia, dlaczego HbF ma większe powinowactwo do O₂ niż HbA.

Adaptacja do dużych wysokości

Przebywaniu człowieka na dużych wysokościach towarzyszą takie zmiany fizjologiczne, jak wzrost liczby erytrocytów, wzrost stężenia hemoglobiny w erytrocytach czy syntezy 2,3-BPG. Wzrost stężenia 2,3-BPG powoduje zmniejszenie powinowactwa HbA do O₂ (wzrost wartości P₅₀) i w konsekwencji zwiększenie zdolności hemoglobiny do uwalniania O₂ w tkankach.

ZIDENTYFIKOWANO WIELE WARIANTÓW STRUKTURALNYCH HEMOGLOBINY

Mutacje genów kodujących łańcuchy α lub β mogą wpływać na biologiczną funkcję hemoglobiny. Przeważająca część ponad 1100 znanych mutantów hemoglobiny ludzkiej, w większości łagodnych i rzadko występujących, nie powoduje jednak objawów klinicznych. Stan, w którym w wyniku mutacji następuje zaburzenie funkcji biologicznej hemoglobiny, określa się mianem hemoglobinopatii. Szacuje się, że ponad 7% ludzi na świecie jest nosicielem mutacji odpowiedzialnych za nieprawidłową hemoglobinę. Informacje i linki dotyczące hemoglobiny człowieka i jej wariantów można znaleźć pod adresem URL http://globin.cse.psu.edu/ (Globin Gene Server). Poniżej przedstawiono wybrane przykłady.

Methemoglobina i hemoglobina M

W przypadku methemoglobinemii żelazo hemowe występuje na trzecim stopniu utlenienia, co uniemożliwia wiązanie i transport O₂. W warunkach prawidłowych za redukcję Fe³⁺ methemoglobiny do Fe²⁺ jest odpowiedzialna reduktaza methemoglobinowa. Występowanie methemoglobiny może być efektem ubocznym utlenienia Fe²⁺ do Fe³⁺ przez takie czynniki jak sulfonamidy, konsekwencją dziedziczenia hemoglobiny M lub obniżonej aktywności reduktazy methemoglobinowej.

W hemoglobinie M reszta histydyny F8 (His F8) jest zastąpiona resztą tyrozyny. Prowadzi to do stabilizacji Fe³⁺ na skutek tworzenia przez nie trwałego połączenia z anionem fenolanowym tyrozyny. W przypadku wariantów hemoglobin M dotyczących łańcuchów α obserwuje się przesunięcie równowagi przejścia R–T w kierunku formy T, zmniejszenie powinowactwa do tlenu i zniesienie efektu Bohra. Natomiast w przypadku wariantów dotyczących łańcuchów β przejście R–T nie ulega zakłóceniu i efekt Bohra jest zachowany.

Mutacje, które sprzyjają tworzeniu się formy R (np. hemoglobina Chesapeake) charakteryzują się zwiększeniem powinowactwa do tlenu. Dostarczanie wskutek tego zbyt małej ilości tlenu do tkanek powoduje hipoksję, która prowadzi do policytemii, czyli zwiększenia liczby erytrocytów.

Hemoglobina S

Hemoglobina S powstaje w wyniku zastąpienia Glu 6 znajdującej się na powierzchni łańcucha β przez Val. Zastąpienie polarnej reszty kwasu glutaminowego niepolarną resztą waliny powoduje powstanie na powierzchni łańcuchów β tzw. lepkich miejsc, występujących zarówno w utlenowanej, jak i nieutlenowanej HbS. Z kolei na powierzchni nieutlenowanej formy T zarówno HbA, jak i HbS występują miejsca komplementarne do „lepkich miejsc”. Powoduje to, że przy niskim pO₂ nieutlenowana HbS polimeryzuje w długie włókna, które się wytrącają. Chociaż nieutlenowana HbA zawiera miejsca komplementarne do „lepkich miejsc”, to jednak jej przyłączenie do HbS uniemożliwia dalsze wydłużanie polimerów na skutek braku na jej powierzchni „lepkich miejsc” sprzyjających dalszemu wiązaniu się cząsteczek Hb (ryc. 6-13). Tworzące się włókna o strukturze helikalnej zniekształcają erytrocyty, które przybierają kształt sierpowaty, i są odpowiedzialne za ich zwiększoną podatność na lizę w zatokach śledzionowych, jak również za inne objawy kliniczne. Niskie pO₂ (pobyt na dużych wysokościach) pogłębia tendencję do polimeryzacji. W leczeniu anemii sierpowatokrwinkowej znajdują zastosowanie indukcja ekspresji hemoglobiny płodowej, prowadząca do zahamowania polimeryzacji HbS, transplantacja komórek macierzystych, a w przyszłości terapia genowa.

Rycina 6-13. Polimeryzacja deoksyhemoglobiny S. Oddysocjowanie tlenu z hemoglobiny S (HbS) powoduje odsłonięcie „lepkich miejsc” (czarne trójkąty) na powierzchni łańcuchów β (ciemnoniebieskie), które oddziałują z miejscami komplementarnymi w łańcuchach β innej cząsteczki deoksyHbS. Wydłużanie się polimerów przerywa deoksyHbA, której łańcuchy β (błękitne) nie zawierają „lepkich miejsc” niezbędnych do wiązania kolejnych cząsteczek HbS.

ZNACZENIE KLINICZNE

Mioglobinuria

Rozległe zmiażdżenie mięśni poprzecznie prążkowanych i uszkodzenie nerek może prowadzić do pojawienia się mioglobiny w moczu. Obecność mioglobiny można stwierdzić również w osoczu w przypadku zawału mięśnia sercowego, chociaż wtedy większe znaczenie diagnostyczne w ocenie uszkodzenia serca ma oznaczanie w surowicy troponin, odpowiednich izoform dehydrogenazy mleczanowej czy kinazy kreatynowej (zob. rozdz. 7).

Niedokrwistości (anemie)

Główną przyczyną niedokrwistości, czyli zmniejszenia liczby krwinek czerwonych lub stężenia hemoglobiny we krwi, jest zaburzenie syntezy hemoglobiny (np. w przypadku niedoboru żelaza; zob. rozdz. 52) lub zaburzenie erytropoezy (np. w przypadku niedoboru kwasu foliowego lub witaminy B₁₂; zob. rozdz. 44). Podstawą rozpoznania jest oznaczenie stężenia hemoglobiny we krwi.

Talasemie

Przyczyną talasemii są zaburzenia genetyczne prowadzące do niedoboru lub całkowitego braku łańcuchów α lub β hemoglobiny. Spośród rozpoznanych ponad 750 różnych mutacji trzy są najbardziej typowe. Dotyczą one łańcucha α (alfa-talasemie) lub łańcucha β (beta-talasemie). Symbol umieszczany w indeksie górnym oznaczenia typu łańcucha wskazuje, że podjednostka w ogóle nie występuje (α⁰ lub β⁰) lub że jej synteza jest obniżona (αˉ lub β–). Poza przeszczepem szpiku leczenie ma charakter objawowy.

Pewne mutanty hemoglobiny powszechnie występują w wielu populacjach, przy czym pacjenci mogą dziedziczyć więcej niż jedną mutację. Wskutek tego choroby związane z hemoglobiną mogą dawać złożony obraz kliniczny. Wykorzystanie analizy DNA w ich diagnozowaniu przedstawiono w rozdziale 39.

Hemoglobina glikowana (HbA1c)

W obecności glukozy wnikającej do erytrocytów hemoglobina ulega nieenzymatycznej glikacji na grupach ε-aminowych reszt lizyny oraz grupach α-aminowych N-końcowej waliny łańcuchów β hemoglobiny. Jest to zupełnie inny proces niż glikozylacja zachodząca przy udziale odpowiednich enzymów (zob. rozdz. 46). Ilość glikowanej pochodnej hemoglobiny, stanowiącej w warunkach prawidłowych około 5%, jest proporcjonalna do stężenia glukozy we krwi. Ponieważ przeciętny okres życia erytrocytów wynosi 120 dni, poziom glikowanej hemoglobiny (HbA1c) odzwierciedla średnie stężenie glukozy we krwi w ciągu 8–12 tygodni. Pomiar HbA1c pozwala więc na ocenę skuteczności leczenia cukrzycy.

STRESZCZENIE

• Mioglobina jest monomerem, a hemoglobina tetrametrem składającym się z dwóch typów podjednostek (α₂β₂ w HbA). Mioglobina i podjednostki hemoglobiny, mimo różnic w strukturze pierwszorzędowej, wykazują prawie identyczną strukturę drugo- i trzeciorzędową.

• Hem to zasadniczo płaski, nieco „ściągnięty”, cykliczny tetrapirol z centralnie położonym Fe²⁺, które jest połączone z atomami azotu czterech pierścieni pirolowych, resztą histydyny F8 oraz w oksyMb i oksyHb także z O₂.

• Krzywa wiązania O₂ dla mioglobiny jest hiperboliczna, natomiast dla hemoglobiny sigmoidalna, na skutek kooperatywności oddziaływania w tetramerze.

• Kooperatywność wynika ze zdolności hemoglobiny do występowania w dwóch różnych stanach konformacyjnych: stanie rozluźnionym (R), w którym wszystkie cztery podjednostki wykazują wysokie powinowactwo do tlenu, oraz stanie napiętym (T), w którym wszystkie cztery podjednostki wykazują niskie powinowactwo do tlenu.

