© Copyright by Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2017

Wszystkie prawa zastrzeżone.

Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci całości bądź części książki bez pisemnej zgody wydawcy są zabronione

Autorzy dołożyli wszelkich starań, aby informacje zawarte w tym podręczniku zostały podane właściwie, jednak ostateczne decyzje dotyczące stosowania terapii spoczywają na lekarzu. Zarówno Autorzy, Konsultanci, jak i Wydawnictwo nie ponoszą odpowiedzialności za błędne zastosowanie informacji zawartych w publikacji, w szczególności nie uwzględnia się roszczeń w odniesieniu do leków i substancji chemicznych. W zakresie informacji o lekach jedyną prawnie obowiązującą informacją jest aktualna charakterystyka produktu leczniczego (ChPl) oraz ulotka producenta.

Wydawca: Stella Nowośnicka-Pawlitko

Redaktorzy merytoryczni: Wojciech Szczepański, Ewa Jaworska

Producent: Anna Bączkowska

Projekt okładki i stron tytułowych: Kalina Możdżyńska

Wydawnictwo Lekarskie PZWL dziękuje Centrum Onkologii im. prof. F. Łukaszczyka w Bydgoszczy za pomoc w wydaniu książki

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2017 r., (wyd. I) 

Warszawa 2019

ISBN 978-83-200-5723-2

PZWL Wydawnictwo Lekarskie

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 695 43 21

www.pzwl.pl 

Księgarnia wysyłkowa:

tel. 42 680 44 88; infolinia: 801 33 33 88

e-mail: wysylkowa@pzwl.pl

Skład wersji elektronicznej na zlecenie PZWL Wydawnictwa Lekarskiego: mobisfera.pl

Autorzy

prof. dr hab. n. med. Łukasz Wicherek

Katedra i Klinika Onkologii, Radioterapii i Ginekologii Onkologicznej

Collegium Medicum w Bydgoszczy

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Oddział Kliniczny Ginekologii Onkologicznej

Centrum Onkologii im. prof. Franciszka Łukaszczyka w Bydgoszczy

prof. dr hab. n. med. Zbigniew Kojs

Klinika Ginekologii Onkologicznej

Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie

Oddział w Krakowie

prof. dr hab. n. med. Grzegorz H. Bręborowicz

Katedra i Klinika Perinatologii i Ginekologii

Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu

* * *

dr n. med. Anna Abacjew-Chmyłko

Katedra i Klinika Ginekologii, Ginekologii Onkologicznej i Endokrynologii Ginekologicznej

Gdański Uniwersytet Medyczny

prof. Naoual Bakrin, M. D., Ph. D.

Department of Surgical Oncology

University Hospital of Lyon-Sud

Dario Baratti, M. D.

Peritoneal Surface Malignancy Program

Department of Surgery

Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori, Milan

Aditi Bat, M. D.

Department of Surgical Oncology

Fortis Hospital, India

dr n. med. Jan Bieńkiewicz

Klinika Ginekologii Operacyjnej, Endoskopowej i Ginekologii Onkologicznej

Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi

prof. Jean-Marc Classe, M. D., Ph. D.

Department of Surgical Oncology

Institut de Cancerologie de l’Ouest – Gauducheau, Saint Herblain

dr n. med. Bożena Cybulska-Stopa

Oddział Kliniczny Onkologii

Szpital Uniwersytecki w Krakowie

prof. Marcello Deraco, M. D., Ph. D.

Peritoneal Surface Malignancy Program

Department of Surgery

Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori Milan

dr n. med. Konrad Dziobek

Oddział Kliniczny Ginekologii Onkologicznej

Centrum Onkologii im. prof. Łukaszczyka w Bydgoszczy

Jean-Sebastien Frenel, M. D.

Department of Medical Oncology

Institut de Cancerologie de l’Ouest - Gauducheau, Saint Herblain

dr hab. n. med. Zbigniew Friebe

Klinika Ginekologii

Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu

Prof. Olivier Glehen, M. D., Ph. D.

Department of Surgical Oncology

University Hospital of Lyon-Sud

dr n. med. Tomasz Góra

Klinika Ginekologii i Położnictwa

Kliniczny Szpital Wojewódzki w Rzeszowie

prof. dr hab. n. med. Krzysztof Grabowski

Katedra i Klinika Chirurgii Przewodu Pokarmowego i Chirurgii Ogólnej

Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu

Marcello Guaglio, M. D.

