© Copyright by Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2015

Wszystkie prawa zastrzeżone.

Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci całości bądź części książki bez pisemnej zgody wydawcy są zabronione.

Wydawca: Anna Plewa

Redaktor prowadzący: Barbara Nowak-Pacholczak

Redaktor merytoryczny: Elżbieta Michalska

Koordynator produkcji: Magdalena Preder

Korekta: Barbara Staśkiewicz

Projekt okładki i stron tytułowych: Lidia Michalak-Mirońska

Zdjęcie na okładce: Agencja fotograficzna iStockphoto

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwa Lekarskiego PZWL: Aleksandra Łapińska

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2015 r. (wyd. I)

Warszawa 2015

ISBN 978-83-200-4851-3 (ePub)

ISBN 978-83-200-4852-0 (Mobi)

Wydawnictwo Lekarskie PZWL

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 695-43-21; infolinia: 801333388

www.pzwl.pl

Księgarnia wysyłkowa:

tel. 22 695-44-80

e-mail: wysylkowa@pzwl.pl

Spis treści

Autorzy

Przedmowa

1. Charakterystyka analityczna metody laboratoryjnej – Bogdan Solnica

1.1. Wstęp

1.2. Granica próbki ślepej

1.3. Granica wykrywalności

1.4. Granica oznaczalności

1.5. Czułość funkcjonalna

1.6. Liniowość

1.7. Odporność

1.8. Dokładność

1.9. Precyzja

2. Metody spektroskopowe – Krystyna Sztefko

2.1. Wstęp

2.2. Promieniowanie elektromagnetyczne

2.3. Oddziaływanie promieniowania elektromagnetycznego z materią

2.4. Kryteria podziału metod spektroskopowych

2.5. Jądrowy rezonans magnetyczny

2.6. Metody spektroskopii absorpcyjnej

2.7. Metody spektroskopii emisyjnej

2.8. Spektroskopia luminescencji

2.9. Fluorescencja

2.10. Chemiluminescencja

2.11. Reflektometria

2.12. Podsumowanie

3. Metody elektrochemiczne – Krystyna Sztefko

3.1. Wstęp

3.2. Zasady metod elektrochemicznych

3.3. Elektrody stosowane w elektrochemii

3.4. Elektrody selektywne dla cząsteczek

3.5. Podsumowanie

4. Metody elektroforetyczne – Maria Kapusta

4.1. Wstęp

4.2. Rodzaje nośników elektroforetycznych

4.3. Techniki stosowane do rozdziału, identyfikacji i oznaczania ilości białek

4.4. Metody immunoelektroforetyczne

4.5. Techniki barwienia

4.6. Ilościowa ocena rozdziałów elektroforetycznych

4.7. Zastosowanie metod elektroforetycznych w diagnostyce laboratoryjnej

5. Metody chromatograficzne – Agnieszka Kondracka, Zbigniew Bartoszewicz

5.1. Zasada metod chromatograficznych

5.2. Techniki pomiarowe i aparatura

5.3. Przykłady zastosowania metod chromatograficznych w diagnostyce laboratoryjnej

6. Technika spektrometrii mas – Zbigniew Bartoszewicz, Agnieszka Kondracka

6.1. Zasada techniki spektrometrii mas

6.2. Techniki pomiarowe i aparatura

6.3. Przykłady zastosowania techniki spektrometrii mas w diagnostyce laboratoryjnej

7. Metody immunochemiczne – Krystyna Sztefko

7.1. Zasada metod immunochemicznych

7.2. Rodzaje metod immunochemicznych

7.3. Standaryzacja i harmonizacja metod immunochemicznych

7.4. Techniki pomiarowe w metodach immunochemicznych

7.5. Zastosowanie metod immunochemicznych w diagnostyce laboratoryjnej

7.6. Przedanalityczne i analityczne czynniki interferujące w metodach immunochemicznych

7.7. Efekt niskiej dawki i efekt wysokiej dawki

7.8. Poszukiwanie i usuwanie interferujących przeciwciał

7.9. Uwaga końcowa

8. Metody analityczne w technologii suchej chemii – Krystyna Sztefko, Przemysław Tomasik

7.1. Zasada metod immunochemicznych

7.2. Rodzaje metod immunochemicznych

7.3. Standaryzacja i harmonizacja metod immunochemicznych

7.4. Techniki pomiarowe w metodach immunochemicznych

7.5. Zastosowanie metod immunochemicznych w diagnostyce laboratoryjnej

7.6. Przedanalityczne i analityczne czynniki interferujące w metodach immunochemicznych