• Wysokie stężenie O₂ w płucach przesuwa równowagę R–T na korzyść stanu R, podczas gdy zakwaszenie czerwonych krwinek powstające w wyniku katalitycznego uwodnienia CO₂ w tkankach obwodowych sprzyja stanowi T. Kooperatywność maksymalizuje zatem zdolność hemoglobiny zarówno do wiązania O₂ przy wartościach pO₂ w płucach, jak i do uwalniania O₂ przy wartościach pO₂ w tkankach.

• Względne powinowactwa różnych hemoglobin do tlenu są wyrażone jako P₅₀, czyli wartość pO₂, przy której stają się one w połowie nasycone O₂. Izoformy hemoglobiny ulegają pełnemu nasyceniu przy wartościach ciśnienia parcjalnego odpowiedniego narządu oddechowego, np. płuc lub łożyska.

• Podczas wiązania tlenu przez hemoglobinę żelazo i histydyna F8 przemieszczają się w kierunku pierścienia hemowego. Wynikające z tego zmiany konformacyjne w tetramerze hemoglobiny powodują rozerwanie kilku wiązań jonowych, uwolnienie związanych protonów i rozluźnienie struktury czwartorzędowej, co zwiększa powinowactwo pozostałych trzech podjednostek do O₂.

• Wiązanie 2,3-BPG w centralnej przestrzeni hemoglobiny w stanie T sprzyja uwalnianiu O₂ w tkankach aktywnie oddychających. Przejście do stanu R powoduje zamknięcie tej przestrzeni i usunięcie 2,3-BPG.

• Hemoglobina wspomaga transport CO₂ z tkanek obwodowych do płuc poprzez tworzenie karbaminianów i efekt Bohra, będący konsekwencją wiązania protonów z hemoglobiną w stanie T, ale nie w stanie R. Wiązanie protonów nasila konwersję CO₂ do rozpuszczalnego w wodzie kwasu węglowego i wodorowęglanu. W płucach uwalnianie protonów z utlenionej hemoglobiny w stanie R sprzyja konwersji wodorowęglanu i kwasu węglowego do wydychanego CO₂.

• W hemoglobinie krwinek sierpowatych (HbS) Val zastępuje Glu 6 w łańcuchu β HbA. Powoduje to powstawanie „lepkich miejsc”, mających swoje miejsca komplementarne w deoksyHb (nieobecne w oksyHb). Przy niskim ciśnieniu O₂ deoksyHbS polimeryzuje, tworząc włókna, które deformują erytrocyty, nadając im kształt sierpowaty.

• α- i β-talasemie są niedokrwistościami, których przyczyną jest upośledzenie syntezy łańcuchów odpowiednio α i β HbA.

PIŚMIENNICTWO

Cho J., King J.S., Qian X. i wsp.: Dephosphorylation of 2,3-bisphosphogylcerate by MIPP expands the regulatory capacity of the Rapoport-Luebering glycolytic shunt. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008; 105(16): 5998–6003.

Costa F.F., Conrad N. (red.): Sickle Cell Anemia. From Basic Science to Clinical Practice. Springer, 2016.

Gros G., Wittenberg B.A., Jue T.: Myoglobin’s old and new clothes: From molecular structure to function in living cells. J. Exp. Biol. 2010; 213(16): 2713–2725.

Henry E.R., Cellmer T., Dunkelberger E.B. i wsp.: Allosteric control of hemoglobin S fiber formation by oxygen and its relation to the pathophysiology of sickle cell disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2020; 117(26): 15 018–15 027.

Piel F.B.: The present and future global burden of the inherited disorders of hemoglobin. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 2016; 30(2): 327–341.

Sigler P.F. (red.): The Molecular Basis of Human Hemoglobin Dysfunction. Elsevier, 2017.

Storz J.F.: Hemoglobin: Insights into Protein Structure, Function, and Evolution. Oxford University Press, 2018.

Thein S.L.: Molecular basis of β thalassemia and potential therapeutic targets. Blood Cells Mol. Dis. 2018; 70: 54–65.

Umbreit J.: Methemoglobin – it’s not just blue: A concise review. Am. J. Hematol. 2007; 82(2): 134–144.

Yuan Y., Tam M.F., Simplaceanu V., Ho C.: New look at hemoglobin allostery. Chem. Rev. 2015; 115(4): 1702–1724.

7

Enzymy: mechanizm działania

Peter J. Kennelly, PhD; Victor W. Rodwell, PhD

CELE

Po zapoznaniu się z treścią tego rozdziału Czytelnik powinien:

• Ocenić i opisać strukturalne relacje między specyficznymi witaminami B i niektórymi koenzymami.

• Przedstawić cztery główne mechanizmy, według których przebiega kataliza z udziałem enzymów i wyjaśnić, jak te mechanizmy się łączą, aby ułatwić katalizę.

• Opisać koncepcję „zamka i klucza” oraz „indukowanego dopasowania” i wyjaśnić, w jaki sposób to drugie ułatwia katalizę.

• Przedstawić podstawowe zasady testów immunoenzymatycznych.

• Opisać, jak połączenie enzymu z aktywnością odpowiedniej dehydrogenazy może ułatwić badanie aktywności danego enzymu.

• Zidentyfikować białka, których pomiar stężenia w osoczu jest wykorzystywany w diagnostyce i prognozowaniu.

• Opisać zastosowanie endonukleaz restrykcyjnych i polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych w wykrywaniu chorób genetycznych.

• Zilustrować wykorzystanie ukierunkowanej mutagenezy do identyfikacji reszty aminokwasowej, która jest zaangażowana w rozpoznanie substratów lub efektorów allosterycznych bądź w mechanizm katalizy.

• Opisać, jak dodatek „metki” za pomocą technologii rekombinacji DNA może ułatwić oczyszczanie białka ulegającego ekspresji z jego sklonowanego genu.

• Omówić zdarzenia, które doprowadziły do odkrycia, że kwasy RNA mogą działać jako enzymy, i krótko opisać ewolucyjną koncepcję „świat RNA”.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Laureat Nagrody Nobla (1946) James Sumner zdefiniował enzym jako „katalizator o dużej masie cząsteczkowej i pochodzeniu biologicznym”. Enzymy katalizują reakcje chemiczne, sprawiając, że życie na Ziemi jest możliwe.Uczestniczą w rozpadzie składników pokarmu w celu dostarczenia energii i chemicznych jednostek budulcowych do wbudowania tych jednostek w białka, DNA, błony, komórki i tkanki, i nadania energii do poruszania się komórek, a także w celu umożliwienia funkcjonowania nerwów i kurczenia się mięśni. Większość enzymów jest białkami. Godne uwagi wyjątki obejmują rybosomalne RNA i garstkę cząsteczek RNA mających aktywność endonukleazy i ligazy nukleotydowej, znanych jako rybozymy. Wiele stanów patologicznych jest bezpośrednią konsekwencją zmian w ilości lub aktywności katalitycznej kluczowych enzymów, wynikających z defektów genetycznych, niedoborów żywieniowych, uszkodzeń tkanek, działania toksyn lub infekcji wirusowych i bakteryjnych (np. Vibrio cholerae). Dlatego zdolność do wykrywania i ilościowego oznaczania aktywności specyficznych enzymów we krwi i innych płynach tkankowych lub ekstraktach komórkowych dostarcza informacji, które pomagają lekarzowi w postawieniu diagnozy i przewidywaniu rokowania w wielu chorobach.

Oprócz roli katalizatorów we wszystkich procesach metabolicznych, imponująca aktywność katalityczna, specyficzność substratowa enzymów pozwala im pełnić unikatowe funkcje w procesach związanych ze zdrowiem i dobrym samopoczuciem człowieka. Proteazy i amylazy zwiększają skuteczność detergentów w usuwaniu brudu i plam, a inne enzymy mogą uczestniczyć w stereospecyficznej syntezie złożonych leków lub antybiotyków.

ENZYMY SĄ EFEKTYWNYMI I WYSOCE SPECYFICZNYMI KATALIZATORAMI

Enzymy, które katalizują przekształcenie jednego lub większej liczby związków (substratów) w jeden lub kilka różnych związków (produktów), zwiększają szybkość reakcji, w porównaniu z odpowiednią reakcją niekatalizowaną od 10⁶ do 10⁹ razy, a nawet bardziej. Chociaż niektóre enzymy ulegają modyfikacjom w trakcie katalizy, zmiany te są przejściowe i zostają odwrócone w trakcie przebiegu reakcji.

Enzymy są katalizatorami nie tylko wysoce efektywnymi, lecz także selektywnymi. Typowe katalizatory stosowane w chemii syntetycznej są specyficzne dla rodzaju katalizowanej reakcji i działają na dowolny związek zawierający odpowiednią grupę funkcyjną. Enzymy natomiast są zazwyczaj specyficzne dla pojedynczego substratu lub nawet jednego stereoizomeru, np. D-, ale nie L-cukrów, czy L-, ale nie D-aminokwasów. Ponieważ enzymy wiążą substraty przynajmniej w „trzech punktach przyłączenia” (ryc. 7-1), mogą nawet przekształcać niechiralne substraty w chiralne produkty. Zilustrowano, dlaczego enzym katalizujący redukcję niechiralnego substratu pirogronianu tworzy raczej L-mleczan niż mieszaninę racemiczną D- i L-mleczanu. Wysoka specyficzność enzymów nadaje żyjącym komórkom zdolność równoczesnego prowadzenia i niezależnej kontroli szerokiego spektrum procesów biochemicznych.