Peritoneal Surface Malignancy Program

Department of Surgery

Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori Milan

Isabelle Jaffre, M. D.

Department of Surgical Oncology

Institut de Cancerologie de l’Ouest – Gauducheau, Saint Herblain

dr n. med. Marek Jasiówka

Klinika Ginekologii Onkologicznej

Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie w Krakowie

Vahan Kepenekian, M. D.

Department of Surgical Oncology

University Hospital of Lyon-Sud

prof. dr hab. n. med. Witold Kędzia

Klinika Ginekologii

Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu

dr n. med. Anna Koper

Centrum Onkologii im prof. F. Łukaszczyka w Bydgoszczy

dr n. med. Krzysztof Koper

Katedra i Klinika Onkologii, Radioterapii i Ginekologii Onkologicznej

Collegium Medicum w Bydgoszczy

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Oddział Chemioterapii

Centrum Onkologii im. prof. F. Łukaszczyka w Bydgoszczy

dr hab. n. med. Małgorzata Klimek

Klinika Ginekologii Onkologicznej

Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie

Oddział w Krakowie

dr hab. n. med. Paweł Knapp, prof. UMB

Klinika Ginekologii i Ginekologii Onkologicznej

Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

prof. dr hab. n. med. Jan Kotarski

I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

prof. dr hab n. med. Janusz Kowalewski

Katedra i Klinika Chirurgii Klatki Piersiowej i Nowotworów

Collegium Medicum w Bydgoszczy

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Oddział Kliniczny Chirurgii Klatki Piersiowej i Nowotworów

Centrum Onkologii im. prof. F. Łukaszczyka w Bydgoszczy

dr n. med. Jacek Kupisiak

Oddział Anestezjologii i Intensywnej Terapii

Centrum Onkologii im. prof. Franciszka Łukaszczyka w Bydgoszczy

prof. Shigeki Kusamura, M. D., Ph. D.

Peritoneal Surface Malignancy Program

Department of Surgery

Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori Milan

dr hab. n. med. Marzena Anna Lewandowska

Zakład Genetyki i Onkologii Molekularnej

Centrum Onkologii im. Prof. F. Łukaszczyka w Bydgoszczy

Katedra i Klinika Chirurgii Klatki Piersiowej i Nowotworów

Collegium Medicum w Bydgoszczy

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

dr n. med. Paweł Mach

Klinika Ginekologii i Położnictwa

Uniwersytet Duisburg-Essen

prof. dr hab. n. med. Andrzej Malinowski

Klinika Ginekologii Operacyjnej, Endoskopowej i Ginekologii Onkologicznej

Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi

dr hab. n. med. Barbara Marzec-Kotarska

Katedra Patomorfologii Klinicznej

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Sanket S. Mehta, M. D.

Department of Peritoneal Surface Oncology

Saifee Hospital, India

dr n. med. Jerzy Mielko

Klinika Chirurgii Onkologicznej

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Guillaume Passot, M. D.

Department of Surgical Oncology

University Hospital of Lyon-Sud

dr hab. n. med. Kazimierz Pityński, prof. UJ

Katedra Ginekologii i Położnictwa

Klinika Ginekologii Onkologicznej

Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum

dr n. med. Wojciech Polenceusz

Oddział Anestezjologii i Intensywnej Terapii

Centrum Onkologii im. prof. Franciszka Łukaszczyka w Bydgoszczy

prof. dr hab. n. med. Wojciech P. Polkowski

Klinika Chirurgii Onkologicznej

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

lek. Karol Rawicz-Pruszyński

Klinika Chirurgii Onkologicznej

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Dominique Rigaud, M. D.

Department of Medical Oncology

Institut de Cancerologie de l’Ouest – Gauducheau, Saint Herblain

Gabrielle Selmes, M. D.