7.7. Efekt niskiej dawki i efekt wysokiej dawki

7.8. Poszukiwanie i usuwanie interferujących przeciwciał

7.9. Uwaga końcowa

9. Metody izotopowe – Krystyna Sztefko

9.1. Wstęp

9.2. Emitery promieniowania alfa, beta i gamma w diagnostyce laboratoryjnej

9.3. Prawo rozpadu promieniotwórczego

9.4. Aktywność preparatu promieniotwórczego i jej jednostki

9.5. Pomiar aktywności w laboratorium

9.6. Ochrona przed promieniowaniem

9.7. Ochrona przed skutkami promieniowania

9.8. Rodzaje metod izotopowych

9.9. Izotopy w diagnostyce laboratoryjnej

9.10. Zastosowanie metod izotopowych w diagnostyce laboratoryjnej

10. Cytometria przepływowa – Łukasz Sędek, Bogdan Mazur

10.1. Wprowadzenie do techniki cytometrii przepływowej

10.2. Zastosowania cytometrii przepływowej

10.3. Podsumowanie

11. Metody biologii i genetyki molekularnej – Marek Sanak

11.1. Wstęp

11.2. Kliniczne skutki mutacji

11.3. Rodzaje mutacji genetycznych

11.4. Mutacje genomu mitochondrialnego

11.5. Metody wykrywania mutacji genowych

11.6. Metody celowane wykrywania mutacji genowych

11.7. Dostępność badań w genetycznej diagnostyce molekularnej

12. Metody stosowane w badaniach hematologicznych – Bogdan Mazur

12.1. Historia badań hematologicznych

12.2. Materiał do badań hematologicznych

12.3. Metody badań hematologicznych

12.4. Wyniki badań hematologicznych

12.5. Standaryzacja

12.6. Automatyzacja w immunohematologii

13. Metody stosowane w badaniach hemostazy – Anna Raszeja-Specht, Jacek Golański

7.1. Zasada metod immunochemicznych

7.2. Rodzaje metod immunochemicznych

7.3. Standaryzacja i harmonizacja metod immunochemicznych

7.4. Techniki pomiarowe w metodach immunochemicznych

7.5. Zastosowanie metod immunochemicznych w diagnostyce laboratoryjnej

7.6. Przedanalityczne i analityczne czynniki interferujące w metodach immunochemicznych

7.7. Efekt niskiej dawki i efekt wysokiej dawki

7.8. Poszukiwanie i usuwanie interferujących przeciwciał

7.9. Uwaga końcowa

14. Metody stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej – Elżbieta Stefaniuk

14.1. Wstęp

14.2. Hodowla drobnoustrojów

14.3. Metody mikroskopowe

14.4. Techniki barwienia

14.5. Identyfikacja drobnoustrojów

14.6. Metody serologiczne i immunochemiczne

14.7. Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów

14.8. Metody biologii molekularnej

15. Laboratoryjny system informatyczny – Barbara Kopeć, Piotr Sitkowski

15.1. Wstęp

15.2. Funkcje laboratoryjnego systemu informatycznego

15.3. Ochrona danych medycznych i osobowych pacjentów w laboratorium

15.4. Koszty informatyzacji

16. Automatyzacja w medycznym laboratorium diagnostycznym – Bogdan Solnica

16.1. Wstęp

16.2. Automatyczne analizatory laboratoryjne. Konsolidacja badań

16.3. Automatyzacja fazy pozaanalitycznej

16.4. Częściowa i całkowita automatyzacja laboratorium

Wszystkie rozdziały dostępne w pełnej wersji książki.

Autorzy

Dr n. przyr. Zbigniew Bartoszewicz

Laboratorium Naukowe

Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii

Warszawski Uniwersytet Medyczny

Dr hab. n. biol. Jacek Golański

Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi

Katedra Nauk Biomedycznych

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Dr n. biol. Maria Kapusta

Zakład Diagnostyki

Katedra Biochemii Klinicznej

Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum w Krakowie

Dr n. biol. Agnieszka Kondracka

Laboratorium Naukowe

Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii

Warszawski Uniwersytet Medyczny

Mgr Barbara Kopeć

Diagnostyka sp. z o. o. w Krakowie

Prof. dr hab. n. med. Bogdan Mazur

Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii

Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Dr n. med. Anna Raszeja-Specht, docent