Rycina 7-1. Planarny model „trójpunktowego przyłączania” substratu do miejsca aktywnego enzymu. Chociaż atomy 1 i 4 są identyczne, przyłączenie atomów 2 i 3 do ich komplementarnych miejsc na enzymie powoduje, że tylko atom 1 może tworzyć wiązanie. W ten sposób raz przyłączone do enzymu pozornie identyczne atomy mogą być odróżnialne, co pozwala na stereospecyficzną chemiczną zmianę.

ENZYMY SĄ KLASYFIKOWANE WEDŁUG TYPU REAKCJI

Niektóre nazwy enzymów opisanych w najwcześniejszym okresie rozwoju biochemii pozostają w użyciu do dziś (np. pepsyna, trypsyna i amylaza). Niemniej w większości przypadków biochemicy określali nowo odkryte enzymy przez dodanie końcówki -aza jako wskaźnika typu katalizowanej reakcji. Na przykład enzymy, które usuwają atomy wodoru, są określane jako dehydrogenazy, enzymy, które hydrolizują białka – jako proteazy, a enzymy, które katalizują zmianę w konfiguracji – jako izomerazy. Nazwę mogą poprzedzać określenia wskazujące substrat (oksydaza ksantynowa), źródło enzymu (rybonukleaza trzustkowa), jego regulację (lipaza wrażliwa na hormon) lub cechę jego mechanizmu działania (proteaza cysteinowa). W razie potrzeby są dodawane cyfrowo-literowe opisy, aby zidentyfikować liczne formy enzymu (np. RNA polimeraza III, kinaza białkowa Cβ).

W miarę zwiększania się liczby odkrywanych enzymów wcześniej przyjęte zasady skutkowały pojawianiem się licznych nazw dla tego samego enzymu i podwajaniem nazw enzymów wykazujących podobne zdolności katalityczne.

Aby uniknąć niejasności, Międzynarodowa Unia Biochemiczna (International Union of Biochemistry, IUB) opracowała jednoznaczny system nazewnictwa enzymów, w którym każdy enzym ma unikatową nazwę oraz numer kodu określający typ katalizowanej reakcji i jej substraty. Enzymy są podzielone na sześć klas:

1. Oksydoreduktazy – enzymy, które katalizują reakcje utleniania i redukcji.

2. Transferazy – enzymy, które katalizują przenoszenie takich jednostek, jak reszty glikozylowe, grupy metylowe czy fosforanowe.

3. Hydrolazy – enzymy, które katalizują hydrolityczne rozszczepienie wiązań C—C, C—O, C—N i innych.

4. Liazy – enzymy, które katalizują rozszczepienie wiązań C—C, C—O, C—N i innych przez eliminację atomu i pozostawienie podwójnego wiązania.

5. Izomerazy – enzymy, które katalizują geometryczne lub strukturalne zmiany w obrębie cząsteczki.

6. Ligazy – enzymy, które katalizują wiązanie się dwóch cząsteczek połączone z hydrolizą ATP.

Systematyczna nazwa heksokinazy według systemu IUB to ATP: D-heksozo 6-fosfotransferaza E.C.2.7.1.1. Nazwa ta identyfikuje heksokinazę jako enzym klasy 2 (transferazy), podklasy 7 (przeniesienie grupy fosforanowej), podpodklasy 1 (grupa alkoholowa jest akceptorem reszty fosforanowej), a człon „heksozo-6” wskazuje, że fosforylacji ulega grupa alkoholowa przy atomie węgla 6 heksozy.

Mimo że system zaproponowany przez IUB jest przejrzysty i jednoznaczny, nazwy są długie i dość niewygodne. Dlatego wciąż nazywamy ten enzym heksokinazą, a wiele innych enzymów – stosując tradycyjne, chociaż czasem nieprecyzyjne nazwy.

GRUPY PROSTETYCZNE, KOFAKTORY I KOENZYMY ODGRYWAJĄ WAŻNE ROLE W KATALIZIE

Wiele enzymów zawiera małe niebiałkowe cząsteczki i jony metali, które bezpośrednio uczestniczą w przyłączaniu substratu lub katalizie. Nazwano je grupami prostetycznymi, kofaktorami i koenzymami; rozszerzają one możliwości katalityczne enzymu, wynikające z właściwości reszt aminokwasowych występujących w jego łańcuchach peptydowych.

Grupy prostetyczne

Grupy prostetyczne są silnie i stabilnie wbudowane w strukturę białka za pośrednictwem wiązań kowalencyjnych lub niekowalencyjnych. Przykłady obejmują fosforan pirydoksalu, mononukleotyd flawinowy (FMN), dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD), difosforan tiaminy, biotynę oraz jony metali przejściowych. takich jak Fe, Co, Cu, Mg, Mn i Zn. Jony metali, które uczestniczą w reakcjach redoks, zazwyczaj wchodzą w skład grup prostetycznych, takich jak hem lub centrum żelazo-siarkowe (zob. rozdz. 10). Metale mogą także ułatwiać przyłączanie i orientację substratów, tworzenie wiązań kowalencyjnych z produktami pośrednimi reakcji (Co²⁺ w koenzymie B₁₂; zob. rozdz. 44) bądź działać jako kwasy lub zasady Lewisa, aby uczynić substraty bardziej elektrofilowymi (ubogimi w elektrony) lub nukleofilowymi (bogatymi w elektrony), a w ten sposób bardziej reaktywnymi (zob. rozdz. 10).

Kofaktory asocjują odwracalnie z enzymami lub substratami

Kofaktory pełnią funkcje podobne do funkcji grup prostetycznych, z tym że przyłączają się w sposób przejściowy mogący ulec dysocjacji. W przeciwieństwie do stabilnie zasocjowanych grup prostetycznych kofaktory muszą być więc obecne w środowisku otaczającym enzym, aby zaszła kataliza. Najbardziej powszechnymi kofaktorami są także jony metali. Enzymy, które wymagają jonu metalu jako kofaktora, są nazywane enzymami aktywowanymi przez metale, aby odróżnić je od metaloenzymów, dla których jony metalu służą jako grupy prostetyczne. Szacuje się, że około 1/3 wszystkich enzymów należy do jednej z tych dwóch grup.

Wiele koenzymów, kofaktorów i grup prostetycznych to pochodne witamin z grupy B

Rozpuszczalne w wodzie witaminy B stanowią ważne komponenty wielu koenzymów. Nikotynamid jest składnikiem koenzymów reakcji biologicznego utleniania i redukcji – NAD⁺ i NADP⁺ (ryc. 7-2), a ryboflawina jest składnikiem koenzymów redoks FMN i FAD. Kwas pantotenowy jest komponentem przenośnika grup acylowych – koenzymu A. Tiamina w formie pirofosforanu uczestniczy w dekarboksylacji ketokwasów, a kwas foliowy i kobamid biorą udział jako koenzymy w metabolizmie ugrupowań monowęglowych. Wiele koenzymów zawiera ponadto reszty adeniny, rybozy i resztę fosforanową AMP lub ADP (ryc. 7-2).

Rycina 7-2. Struktura NAD⁺ i NADP⁺. W NAD⁺ OR = OH, w NADP⁺ OR = OPO₃2–.

Koenzymy służą jako transportery substratów

Koenzymy odgrywają rolę odnawiających się transporterów – czyli czynników przenoszących grupy funkcyjne – które transportują wiele substratów z miejsca ich tworzenia do miejsca ich wykorzystania. Funkcja tych transporterów jest dwojaka. Po pierwsze, stabilizują substraty, takie jak atomy wodoru (FADH₂) lub jony wodorkowe (NADH), które są zbyt reaktywne, aby pozostawały przez długi czas w obecności wody lub cząsteczek organicznych dostających się do komórki. Po drugie, zwiększają liczbę punktów kontaktu między substratem a enzymem, co zwiększa powinowactwo i swoistość, z jaką małe grupy chemiczne, takie jak octan (koenzym A), glukoza (UDP) lub jony wodorkowe (NAD⁺), są wiązane przez ich docelowe enzymy. Do innych ugrupowań chemicznych transportowanych przez koenzymy zaliczają się grupy metylowe (foliany) i oligosacharydy (dolichol).

KATALIZA ZACHODZI W MIEJSCU AKTYWNYM

Ważne ustalenie dotyczące katalizy enzymatycznej z początku XX wieku powstało na podstawie obserwacji, że obecność substratu czyni enzymy bardziej odpornymi na denaturujący efekt podwyższonej temperatury. Ta obserwacja doprowadziła Emila Fischera do stwierdzenia, że enzymy (E) i ich substraty (S) wchodzą ze sobą w interakcję, tworząc kompleks enzym–substrat (ES), którego stabilność termiczna jest większa niż samego enzymu. Odkrycie to silnie wpłynęło na nasze rozumienie zarówno natury chemicznej, jak i kinetyki katalizy enzymatycznej.

Fischer dowodził, że wybitnie wysoka specyficzność, z jaką enzymy odróżniają swoje substraty, kiedy tworzą kompleks ES, jest analogiczna do sposobu, w jaki zamek mechaniczny rozpoznaje właściwy klucz. Analogia do enzymów polega na tym, że „zamek” jest utworzony przez szczelinę lub kieszeń na powierzchni enzymu, określane jako miejsce aktywne (zob. ryc. 5-6 i 5-8). Jak wskazuje przymiotnik „aktywne”, miejsce aktywne jest czymś więcej niż prostym miejscem rozpoznania dla przyłączenia substratów. Dostarcza ono środowiska, gdzie zachodzi transformacja chemiczna. W obrębie miejsca aktywnego substraty znajdują się bardzo blisko jeden drugiego, w optymalnym ułożeniu z kofaktorami, grupami prostetycznymi i łańcuchami aminokwasów, które uczestniczą w katalizowanej transformacji substratów do produktów (ryc. 7-3). Kataliza jest następnie intensyfikowana przez zdolność miejsca aktywnego do ochrony substratów przed wodą i generowania środowiska, którego polarność, hydrofobowość, kwasowość lub zasadowość mogą znacznie różnić się od środowiska otaczającej cytoplazmy.