Department of Surgical Oncology

Institut de Cancerologie de l’Ouest – Gauducheau, Saint Herblain

Selmes Gabrielle

prof. dr hab. n. med. Andrzej Skręt

Klinika Ginekologii i Położnictwa

Kliniczny Szpital Wojewódzki w Rzeszowie

prof. dr hab. n. med. Joanna Skręt-Magierło

Klinika Ginekologii i Położnictwa

Kliniczny Szpital Wojewódzki w Rzeszowie

prof. dr hab. n. med. Andrzej Stelmach

Klinika Chirurgii-Onkologicznej i Urologii

Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie w Krakowie

dr hab. n. med. Rafał Tarkowski

I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

dr hab. n. med. Iwona Wertel

I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

prof. dr hab. n. med. Jacek R. Wilczyński

Klinika Ginekologii Operacyjnej i Endoskopowej

Katedra Położnictwa, Ginekologii i Ginekologii Onkologicznej

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

prof. dr hab. n. med. Andrzej Witek

Katedra i Klinika Ginekologii i Położnictwa

Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

dr hab. n. med. Dariusz Grzegorz Wydra

Katedra i Klinika Ginekologii, Ginekologii Onkologicznej i Endokrynologii Ginekologicznej

Gdański Uniwersytet Medyczny

dr n. med. Tomasz Żak

Ośrodek Diagnostyki i Leczenia Niepłodności

MedART w Poznaniu

Przedmowa

Współczesna onkologia jest w znacznej mierze postępowaniem interdyscyplinarnym. W wyniku dynamicznego rozwoju tej dziedziny choroba nowotworowa stała się schorzeniem przewlekłym i wymaga w związku z tym podejścia odmiennego od dotychczasowego. W ostatnich latach z ginekologii wyodrębnia się nowa dziedzina – ginekologia onkologiczna, która rozwija się na styku chirurgii onkologicznej, chemioterapii i radioterapii. Ginekolog onkolog uczestniczy w każdym etapie leczenia chorych na nowotwory złośliwe, wywodzące się z kobiecych narządów płciowych. Wyodrębnienie ginekologii onkologicznej nie jest procesem usamodzielniania. Zgodnie z zasadami onkologii ginekolog onkolog jest częścią wielospecjalistycznego zespołu terapeutycznego, a jego podstawową cechą jest umiejętność współpracy ze specjalistami z innych dziedzin onkologicznych.

Wraz z postępem wiedzy stosowane dotychczas schematy leczenia ulegają stopniowemu przeobrażeniu. Przełomowe dla tego procesu są wieloletnie obserwacje chorych, poddanych leczeniu skojarzonemu, pod kątem zakresu i rozległości wykonanych u nich zabiegów operacyjnych. Obserwacje te wskazują na poprawę wyników leczenia zaawansowanego raka jajnika, gdy terapię rozpoczyna się od operacji chirurgicznej, polegającej na usunięciu wszystkich widocznych ognisk raka. Całkowite przeżycie można wówczas wydłużyć nawet o kilka lat. Wzrasta zatem znaczenie chirurgii i powraca ona na właściwe jej miejsce obok innych metod terapii w leczeniu skojarzonym raka jajnika.

Przed ginekologią onkologiczną stoją także inne wyzwania. Najważniejsze z nich to stosowanie oszczędzających płodność technik operacyjnych w leczeniu raka szyjki macicy. Priorytetem jest upowszechnianie laparoskopii w leczeniu raka szyjki macicy i raka endometrium. Jest ona coraz częściej metodą leczenia z wyboru i już tylko w nielicznych przypadkach wystąpienia wskazań do odstąpienia od tego zabiegu, przeprowadza się laparotomię

Ginekologia jest specjalnością chirurgiczną, dlatego ginekolog onkolog tylko jako sprawny operator może zająć odpowiednie miejsce w interdyscyplinarnym zespole terapeutycznym obok onkologa i radioterapeuty. Zdobycie takiego poziomu umiejętności należy rozpocząć od zapoznania się z schematami danej techniki operacyjnej i przyswojenia właściwego nazewnictwa. Autorzy tego podręcznika podjęli wysiłek ujednolicenia nazewnictwa z zakresu technik operacyjnych stosowanych w ginekologii onkologicznej. Starannie opracowali poszczególne rozdziały, tak by przybliżyć wiedzę z zakresu anatomii potrzebną do zrozumienia poszczególnych etapów danego zabiegu operacyjnego. Jednak w obliczu wyzwań, z jakimi mierzą się na co dzień ginekolodzy onkolodzy, nie wystarczy im poprawny, teoretyczny warsztat chirurgiczny. Wiedza ginekologa onkologa musi być szeroka, a także na wskroś praktyczna.