Zakład Medycyny Laboratoryjnej

Katedra Biochemii Klinicznej

Gdański Uniwersytet Medyczny

Prof. dr hab. n. med. Marek Sanak

Zakład Biologii Molekularnej i Genetyki Klinicznej

II Katedra Chorób Wewnętrznych

Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum w Krakowie

Dr n. med. Łukasz Sędek

Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej

Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Mgr inż. Piotr Sitkowski

Eclipse sp. z o. o. w Krakowie

Dr hab. n. med. Bogdan Solnica, prof. UJ

Katedra Biochemii Klinicznej

Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum w Krakowie

Dr n. med. Elżbieta Stefaniuk

Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej

Narodowy Instytut Leków w Warszawie

Prof. dr hab. n. med. Krystyna Sztefko

Zakład Biochemii Klinicznej

Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii

Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum w Krakowie

Dr hab. n. med. Przemysław Tomasik

Zakład Biochemii Klinicznej

Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii

Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum w Krakowie

Przedmowa

Dynamiczny rozwój medycyny laboratoryjnej w ostatnich 30–40 latach i wzrost jej znaczenia w praktyce klinicznej nie byłyby możliwe bez udoskonalania znanych od dziesięcioleci metod analitycznych i technik pomiarowych, wprowadzania nowych oraz ogromnego postępu w zakresie komputeryzacji. Dzięki temu nastąpiła bardzo duża poprawa jakości i znaczne poszerzenie panelu wykonywanych badań laboratoryjnych, co przyczyniło się do zwiększenia skuteczności diagnostyki i leczenia.

Postęp metodyki oznaczeń radykalnie zmienił nie tylko charakter pracy diagnosty laboratoryjnego, ale także spowodował zwiększenie wymaganej od niego wiedzy i umiejętności. Fachowy pracownik współczesnego medycznego laboratorium diagnostycznego coraz rzadziej wykorzystuje manualne techniki analizy instrumentalnej, musi natomiast umieć wprawnie obsługiwać automatyczne analizatory i zintegrowane platformy analityczne, a także posługiwać się laboratoryjnym systemem informatycznym. Nowe wyzwania stające przed diagnostami muszą znajdować odzwierciedlenie w programach kształcenia przeddyplomowego i specjalizacyjnego w zawodzie diagnosty laboratoryjnego.

Niniejszy podręcznik stanowi przegląd metod analitycznych i technik pomiarowych stosowanych w medycznych laboratoriach diagnostycznych do wykonywania badań biochemicznych, analitycznych, hematologicznych, koagulologicznych, immunochemicznych, genetycznych i mikrobiologicznych. Opisane zostały zarówno metody stosowane w diagnostyce laboratoryjnej od dawna, jak i wprowadzone do laboratoriów medycznych w ciągu ostatnich lat. Mamy nadzieję, że dzięki temu podręcznik nie będzie szybko tracił na aktualności. Współautorom podręcznika, ekspertom w poszczególnych dziedzinach diagnostyki laboratoryjnej, serdecznie dziękujemy za współpracę.

Podręcznik kierujemy do studentów oddziałów analityki medycznej i medycyny laboratoryjnej oraz diagnostów laboratoryjnych. Zamiarem jego autorów i redaktorów było dostarczenie informacji niezbędnych w zawodzie diagnosty laboratoryjnego. Czytelnicy ocenią, czy prezentowany podręcznik sprostał temu zadaniu.

Bogdan Solnica

Krystyna Sztefko

1

Charakterystyka analityczna metody laboratoryjnej

Bogdan Solnica

1.1. Wstęp

Charakterystyka analityczna obejmuje wiele cech metody laboratoryjnej decydujących o możliwości zastosowania jej do określonych celów, np. w diagnostyce, w praktyce klinicznej. Dlatego charakterystyka analityczna metod stosowanych w medycznej diagnostyce laboratoryjnej cechuje się pewnymi odrębnościami. Składają się na nią cechy metody opisywane przez parametry, wyznaczane w toku wystandaryzowanych procedur przez producentów odczynników i sprzętu oraz w medycznych laboratoriach diagnostycznych (walidacja metod). Ogólnie, charakterystyka analityczna określa, czy metoda daje wystarczająco dokładne i powtarzalne wyniki oznaczeń w niezbędnym z punktu widzenia ich zastosowania zakresie badanej cechy analitu.

Na charakterystykę analityczną metody składają się:

 granica próbki ślepej,

 granica wykrywalności,

 granica oznaczalności,

 czułość funkcjonalna,

 liniowość,

 zakres oznaczalności,

 odporność,

 dokładność,

 precyzja.

1.2. Granica próbki ślepej

Granica próbki ślepej (limit of blank – LoB) określa granicę szumu analitycznego – jest największym wynikiem pomiaru, jaki z określonym prawdopodobieństwem można uzyskać w materiale niezawierającym oznaczanego analitu. Jest ona wyznaczana na podstawie wyników serii pomiarów, zwykle 20, w materiale niezawierającym oznaczanego analitu (np. kalibrator zerowy). Wartość średnia uzyskanych wyników odpowiada zerowemu stężeniu oznaczanej substancji (ryc. 1.1). Gdy jest ona różna od zera, wskazuje to na obciążenie analityczne (błąd systematyczny; bias) metody. Granica próbki ślepej odpowiada 95. centylowi rozkładu wyników oznaczeń w próbkach niezawierających analitu (ślepych) i jest obliczana na podstawie wartości średniej i odchylenia standardowego (SDblank) tego rozkładu według wzoru:

LoB = średnia + 1,645 × SDblank

Rycina 1.1

Rozkład wyników oznaczeń w materiale niezawierającym analitu i w materiale zawierającym analit w bardzo małym stężeniu. Przy stężeniu analitu równym granicy wykrywalności (LoD) 5% uzyskanych wyników będzie poniżej granicy próbki ślepej (LoB).