Rycina 7-3. Dwuwymiarowy schemat połączenia dipeptydowego substratu – glicylotyrozyny – w obrębie aktywnego miejsca karboksypepydazy A.

ENZYMY KORZYSTAJĄ Z ROZMAITYCH MECHANIZMÓW, ABY UŁATWIĆ KATALIZĘ

W celu znacznego przyspieszenia reakcji chemicznych enzymy wykorzystują różne kombinacje czterech głównych mechanizmów.

Kataliza przez sąsiedztwo

Aby mogła nastąpić reakcja, cząsteczki muszą się znajdować w odległości wystarczającej do utworzenia wiązania. Jeśli ich stężenie będzie największe, będą się one dużo częściej ze sobą spotykały i większa będzie szybkość ich reakcji. Kiedy enzym przyłącza cząsteczki substratu w swoim miejscu aktywnym, powstaje region, w którym lokalne stężenie substratu jest wysokie i w którym cząsteczki substratu są ułożone w pozycji idealnej do ich chemicznej interakcji.

To sprawia, że szybkość reakcji zwiększa się przynajmniej tysiąckrotnie w porównaniu z taką samą reakcją niekatalizowaną enzymatycznie.

Kataliza kwasowo-zasadowa

Poza zwiększaniem zdolności miejsca aktywnego do przyłączenia substratów, zdolne do jonizacji grupy funkcyjne łańcuchów bocznych aminokwasów i (jeśli są obecne) grupy prostetyczne biorą udział w katalizie, działając jako kwasy lub jako zasady. Wyróżnia się dwa typy katalizy kwasowo-zasadowej. Kataliza specyficzna kwasowo lub specyficzna zasadowo dotyczy reakcji, w których tylko uczestniczący kwas lub zasada są protonami lub jonami wodorotlenkowymi. Szybkość reakcji jest wrażliwa na zmiany stężenia protonów lub jonów wodorotlenkowych, ale nie zależy od stężenia innych kwasów (donorów protonu) bądź zasad (akceptorów protonu), występujących w roztworze lub w miejscu aktywnym. Reakcje, których szybkości są wrażliwe na wszystkie obecne kwasy lub zasady, podlegają katalizie ogólnej kwasowej lub zasadowej.

Kataliza przez odkształcenie cząsteczki substratu

Podczas katalizy reakcji litycznych, polegających na rozrywaniu wiązania kowalencyjnego, enzymy zazwyczaj wiążą swoje substraty w konformacji, która osłabia wiązanie przeznaczone do rozszczepienia poprzez fizyczne naprężenie i polaryzację elektronową. Konformacja o dużych naprężeniach naśladuje tę występującą w pośrednich stanach przejściowych, które reprezentują stan przejściowy lub punkt w połowie drogi transformacji substratów do produktów. Utworzone w wyniku tego obszary naprężenia zniekształcają docelowe wiązanie, osłabiając je i czyniąc bardziej podatnym na rozerwanie.

Laureat Nagrody Nobla Linus Pauling jako pierwszy sugerował rolę stabilizacji stanu przejściowego jako głównego mechanizmu, dzięki któremu enzymy przyspieszają szybkość reakcji chemicznych.

Znajomość stanu przejściowego reakcji katalizowanej enzymatycznie jest często wykorzystywana przez chemików do opisu i tworzenia bardziej efektywnych inhibitorów enzymów, zwanych analogami stanu przejściowego, jako potencjalnych farmakoforów.

Kataliza kowalencyjna

Proces katalizy kowalencyjnej obejmuje tworzenie wiązania kowalencyjnego między enzymem i co najmniej jednym substratem. Zmodyfikowany enzym staje się wtedy reagentem. Kataliza kowalencyjna wprowadza nowy szlak reakcji, którego energia aktywacji jest niższa – i dzięki temu szlak jest szybszy – niż szlaku reakcji w jednorodnym roztworze. Chemiczna modyfikacja enzymu jest przejściowa. Po zakończeniu reakcji enzym powraca do swego oryginalnego, niezmodyfikowanego stanu. Jego rola pozostaje zatem katalityczna. Kataliza kowalencyjna jest szczególnie powszechna wśród enzymów, które katalizują reakcje przenoszenia grup. W katalizie kowalencyjnej najczęściej biorą udział reszty aminokwasowe cysteiny i seryny, rzadziej histydyny. Kataliza kowalencyjna zazwyczaj wykorzystuje mechanizm „ping-pong”, czyli taki, w którym pierwszy substrat jest przyłączany i jego produkt uwalniany przed przyłączeniem drugiego substratu (ryc. 7-4).

Rycina 7-4. Mechanizm „ping-pong” transaminacji. E-CHO i E-CH₂NH₂ oznaczają, odpowiednio, kompleksy enzym–fosforan pirydoksalu i enzym–pirydoksamina. Ala – alanina; Glu – glutaminian; KG – α-ketoglutaran; Pyr – pirogronian.

SUBSTRATY INDUKUJĄ KONFORMACYJNE ZMIANY W ENZYMACH

Chociaż „model klucza i zamka” Fischera tłumaczy znakomitą specyficzność interakcji enzym–substrat, to jednak zakładana sztywność miejsca aktywnego enzymu uniemożliwia dynamiczne zmiany towarzyszące transformacjom katalitycznym. Wolny od tego ograniczenia jest zaproponowany przez Daniela Koshlanda model indukowanego dopasowania, który zakłada, że zbliżenie substratów do enzymu indukuje zmianę konformacyjną, co można porównać do umieszczenia ręki (substrat) w rękawiczce (enzym) (ryc. 7-5). W efekcie enzym indukuje wzajemne zmiany w substratach, wykorzystując energię przyłączenia na ułatwienie transformacji substratów w produkty. Model indukowanego dopasowania został wielokrotnie potwierdzony w biofizycznych badaniach ruchu enzymu podczas przyłączania substratu.

Rycina 7-5. Dwuwymiarowy schemat modelu Koshlanda indukowanego dopasowania aktywnego miejsca liazy. Przyłączenie substratu A–B indukuje konformacyjne zmiany w enzymie, które odpowiednio ustawiają reszty katalityczne, uczestniczące w katalizie, i powodują powstanie naprężeń w wiązaniu między A i B, ułatwiając jego rozerwanie.

PROTEAZA HIV DZIAŁA WEDŁUG MECHANIZMU KATALIZY KWASOWO-ZASADOWEJ

Enzymy z rodziny proteaz asparaginianowych, która obejmuje enzym trawienny pepsynę, lizosomalne katepsyny i proteazę produkowaną przez wirus ludzkiego zespołu nabytego upośledzenia odporności (human immunodeficiency virus, HIV), mają wspólny mechanizm katalizy. W katalizie biorą udział dwie zachowawcze (konserwatywne) reszty asparaginianowe, które działają jako katalizatory kwas–zasada. Na pierwszym etapie reakcji reszta asparaginianowa, działająca jako ogólna zasada (Asp X; ryc. 7-6), pobiera proton z cząsteczki wody, aby uczynić ją bardziej nukleofilową. Powstały nukleofil atakuje elektrofilowy atom węgla grupy karbonylowej wiązania peptydowego stanowiącego cel hydrolizy, w wyniku czego tworzy się tetraedryczny pośredni stan przejściowy. Druga reszta kwasu asparaginowego (Asp Y; ryc. 7-6) ułatwia wtedy rozpad tego tetraedrycznego intermediatu przez dodanie protonu do grupy aminowej, utworzonej wskutek rozerwania wiązania peptydowego. Dwie różne reszty kwasu aparaginowego miejsca aktywnego mogą działać jednocześnie jako zasada lub jako kwas, ponieważ ich najbliższe otoczenie faworyzuje jonizację jednego, ale nie drugiego.

Rycina 7-6. Mechanizm katalizy z udziałem proteazy asparaginianowej – proteazy HIV. Zakrzywione strzałki wskazują kierunki przepływu elektronu. 1 Reszta asparaginianu X działa jako zasada, aby zaktywować cząsteczkę wody, usuwając proton. 2 Zaktywowana cząsteczka wody atakuje wiązanie peptydowe, tworząc przejściowy tetraedryczny intermediat. 3 Reszta kwasu asparaginowego Y działa jako kwas, aby ułatwić rozerwanie tetraedrycznego intermediatu i uwolnić rozszczepione produkty przez dodanie protonu do nowo tworzącej się grupy aminowej. Przejście protonu z Asp X na Asp Y przywraca proteazę do jej stanu wyjściowego.

CHYMOTRYPSYNA I FRUKTOZO-2,6-BISFOSFATAZA JAKO PRZYKŁADY KATALIZY KOWALENCYJNEJ

Chymotrypsyna

Wprawdzie kataliza z udziałem proteaz asparaginianowych jest związana z bezpośrednim hydrolitycznym atakiem wody na wiązanie peptydowe, jednak kataliza z udziałem proteazy serynowej – chymotrypsyny, wymaga najpierw utworzenia intermediatu – acyloenzymu. Konserwatywna reszta serynowa, seryna 195, jest aktywowana przez interakcję z histydyną 57 i asparaginianem 102. Reszty te, odległe od siebie w strukturze pierwszorzędowej, w miejscu aktywnym dojrzałego, pofałdowanego białka znajdują się jedna od drugiej w odległości równej wiązaniu. Ułożone w kolejności Asp 102-His 57-Ser 195 stanowią sieć przekazu ładunku, która działa jako transporter protonowy.