Do podstawowych umiejętności ginekologa onkologa należy wiele takich, które dotychczas uważano za typowo chirurgiczne, np. szycie naczyń. Poza zabiegami takimi jak histerektomia ginekolog onkolog musi umieć biegle wykonywać takie procedury, jak limfadenektomia lub resekcje w obrębie przewodu pokarmowego. Powinien także opanować techniki rekonstrukcyjne w zakresie układu moczowego i przewodu pokarmowego. W ginekologii onkologicznej operacje nie ograniczają się tylko do miednicy; w większości przypadków raka jajnika ginekolog onkolog musi działać także w nadbrzuszu, a wykonanie zabiegu całkowitej cytoredukcji nierzadko wymaga przeprowadzenia procedur takich jak resekcja przepony nacieczonej przez nowotwór. W przypadku wytworzenia dostępu do klatki piersiowej ginekolog onkolog musi umieć prawidłowo go zaopatrzyć.

Podstawowa zasada chirurgiczna mówi, że jeżeli wykonujemy dany zabieg operacyjny, to jesteśmy zobowiązani naprawić jego powikłania. Dlatego do zakresu umiejętności ginekologa onkologa zaliczyć należy skuteczne postępowanie chirurgiczne w zapaleniu otrzewnej, perforacji przewodu pokarmowego lub niedrożności. Codzienność w pracy ginekologa onkologa to nie tylko zaopatrywanie przetok w obrębie przewodu pokarmowego albo układu moczowego, lecz także sprawne działanie naprawcze w przypadku krwotoku przy urazie dużych naczyń.

Ginekolog onkolog to synonim sprawnego operatora. Ważne jest, by specjalizacja ta łączyła w sobie odpowiedni zakres umiejętności praktycznych ze znaczącą podbudową teoretyczną. Można to uzyskać tylko na drodze długoletniego szkolenia i nieustającego doskonalenia się. Ginekolog onkolog musi regularnie operować, aby utrzymać wysoki poziom sprawności. Wykonywanie pojedynczych zabiegów od czasu do czasu to zbyt mało. Chirurgia jest dziedziną sztuki i – jak rysunek – wymaga ciągłego dążenia do perfekcji. Niezwykłą wagę ma dokładność i dbałość o szczegóły. W codziennej pracy należy unikać rutyny i uproszczeń, ale przede wszystkim należy nieustannie ćwiczyć swoje umiejętności.

W ginekologii onkologicznej zdobywanie doświadczenia należy rozpocząć od obserwowania doświadczonych lekarzy i odpowiedniego poszerzenia swojej wiedzy. Należy opracować własny schemat ciągłego ulepszania swojego warsztatu chirurgicznego i stopniowo poszerzać zakres wykonywanych zabiegów, utrwalając zdobyte umiejętności przez codzienne operowanie. Pośpiech jest niewskazany. Nie ma miejsca na brawurę. To długotrwały proces wymagający cierpliwości, pokory i niejednokrotnie pokonywania własnych słabości. Wykonując odpowiednio dużą liczbę zabiegów, zdobywa się doświadczenie, które pomaga wytworzyć w sobie odpowiedni dystans do pracy.

Taki indywidualny plan szkolenia, uwzględniający umiejętności wyjściowe oraz dostęp do określonych procedur chirurgicznych, należy stopniowo i cierpliwie realizować. Konsekwencja działania zaowocuje sukcesem, a o wynikach świadczyć będzie wieloletnia obserwacja operowanych chorych.

Niniejszy podręcznik stanowi swego rodzaju mapę takiego szkolenia; czytelnik znajdzie w nim wszystko, co niezbędne: podstawowy zakres wiedzy teoretycznej i szczegółowe informacje praktyczne. Naukę należy rozpocząć od przyswojenia sobie wiedzy teoretycznej. Praktyczne wskazówki pomogą zrozumieć szkolącemu się lekarzowi działanie bardziej doświadczonych kolegów, których będzie obserwował na początku swojej chirurgicznej drogi. Gdy podejmie samodzielną praktykę, a jego umiejętności będą stopniowo rosły, zawarta w odpowiednich rozdziałach wiedza stanie się pomocna w planowaniu konkretnego zabiegu operacyjnego. W podręczniku znajdują się także praktyczne wskazówki postępowania w przypadku wystąpienia powikłania. Autorzy położyli nacisk, by przy każdym opisie techniki operacyjnej wyszczególniono: kiedy i jakie powikłania występują najczęściej, tak aby operujący lekarz mógł ich skutecznie uniknąć; zostały także podane metody ich naprawy i leczenia.