1.3. Granica wykrywalności

Granica wykrywalności (limit of detection – LoD) to najmniejsze stężenie, które może być odróżniane od granicy szumu analitycznego i przy którym możliwe jest wiarygodne wykrycie analitu. Granicę tę wyznacza się, wykonując serie oznaczeń (20–60) w kilku próbkach zawierających oznaczaną substancję w stężeniu bliskim granicy próbki ślepej. Dla każdej próbki oblicza się średnią i odchylenie standardowe (SD) wyników serii oznaczeń.

Granicę wykrywalności oblicza się z wykorzystaniem granicy próbki ślepej według wzoru:

LoD = LoB + 1,645 × SD

Granica wykrywalności jest większa od granicy próbki ślepej o (1,645 × SD), co oznacza, że obecny w materiale analit wywołuje sygnał trwale silniejszy niż w przypadku granicy próbki ślepej, ale przy stężeniu analitu na poziomie granicy wykrywalności 5% uzyskanych wyników będzie poniżej granicy próbki ślepej (patrz ryc. 1.1). Innymi słowy, granica wykrywalności jest małym stężeniem (lub inną cechą) analitu, przy którym 95% wyników pomiaru przekracza granicę próbki ślepej, co z kolei oznacza, że w 5% próbek metoda nie wykryje analitu o tym stężeniu.

1.4. Granica oznaczalności

Granica oznaczalności (limit of quantitation – LoQ) jest najmniejszym stężeniem substancji, które może być oznaczane z całkowitym błędem analitycznym spełniającym kryteria dokładności wymagane do celów klinicznych. W przeciwieństwie do granicy próbki ślepej i granicy wykrywalności, wyznaczanych wyłącznie na podstawie danych analitycznych, granica oznaczalności jest ponadto określana przez dokładność i precyzję wymagane do klinicznego zastosowania metody.

Całkowity błąd analityczny (total analytical error – TAE) jest obliczany według wzoru:

TAE = bias + 2 × SD

gdzie odchylenie standardowe (SD) wyników oznaczeń w 40 próbkach tego samego materiału jest miarą precyzji metody.

Granica oznaczalności nie może być mniejsza od granicy wykrywalności, te dwie wartości są sobie równe, gdy całkowity błąd analityczny wyznaczony dla stężenia analitu na poziomie granicy wykrywalności ma wartość dopuszczalną. W przeciwnym razie granica oznaczalności przekracza granicę wykrywalności i musi być określona przez wyznaczenie całkowitego błędu analitycznego dla stężeń większych od granicy wykrywalności (ryc. 1.2).

Rycina 1.2

Rozkład wyników oznaczeń w materiale niezawierającym analitu, w materiale zawierającym analit w stężeniu na poziomie granicy wykrywalności i w nieco większym stężeniu. Współzależności między granicą: próbki ślepej (LoB), wykrywalności (LoD) i oznaczalności (LoQ).

1.5. Czułość funkcjonalna

Czułość funkcjonalna jest definiowana jako stężenie analitu oznaczane z określoną nieprecyzyjnością – przy współczynniku zmienności (CV) równym 20% (lub 10%). Warto zaznaczyć, że definicja czułości funkcjonalnej nie uwzględnia obciążenia analitycznego. Podobnie jak w przypadku granicy oznaczalności czułość funkcjonalna charakteryzuje metodę w kontekście dopuszczalnej zmienności analitycznej (w tym przypadku – nieprecyzyjności).

1.6. Liniowość

Liniowość to przedział badanej cechy (np. stężenia) analitu, w którym występuje korelacja (R = 0,999) między tą wartością a sygnałem analitycznym. Zakres liniowości zbliżony jest do zakresu oznaczalności – przedziału cechy analitu, w obrębie którego jest ona oznaczana z wymaganą dokładnością, precyzją i liniowością. Nachylenie prostej odzwierciedlającej zależność cecha (stężenie)–sygnał jest miarą czułości analitycznej, czyli zdolności metody/układu pomiarowego do adekwatnej reakcji na zmiany cechy analitu (ryc. 1.3).

Rycina 1.3

Zakres liniowości i oznaczalności metody analitycznej.

1.7. Odporność

Odporność (robustness; tolerancyjność) metody laboratoryjnej określa, w jakiej mierze wyniki oznaczeń zależą od niewielkich przypadkowych zmian warunków ich wykonywania (sposobu opracowania próbki, zmian temperatury, wilgotności, zasilania aparatury i in.).