Przyłączenie substratu zapoczątkowuje przesunięcia protonów, a w rzeczywistości transfer protonu grupy wodorotlenkowej Ser 195 na Asp 102 (ryc. 7-7). Dzięki zwiększonej w ten sposób nukleofilowości atomu tlenu reszty seryny jego atak na atom węgla grupy karbonylowej wiązania peptydowego substratu jest ułatwiony, tworzy się zatem pośredni kowalencyjny addukt acylo-enzym. Proton z Asp 102 przemieszcza się przez His 57 na grupę aminową, która uwalnia się, gdy zostaje rozerwane wiązanie peptydowe. Część pierwotnego peptydu z wolną grupą aminową opuszcza wtedy miejsce aktywne i jest zastępowana cząsteczką wody. „Sieć przekazu ładunku” znów aktywuje cząsteczkę wody, usuwając proton poprzez His 57 do Asp 102. Powstający jon wodorotlenkowy atakuje acyloenzym, a odwrócony transporter protonowy przywraca proton na Ser 195, odtwarzając w ten sposób stan wyjściowy. Tak więc, mimo że chymotrypsyna ulega modyfikacji w procesie katalizy, to jednak powraca do wyjściowej struktury po zakończeniu reakcji. Proteazy, trypsyna i elastaza, działają według podobnego mechanizmu katalitycznego, ale reszty aminokwasowe Ser-His-Asp stanowiące ich „protonowy transporter” są inne.

Rycina 7-7. Kataliza z udziałem chymotrypsyny. 1 System przekazu ładunku usuwa proton z Ser 195, czyniąc ją bardziej nukleofilową. 2 Aktywowana Ser 195 atakuje wiązanie peptydowe, tworząc przejściowy tetraedryczny intermediat. 3 Uwolnienie peptydu z końca aminowego jest ułatwione dzięki dodaniu protonu do nowo tworzącej się grupy aminowej przez His 57 systemu przekazu ładunku; w rezultacie powstaje intermediat acyl-Ser 195. 4 His 57 i Asp 102 współdziałają w aktywacji cząsteczki wody, która atakuje acyl-Ser 195, tworząc drugi tetraedryczny intermediat. 5 System przekazu ładunku przenosi proton na Ser 195, co ułatwia rozerwanie tetraedrycznego intermediatu w celu uwolnienia peptydu z końca karboksylowego 6.

Fruktozo-2,6-bisfosfataza

Fruktozo-2,6-bisfosfataza, regulatorowy enzym glukoneogenezy (zob. rozdz. 19), katalizuje hydrolityczne uwolnienie fosforanu z atomu węgla-2 fruktozo-2,6-bisfosforanu. Na rycinie 7-8 zilustrowano rolę siedmiu reszt miejsca aktywnego. Kataliza angażuje „katalityczną triadę”, złożoną z jednej reszty glutaminianu i dwóch reszt histydyny, oraz kowalencyjny intermediat fosfohistydylowy.

Rycina 7-8. Kataliza z udziałem fruktozo-2,6-bisfosfatazy. (1) Lys 356 i Arg 257, 307 i 352 stabilizują poczwórny ujemny ładunek substratu przez oddziaływanie ładunek–ładunek. Glu 327 stabilizuje dodatni ładunek na His 392. (2) Nukleofilowa His 392 atakuje wiązanie C-2–grupa fosforanowa i przenosi ją na His 258, tworząc ufosforylowany enzym. Fruktozo-6-fosforan opuszcza enzym. (3) Nukleofilowy atak cząsteczki wody prawdopodobnie wspomagany przez Glu 327, działający jako zasada, powoduje tworzenie nieorganicznego fosforanu. (4) Nieorganiczny ortofosforan jest uwalniany z Arg 257 i Arg 307.

Źródło: opracowano na podstawie S.J. Pilkis, T.H. Claus, I.J. Kurland, A.J. Lange, 6-Phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase: A metabolic signaling enzyme. Annu. Rev. Biochem. 1995; 64: 799 © 1995 Annual Reviews, www. annualreviews.org.

RESZTY MIEJSC KATALITYCZNYCH SĄ WYSOCE KONSERWATYWNE

Przedstawiciele rodziny enzymów, takich jak proteazy asparaginianowe lub serynowe, działają na różne substraty. Większość rodzin enzymów powstaje na skutek duplikacji genów, co tworzy drugą kopię genu, która koduje pojedynczy enzym. Białka kodowane przez dwa geny mogą ewoluować niezależnie, tworząc różne homologi, które rozpoznają różne substraty. Ich przykłady to chymotrypsyna, która rozszczepia wiązania peptydowe od strony grupy karboksylowej aminokwasów z dużymi hydrofobowymi resztami bocznymi, i trypsyna, która rozrywa wiązania peptydowe od strony grupy karboksylowej aminokwasów zasadowych. Białka, które wywodzą się od wspólnego przodka, są wobec siebie homologiczne. Na podstawie obecności specyficznych reszt aminokwasowych w tej samej pozycji w strukturze każdego przedstawiciela rodziny można wywnioskować o wspólnym przodku enzymów. Reszty te są określane resztami konserwatywnymi.

IZOENZYMY STANOWIĄ ODMIENNE FORMY ENZYMU, KTÓRE KATALIZUJĄ TĘ SAMĄ REAKCJĘ CHEMICZNĄ

Organizmy wyższe często wytwarzają wiele fizycznie odmiennych form danego enzymu, z których każda katalizuje taką samą reakcję. Podobnie jak przedstawiciele innych rodzin białek, te białkowe katalizatory, czyli izoenzymy, powstają w wyniku duplikacji genów lub w wyższych eukariotach, alternatywnego składania mRNA (zob. rozdz. 36). Mimo że opisane powyżej proteazy mają różne substraty, izoenzymy mogą wykazywać subtelne różnice we właściwościach, takich jak wrażliwość na poszczególne czynniki regulatorowe (zob. rozdz. 9) lub lokalizacja subkomórkowa, co dostosowuje je do specyficznych tkanek lub warunków, a nie do odmiennych substratów. Izoenzymy, które katalizują identyczną reakcję, mogą także ułatwiać przeżycie organizmu przez dostarczenie rezerwowych kopii podstawowego enzymu.

AKTYWNOŚĆ KATALITYCZNA ENZYMÓW UMOŻLIWIA ICH DETEKCJĘ

Występowanie enzymów w komórkach w stosunkowo małych ilościach sprawia, że stwierdzenie ich obecności i określenie stężenia jest dość skomplikowane. Niemniej zdolność do szybkiego przekształcenia tysięcy cząsteczek specyficznego substratu do produktów daje każdemu enzymowi sposobność do ujawnienia swojej obecności. Analiza katalitycznej aktywności enzymów jest często wykorzystywana w badaniach podstawowych i klinicznych. W odpowiednich warunkach (zob. rozdz. 8) szybkość reakcji katalitycznej, która jest monitorowana, jest proporcjonalna do ilości obecnego enzymu, co pozwala wnioskować na temat jego stężenia. Testy aktywności katalitycznej enzymów są często stosowane zarówno w badaniach naukowych, jak i w laboratoriach klinicznych.

Enzymologia pojedynczej cząsteczki

Czułość tradycyjnych metod analizy enzymów jest ograniczona, dlatego trzeba użyć dużej grupy lub zespołu cząsteczek enzymu, aby otrzymać mierzalną ilość produktu. Uzyskane dane odzwierciedlają zatem średnią zdolność katalityczną pojedynczych cząsteczek enzymów w licznych cyklach katalizy. Jednak, ostatnie postępy w nanotechnologii umożliwiły obserwację, zazwyczaj za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, katalizy odbywającej się z udziałem pojedynczych cząsteczek enzymu i substratu. Dzięki temu naukowcy mogą obecnie mierzyć szybkość pojedynczych przypadków katalizy i czasami poszczególnych etapów katalizy, wykorzystując proces zwany enzymologią pojedynczej cząsteczki (ryc. 7-9).

Rycina 7-9. Bezpośrednia obserwacja wyników przecięcia DNA katalizowanego przez restrykcyjną endonukleazę. Cząsteczki DNA unieruchomione na kulkach (szare) są umieszczone w przepływającym buforze (czarne strzałki), co powoduje przyjęcie przez nie rozciągniętej konformacji. Cięcie przy jednym z miejsc restrykcyjnych (oznaczone kolorem niebieskim) przez endonukleazy prowadzi do skrócenia cząsteczki DNA, co można zaobserwować bezpośrednio w mikroskopie, ponieważ zasady nukleotydów w DNA fluoryzują. Chociaż endonukleaza (okręgi szare) nie fluoryzuje i dlatego jest niewidoczna, stopniowe skracanie cząsteczki DNA (1→4) ujawnia, że endonukleaza przyłącza się do wolnego końca cząsteczki DNA i posuwa się wzdłuż niego od miejsca do miejsca.

Wykrycie leku wymaga analiz enzymatycznych właściwych dla wysokowydajnych badań przesiewowych (high-throughput screening)

Enzymy są jedną z głównych klas biocząsteczek, które stanowią cele w procesie opracowywania leków i innych czynników terapeutycznych. Zwykle przybierają one formę inhibitorów enzymów (zob. rozdz. 8). Wynalezienie nowych leków jest bardzo ułatwione, kiedy duża liczba potencjalnych farmaceutyków może być równocześnie poddana szybkiej i zautomatyzowanej analizie w procesie określanym jako wysokowydajne badania przesiewowe (high-throughput screening, HTS). Wysokowydajne badania przesiewowe wykorzystują robotykę, optykę, obróbkę danych i mikroobjętości, aby przeprowadzić i przeanalizować wiele tysięcy prób aktywności danego enzymu równocześnie. Wysokowydajne badanie przesiewowe jest idealne do wykonywania przeglądu wielu produktów chemii kombinatorycznej, jednoczesnej syntezy dużych bibliotek komponentów chemicznych, które zawierają wszystkie możliwe kombinacje zestawu chemicznych prekursorów.

Testy immunoenzymatyczne

Czułe analizy enzymatyczne mogą być wykorzystane do detekcji białek, które nie mają aktywności katalitycznej. Testy immunoenzymatyczne (enzyme-linked-immunosorbent assay, ELISA) wykorzystują przeciwciała kowalencyjnie przyłączone do „reporterowego enzymu”, np. fosfatazy alkalicznej lub peroksydazy chrzanowej, których produkty są łatwe do wykrycia in vitro, zazwyczaj z wykorzystaniem absorpcji światła lub fluorescencji. W celu badania surowicy bądź innych próbek biologicznych są one umieszczane w plastikowych płytkach mikrotitracyjnych, gdzie białka przylegają do powierzchni plastiku i w ten sposób są unieruchamiane. Pozostające powierzchnie absorpcyjne ściany są wówczas „blokowane” przez dodanie nieantygenowego białka, takiego jak albumina wołowa. Następnie, podawany jest roztwór przeciwciała kowalencyjnie przyłączonego do reporterowego enzymu. Przeciwciała przyłączają się do unieruchomionego antygenu i same są unieruchamiane. Nadmiar wolnych cząsteczek przeciwciała jest wówczas odmywany. Obecność i ilość przyłączonego przeciwciała określa się przez dodanie substratu dla reporterowego enzymu.

Dehydrogenazy zależne od NAD(P)⁺ są analizowane spektrofotometrycznie

Fizykochemiczne właściwości substratów reakcji katalizowanej enzymatycznie warunkują sposoby badania aktywności enzymatycznej. W analizie spektrofotometrycznej wykorzystuje się zdolność substratu lub produktu do absorpcji światła. Zredukowane koenzymy NADH i NADPH, zapisywane jako NAD(P)H, absorbują światło o długości fali 340 nm, w przeciwieństwie do ich utlenionych form NAD(P)⁺ (ryc. 7-10). Gdy NAD(P)⁺ ulega redukcji, absorbancja światła o długości fali 340 nm wzrasta proporcjonalnie do ilości wytworzonego NAD(P)H i z zależną od niego szybkością. Natomiast w obecności dehydrogenazy, która katalizuje utlenianie NAD(P)H, obserwuje się zmniejszoną absorbancję światła o długości fali 340 nm. W każdym przypadku szybkość zmiany absorbancji przy 340 nm będzie proporcjonalna do ilości enzymu.

Rycina 7-10. Widma absorpcji NAD⁺ i NADH. Gęstość optyczna (absorbancja) dotyczy roztworu o stężeniu 44 mg/L, znajdującego się w kuwecie o grubości 1 cm. NADP⁺ i NADPH mają widma analogiczne, odpowiednio, do widm NAD⁺ i NADH.

Badania enzymów, których reakcjom nie towarzyszą zmiany w absorbancji lub fluorescencji, są zazwyczaj bardzo trudne. W pewnych przypadkach produkt lub pozostały substrat mogą być przekształcane w łatwiej wykrywalny związek, choć produkt reakcji przed pomiarem może być oddzielony od substratu, który nie przereagował. Alternatywną strategią jest znalezienie syntetycznego substratu, którego produkt absorbuje światło lub fluoryzuje. Na przykład hydroliza wiązania fosfoestrowego w fosforanie p-nitrofenolu (pNPP), sztucznym substracie, jest katalizowana z mierzalną szybkością przez wiele fosfataz, fosfodiesteraz i proteaz serynowych. Podczas gdy pNPP nie absorbuje światła widzialnego, powstały po jego hydrolizie anion p-nitrofenolanowy (pKa 6.7) absorbuje światło przy długości fali 419 nm i w ten sposób może być oznaczony ilościowo.

Analiza wielu enzymów jest sprzężona z reakcją katalizowaną przez dehydrogenazę

Inną dość powszechną metodą jest analiza „sprzężona” (ryc. 7-11). Zazwyczaj dehydrogenaza, której substratem jest produkt badanego enzymu, jest dodawana w katalitycznym nadmiarze. Szybkość pojawiania się i zanikania NAD(P)H zależy wówczas od szybkości reakcji enzymatycznej, z którą pozostaje sprzężona reakcja katalizowana przez dehydrogenazę.

Rycina 7-11. Oznaczanie aktywności heksokinazy metodą „sprzężoną”. Tworzenie glukozo-6-fosforanu przez heksokinazę jest połączone z utlenieniem produktu przez dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową w obecności dodanego enzymu i NADP⁺. Jeśli dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa występuje w nadmiarze, szybkość tworzenia NADPH, która może być mierzona przy długości fali 340 nm, jest określona szybkością tworzenia glukozo-6-fosforanu przez heksokinazę.

ANALIZA ENZYMÓW POMAGA W DIAGNOSTYCE

Analiza enzymów obecnych w osoczu krwi odgrywa ważną rolę w diagnozowaniu licznych procesów chorobowych. Wiele enzymów jest funkcjonalnymi składnikami krwi. Ich przykładami są: pseudocholinesteraza, lipaza lipoproteinowa i czynniki kaskady, które wywołują krzepnięcie krwi i fibrynolizę oraz opsonizację patogenów. Inne enzymy są uwalniane do osocza w wyniku śmierci komórki lub ich uszkodzenia. Mimo że te ostatnie enzymy nie pełnią żadnej funkcji fizjologicznej w osoczu, służą jako biomarkery, czyli cząsteczki, których pojawienie się i stężenie mogą pomóc w postawieniu diagnozy oraz określeniu rokowania i uszkodzeń w specyficznych tkankach. W wyniku uszkodzenia stężenie uwolnionego enzymu w osoczu może wzrastać wcześniej lub później i może się obniżać szybko lub wolno. Białka występujące w cytoplazmie pojawiają się dużo szybciej niż białka subkomórkowych organelli.

Ilościowa analiza aktywności uwolnionych enzymów lub innych białek typowych dla osocza lub surowicy, ale także moczu lub różnych komórek, dostarcza informacji ważnych dla diagnozy, rokowania bądź odpowiedzi na leczenie. Badania aktywności enzymu wykorzystują standardowe analizy szybkości początkowej reakcji. W tabeli 7-1 przedstawiono listę enzymów ważnych w diagnozie klinicznej. Niemniej, te enzymy nie są absolutnie specyficzne dla wskazanej choroby. Na przykład podwyższone stężenie kwaśnej fosfatazy sterczowej jest zazwyczaj związane z rakiem prostaty, ale może także występować w innych rakach lub w przypadku zmian nienowotworowych. Zatem dane z badań enzymatycznych muszą być rozpatrywane razem z innymi czynnikami wskazanymi podczas wszechstronnego badania klinicznego. Czynniki, które muszą być wzięte pod uwagę w interpretacji danych badań enzymów, to: wiek pacjenta, płeć, wcześniejsze wyniki, możliwe użycie leków, czułość i specyficzność diagnostyczna testu enzymatycznego.

Tabela 7-1. Główne enzymy osocza wykorzystywane w diagnostyce klinicznej

Enzym osocza

Główne zastosowanie diagnostyczne

Aminotransferaza alaninowa (ALT)

Wirusowe zapalenie wątroby

Amylaza

Ostre zapalenie trzustki

Ceruloplazmina

Zwyrodnienie wątrobowo-soczewkowate (choroba Wilsona)

Kinaza kreatynowa

Choroby mięśni i zawał serca

Transferaza γ-glutamylowa

Różne choroby wątroby

Dehydrogenaza mleczanowa izoenzym 5

Choroby wątroby

Lipaza

Ostre zapalenie trzustki

β-glukozcerebrozydaza

Choroba Gauchera

Fosfataza kwaśna

Choroby prostaty, w tym nowotworowe

Fosfataza zasadowa (izoenzymy)

Różne choroby kości, choroby wątroby z utrudnionym odpływem żółci

Uwaga: Wiele enzymów nie jest specyficznych dla podanych chorób.

Analiza krążących enzymów w następstwie uszkodzenia tkanek

Enzym użyteczny w diagnostyce enzymologicznej powinien być specyficzny dla tkanki lub narządu podczas badania, się pojawiać w osoczu lub innym płynie ustrojowym w czasie użytecznym dla diagnozy („okno diagnostyczne”), i się nadawać do analizy automatycznej. W przypadku zawału mięśnia sercowego (myocardial infarction, MI), detekcja enzymu musi być możliwa w ciągu kilku godzin od zawału, aby potwierdzić wstępną diagnozę i pozwolić na rozpoczęcie odpowiedniej terapii. Enzymy, które pojawiają się w osoczu 12 godzin lub więcej po uszkodzeniu, mają ograniczoną użyteczność. Pierwszymi enzymami wykorzystanymi do diagnozowania MI były aminotransferaza asparaginianowa (AST), aminotransferaza alaninowa (ALT) i dehydrogenaza mleczanowa (LDH). Zaletą diagnostyki z zastosowaniem oznaczeń LDH jest jej specyficzność tkankowa jako konsekwencja struktury czwartorzędowej (ryc. 7-12). Jednakże w trakcie uszkodzenia tkanki jest wolno uwalniana.

Rycina 7-12. Prawidłowy i patologiczny skład izoenzymów dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w surowicy człowieka. Izoenzymy LDH surowicy były rozdzielone elektroforetycznie i wizualizowane z wykorzystaniem sprzężonej reakcji, której schemat znajduje się z lewej strony ryciny (NBT – błękit nitrotetrazoliowy, PMS – metylosiarczan fenazyny). Po prawej stronie ryciny pokazano barwiony elektroforegram. A – surowica od pacjenta z zawałem serca, B – prawidłowa surowica, C – surowica od pacjenta z chorobą wątroby. Cyframi arabskimi określono specyficzne izoenzymy LDH.

Kinaza kreatynowa (CK) ma trzy izoenzymy: CK-MM (mięśnie szkieletowe), CK-BB (mózg) i CK-MB (serce i mięśnie szkieletowe). CK-MB jest użyteczna w „oknie diagnostycznym” MI. Tak jak w przypadku LDH, indywidualne izoenzymy CK można rozdzielić elektroforetycznie, ułatwiając w ten sposób ich detekcję. Badanie stężenia osoczowej CK jest dalej wykorzystywane do wykrywania chorób mięśni szkieletowych, np. dystrofii Duchenne’a.

Troponina osoczowa jest obecnie preferowanym markerem diagnostycznym zawału serca

Troponina jest kompleksem trzech białek związanych ze skurczem mięśni szkieletowych i mięśnia sercowego, ale nie mięśni gładkich (zob. rozdz. 51). Stężenie troponin wzrasta w ciągu 2–6 godzin po MI i pozostaje podwyższone przez 4–10 dni. Immunologiczny pomiar stężenia sercowych troponin I i T w osoczu stanowi czuły i specyficzny wskaźnik uszkodzenia mięśnia sercowego. Nie tylko zawał, lecz także inne jego uszkodzenia powodują wzrost stężenia troponin w surowicy. Troponiny sercowe służą zatem jako marker wszystkich uszkodzeń serca.

Dodatkowe wykorzystanie enzymów w badaniach klinicznych

Enzymy mogą także być wykorzystane w laboratorium klinicznym do określania stężenia kluczowych metabolitów. Na przykład oksydaza glukozowa jest często stosowana do pomiaru stężenia glukozy w osoczu. Coraz częściej enzymy są używane jako narzędzia do leczenia chorób. Tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) i streptokinaza są stosowane w leczeniu ostrego MI, natomiast trypsyna – w leczeniu mukowiscydozy. Dożylny wlew glikozydaz otrzymanych na drodze rekombinacji został zatwierdzony do leczenia wielu spichrzeniowych chorób lizosomalnych: Gauchera (β-glukozydaza), Pompego (α-glukozydaza), Fabry’ego (α-galaktozydaza A) i Sly’a (β-glukuronidaza) oraz mukopolisacharydozy typu I, II i VI – znanych również odpowiednio jako zespół Hurlera (α-L-iduronidaza), zespół Huntera (iduronian 2-sulfataza) i zespół Maroteaux–Lamy’ego (arylosulfataza B).

ENZYMY UŁATWIAJĄ ROZPOZNANIE CHORÓB INFEKCYJNYCH I GENETYCZNYCH

Wiele technik diagnostycznych wykorzystuje specyficzność i efektywność enzymów, które działają na oligonukleotydy, np. DNA. Przykładowo enzymy znane jako endonukleazy restrykcyjne tną podwójny łańcuch DNA w miejscach specyficznych dzięki sekwencji czterech, sześciu lub więcej par zasad zwanych miejscami restrykcyjnymi. Przecięcie próbki DNA enzymem restrykcyjnym dostarcza charakterystycznego zestawu mniejszych fragmentów DNA (zob. rozdz. 39). Odchylenia w prawidłowym wykresie produktów zwane polimorfizmem długości fragmentów restrykcyjnych (restriction fragments length polymorphism, RFLP) występują wtedy, gdy mutacja czyni miejsce restrykcyjne nierozpoznawalnym dla pokrewnej endonukleazy restrykcyjnej lub alternatywnie generuje nowe miejsce rozpoznania. Aktualnie RFLP są wykorzystywane do ułatwienia prenatalnego wykrywania wielu zaburzeń dziedzicznych, takich jak niedokrwistość sierpowatokrwinkowa, β-talasemia, fenyloketonuria noworodków i choroba Huntingtona. Mogą również być wykorzystane jako biologiczne „odciski palców” pomagające ustalić źródło próbki DNA u konkretnej osoby. RFLP ma kilka istotnych ograniczeń, z których najpoważniejszym jest wymóg stosunkowo dużych ilości DNA do wykorzystania jako substratów dla enzymów restrykcyjnych. Obecnie znacznie bardziej czuły zestaw narzędzi diagnostyki molekularnej oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w dużej mierze wyparł analizę RFLP.

Zastosowanie medyczne łańcuchowej reakcji polimerazy

Jak opisano w rozdziale 39, łańcuchowa reakcja polimerazy (polymerase chain raction, PCR) wykorzystuje termostabilną polimerazę DNA i odpowiednie startery oligonukleotydowe w celu utworzenia tysięcy kopii zdefiniowanego odcinka DNA ze znikomej ilości materiału startowego. PCR umożliwia naukowcom zajmującym się medycyną, biologią i medycyną sądową wykrycie i scharakteryzowanie DNA obecnego początkowo w zbyt małej ilości, aby mogło zostać wykryte bezpośrednio. Poza przesiewowymi badaniami mutacji genetycznych PCR może być wykorzystana do wykrywania i identyfikacji patogenów i pasożytów, takich jak świdrowce Trypanosoma cruzi będące przyczyną choroby Chagasa, oraz bakterie Neisseria meningitidis powodujące bakteryjne zapalenie opon mózgowych przez selektywną amplifikację ich DNA.

REKOMBINACJA DNA JEST WAŻNYM NARZĘDZIEM W BADANIU ENZYMÓW

Technika rekombinacji DNA okazała się ważnym narzędziem w badaniu enzymów. Do badania struktury i funkcji są potrzebne enzymy o wysokim stopniu oczyszczenia. Wyizolowanie pojedynczego enzymu, zwłaszcza jeśli występuje w niskim stężeniu, z tysięcy białek zawartych w komórce może być niezwykle trudne. Jeśli gen dla danego enzymu został sklonowany, możliwe jest wytworzenie dużej ilości białka w Escherichia coli lub drożdżach. Niemniej nie wszystkie białka zwierzęce mogą ulegać ekspresji w formie aktywnej w komórkach bakteryjnych ani też drobnoustroje nie mogą przeprowadzać pewnych wymaganych procesów potranslacyjnych. Z tego powodu gen może ulegać ekspresji w systemach kultur komórek zwierzęcych wykorzystujących bakulowirus jako wektor ekspresyjny do transformacji kultur komórek owadów. Więcej szczegółów dotyczących technik rekombinacji DNA można znaleźć w rozdziale 39.

Rekombinowane białka fuzyjne są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa

Technika rekombinacji DNA może być także wykorzystana do modyfikowania białek, które w nowej postaci mogą być łatwo oczyszczane metodą chromatografii powinowactwa. Gen będący obiektem zainteresowania jest przyłączany do oligonukleotydowej sekwencji, która koduje karboksy- lub aminokońcowe wydłużenie kodowanego białka. Utworzone zmodyfikowane białko, zwane białkiem fuzyjnym, zawiera domenę dostosowaną do oddziaływania ze specyficznym nośnikiem wykorzystywanym w chromatografii powinowactwa. Jednym z częstszych podejść metodycznych jest przyłączenie oligonukleotydu, który koduje sześć reszt histydyny. Ulegające ekspresji białko z tą „metką histydynową” przyłącza się do chromatograficznego nośnika, który zawiera unieruchomione dwuwartościowe jony metalu, np. Ni²⁺ lub Cd²⁺. Badanie to wykorzystuje zdolność tych dwuwartościowych kationów do przyłączenia reszt His. Zanieczyszczające białka są wymywane, a enzym „metkowany His” jest eluowany buforami zawierającymi wysokie stężenie wolnej histydyny lub imidazolu, które konkurują z ogonami polihistydynowymi, aby przyłączyć się do immobilizowanego jonu metalu. Podobnie wiążąca substrat domena S-transferazy glutationowej (GST) może służyć jako „metka GST”. Na rycinie 7-13 pokazano schemat oczyszczania białka fuzyjnego z metką GST z wykorzystaniem nośnika powinowactwa zawierającego przyłączony glutation. Dodanie domeny fuzyjnej N-końcowej może również pomóc w wywołaniu prawidłowego fałdowania pozostałej części polipeptydu rekombinowanego. Większość domen fuzyjnych ma również miejsce rozszczepienia dla wysoce specyficznej proteazy, takiej jak trombina, w regionie, który łączy dwie części białka, aby umożliwić jego ostateczne usunięcie.

Rycina 7-13. Wykorzystanie fuzyjnych białek z S-transferazą glutationową (GST) do oczyszczania rekombinowanych enzymów (GSH-glutation).

Ukierunkowana mutageneza pozwala zrozumieć mechanizm katalizy

Po wykazaniu ekspresji białka ze sklonowanego genu możliwe jest zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy do zmiany specyficznych aminokwasów poprzez modyfikację ich kodonów. Metoda ta, zastosowana w połączeniu z analizami kinetyki reakcji i krystalografią rentgenowską, ułatwia rozpoznanie specyficznej roli reszt aminokwasowych w przyłączaniu substratu i w katalizie. Na przykład hipoteza, że pojedynczy aminokwas działa jako kwas, może zostać potwierdzona przez zastąpienie go aminokwasem niezdolnym do oddania protonu.

RYBOZYMY: ARTEFAKTY ZE „ŚWIATA RNA”

Cech odkrył pierwszą katalityczną cząsteczkę RNA

Udział katalizy enzymatycznej w potranslacyjnym dojrzewaniu pewnych białek ma analogie w świecie RNA. Wiele cząsteczek RNA podlega obróbce, która usuwa segmenty oligonukleotydów i ponownie łączy pozostałe segmenty, tworząc dojrzały produkt (zob. rozdz. 36). Niemniej nie wszystkie te katalizatory są białkami. We wczesnych latach osiemdziesiątych XX wieku Thomas Cech i jego współpracownicy, badając obróbkę cząsteczek rybosomalnego RNA (rRNA) u orzęska Tetrahymena, zaobserwowali, że obróbka 26S rRNA zachodzi sprawnie in vitro nawet przy całkowitej nieobecności białka. Źródło tej splicingowej aktywności rozciągnęło się do 413 pary zasad segmentu katalitycznego, który zachowywał aktywność katalityczną nawet wtedy, kiedy był replikowany w E. coli (zob. rozdz. 39). Do tego czasu sądzono, że polinukleotydy służą jedynie jako cząstki informujące o magazynowaniu i transmisji i że kataliza jest ograniczona tylko do białek.

Od tamtej pory zostało odkrytych wiele innych rybozymów. Większość katalizuje nukleofilowe reakcje przemieszczenia, których celem jest wiązanie fosfodiestrowe w łańcuchu RNA. W małych samorozcinających się RNA, RNA o strukturze typu hammerhead (rybozym młotkowaty) lub RNA delta wirusa zapalenia wątroby atakującym nukleofilem jest woda i wynikiem jest hydroliza. W szerokiej grupie I rybozymów intronowych atakującym nukleofilem jest grupa hydroksylowa w pozycji 3´ terminalnej rybozy innego segmentu RNA, a wynikiem – reakcja splicingu.

Rybosom – podstawowy rybozym

Rybosom był pierwszym poznanym przykładem „maszyny molekularnej”. Rybosom, duży kompleks zawierający dziesiątki podjednostek białkowych i wiele cząsteczek rybosomalnego RNA, uczestniczy w ważnym dla życia i wysoce złożonym procesie syntezy długich łańcuchów polipeptydowych według instrukcji zakodowanej w cząsteczkach mRNA (zob. rozdz. 37). Przez wiele lat uważano, że rybosomalne RNA odgrywają bierną, strukturalną rolę lub pomagają w rozpoznaniu pokrewnych mRNA przez mechanizm parowania zasad. Zatem odkrycie, że rybosomalne RNA były konieczne i wystarczające do katalizy, stanowiło niespodziankę.

Hipoteza „świata RNA”

Odkrycie rybozymów miało głęboki wpływ na teorię ewolucji. Przez wiele lat naukowcy stawiali hipotezę, że pierwsze katalizatory biologiczne powstały, gdy aminokwasy zawarte w „pierwotnej zupie” połączyły się, tworząc proste białka. W związku z uświadomieniem sobie, że RNA może zarówno nieść informację, jak i katalizować proste reakcje chemiczne, powstała nowa hipoteza „świat RNA”, w której RNA stanowił pierwszą makrocząsteczkę biologiczną. Przypuszczalnie DNA powstał w celu długoterminowego przechowywania informacji jako bardziej stabilny chemicznie oligonukleotyd, podczas gdy białka ze względu na ich rzeczywiście dużo większą różnorodność chemicznych grup funkcyjnych dominują w katalizie. Jeśli przyjmie się, że pewien rodzaj hybrydu RNA–białko powstał jako produkt pośredni przejścia od katalizatorów rybonukleotydowych do polipeptydowych, to właśnie rybosom jest przypuszczalnie brakującym połączeniem.

Dlaczego białka nie przejęły wszystkich funkcji katalitycznych? Prawdopodobnie w przypadku rybosomu proces był zarówno zbyt złożony, jak i zbyt istotny, aby pozwolić działać możliwym konkurentom. Małe samoprzecinające się RNA lub samoskładające się introny to nieliczne przypadki, w których autokataliza RNA jest bardziej efektywna niż powstanie nowego białkowego katalizatora.

STRESZCZENIE

• Enzymy są wysoko efektywnymi katalizatorami, których specyficzność dotyczy rodzaju katalizowanej reakcji i pojedynczego substratu.

• W przypadku wielu enzymów zestaw dostępnych narzędzi chemicznych ułatwiających katalizę został rozszerzony o cząsteczki nieaminokwasowe. Gdy są ściśle związane, te nieorganiczne i organiczne cząsteczki są określane jako grupy prostetyczne, a gdy są luźno związane (dysocjowalne) – jako kofaktory.

• Organiczne i nieorganiczne grupy prostetyczne, kofaktory i koenzymy odgrywają ważne role w katalizie. Koenzymy, z których wiele jest pochodnymi witamin z grupy B, służą jako „transportery” dla zwykle wykorzystywanych grup, takich jak aminy, elektrony i grupy acetylowe.

• Podczas katalizy enzymy często odwracają kierunek zmian konformacyjnych indukowanych przez przyłączenie substratu, aby osiągnąć zmiany komplementarne w substracie, co ułatwia ich transformację w produkt.

• Mechanizmy katalizy z udziałem enzymów obejmują: wprowadzenie naprężenia, zbliżenie reagentów, katalizę kwasowo-zasadową i katalizę kowalencyjną. Proteaza HIV ilustruje katalizę kwasowo-zasadową, a chymotrypsyna i fruktozo-2,6-bisfosfataza – katalizę kowalencyjną.

• Reszty aminokwasowe, które uczestniczą w katalizie, są wysoce konserwatywne w obrębie wszystkich klas danego enzymu. Wykorzystanie ukierunkowanej mutagenezy do zmian reszt, ważnych w katalizie lub przyłączaniu substratu, umożliwia poznanie mechanizmów działania enzymu.

• Aktywność katalityczna enzymów ujawnia ich obecność i ułatwia wykrycie oraz jest podstawą testów immunoenzymatycznych. Wiele enzymów można analizować spektrofotometrycznie, łącząc je z dehydrogenazą zależną od NAD(P)⁺.

• Badanie enzymów osocza ułatwia diagnozę i rokowanie w zawale mięśnia sercowego, ostrym zapaleniu wątroby oraz różnych schorzeniach kości i wątroby.

• Endonukleazy restrykcyjne ułatwiają diagnozę chorób genetycznych, ujawniając polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych.

• Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) amplifikuje DNA początkowo obecny w ilościach zbyt małych, aby można było poddać je analizie.

• Przyłączenie polihistydyny, S-transferazy glutationowej (GST) lub innej „metki” do N- lub C-końca rekombinowanego białka ułatwia jego oczyszczenie przez chromatografię powinowactwa.

• Nie wszystkie enzymy są białkami. Wiele rybozymów może ciąć i ponownie łączyć wiązanie fosfodiestrowe RNA. W rybosomie to nie elementy polipeptydowe, a głównie rRNA odpowiada za katalizę.

PIŚMIENNICTWO

Apple F.S., Sandoval Y., Jaffe A.S. i wsp.: Cardiac troponin assays: Guide to understanding analytical characteristics and their impact on clinical care. Clin. Chem. 2017; 63(1): 73–81.

Baumer Z.T., Whitehead T.A.: The inner workings of an enzyme: A high-throughput mutation screen dissects the mechanistic basis of enzyme activity. Science 2021; 373(6553): 391–392.

Bishop M.L., Fody E.P., Schoeff L.E.: Clinical Chemistry. Principles, Techniques, and Correlations (wyd. 8). Jones & Bartlett Learning, 2018.

Frey P.A., Hegeman A.D.: Enzyme Reaction Mechanisms. Oxford University Press, 2006.

Heckmann C.M., Paradisi F.: Looking back: A short history of the discovery of enzymes and how they became powerful chemical tool. Chem. Cat. Chem. 2020; 12(24): 6082–6102.

Hedstrom L.: Serine protease mechanism and specificity. Chem. Rev. 2002; 102(12): 4501–4524.

Knight A.E.: Single enzyme studies: A historical perspective. Meth. Mol. Biol. 2011; 778: 1–9.

Rho J.H., Lampe P.D.: High-throughput analysis of plasma hybrid markers for early detection of cancers. Proteomes 2014; 2(1): 1–17.

Sanabria H., Rodnin D., Hemmen K. i wsp.: Resolving dynamics and function of transient states in single enzyme molecules. Nature Commun. 2020; 11(1): 1231.

Spies M., Chemla Y. (red.): Single-Molecule Enzymology: Fluorescence-based and High-throughput Methods. Methods Enzymol., t. 581, Academic Press, 2016.

Weinberg C.A., Weinberg Z., Hammann C.: Novel ribozymes: Discovery, catalytic mechanisms, and the quest to understand biological function. Nucl. Acids Res. 2019; 47(18): 9480–9494.