W podręczniku zwrócono też uwagę na konieczność wprowadzenia zmian organizacyjnych opieki w ginekologii onkologicznej. W miarę możliwości przedstawiono propozycje takich zmian. Modyfikacje schematów postępowania terapeutycznego wymagają równoległych zmian organizacyjnych, aby ośrodki onkologiczne mogły sprostać wyzwaniom, jakie stanowią nowe techniki operacyjne. Niezbędne jest utworzenie sieci wyspecjalizowanych ośrodków onkologicznych, które zapewnią optymalne warunki pracy dla interdyscyplinarnego zespołu terapeutycznego oraz pełnowymiarową opiekę nad pacjentami w okresie okołooperacyjnym. W takim ośrodku powinno być także realizowane szkolenie w zakresie leczenia operacyjnego w ginekologii onkologicznej, gdyż na każdym etapie szkolenia warunkiem powodzenia jest udział w leczeniu odpowiednio dużej liczby chorych.

Autorzy podręcznika, doświadczeni operatorzy, przygotowali praktyczny przewodnik, który pozwoli rozwinąć nieprzeciętne umiejętności (nierozerwalnie związane z wysokim stopniem wyoperowania) lekarzom zdecydowanym, by doskonalić swoje umiejętności chirurgiczne w ginekologii onkologicznej.

Łukasz Wicherek

Zbigniew Kojs

Grzegorz H. Bręborowicz

1 Historia wycięcia macicy – kierunki rozwoju metod operacyjnych Zbigniew Friebe

Pierwsze wzmianki o możliwości wycięcia macicy u kobiet znaleziono w greckich manuskryptach pochodzących sprzed 2000 lat. Nie ma jednak żadnych dowodów na to, że taka operacja była wtedy rzeczywiście wykonywana. Najwcześniejsze opisy przeprowadzanych histerotomii, zwykle tragicznych w skutkach, pochodzą z XVI wieku. Jednak prawdziwy początek rozwoju metod histerektomii pochwowej i brzusznej przypada na XIX wiek za sprawą pionierskich prac Langenbecka i Claya. Późniejszy rozwój anestezjologii, transfuzjologii, aseptyki i wprowadzenie antybiotyków przy szybko rozwijających się nowych technikach chirurgicznych przyczyniły się do tego, że histerektomia stała się drugą co do częstości po cięciu cesarskim operacją wykonywaną u kobiet. W pierwszej połowie XX wieku standardem było nadszyjkowe wycięcie macicy, które od 1950 r. zastąpione zostało całkowitym (wraz z szyjką macicy). Nie jest to ostatnia zmiana, bowiem od kilku lat ponownie wzrosło zainteresowanie histerektomią subtotalną.

Rozwój nowej procedury – pochwowego wycięcia macicy w asyście laparoskopowej, przypada na 1990 rok. Właśnie wdrożenie tej metody spowodowało powrót do pochwowego sposobu wycięcia macicy. Rekomenduje się ją w leczeniu większości nienowotworowych chorób macicy wymagających interwencji chirurgicznej.

XXI wiek to w ginekologii także rozwój alternatywnych do histerektomii metod leczenia, takich jak endoskopia operacyjna – głównie histeroskopia, embolizacja naczyń macicznych w leczeniu mięśniaków macicy oraz stosowanie lewonorgestrelu we wkładkach domacicznych. Panuje pogląd, że wdrożenie tych metod może znacząco ograniczyć liczbę wykonywanych histerektomii. Jak dotąd brak przekonujących danych na ten temat.

Od starożytności do początków XX wieku

Najstarszą opublikowaną pracę z zakresu ginekologii przypisuje się Soronusowi (98–138) z Efezu. Soronus poddaje pod dyskusję problem wypadania macicy u kobiet. Przedstawia pogląd o braku konieczności wycinania macicy z tego powodu. Radzi jednak, by w przypadku gdy wypadnięta macica całkowicie sczernieje, odciąć ją. Nie ma żadnych dowodów na to, że Soronus osobiście wykonywał takie zabiegi, ale powołuje się on na wiedzę Temisona z Aten, który żył w I wieku przed Chrystusem i uważał, że macica nie jest narządem niezbędnym do życia kobiety, bowiem pomijając fakt, że samoistnie wypada, to można ją nawet odciąć, pozostawiając kobietę przy życiu [1].

Dalszy rozwój metody pochwowego wycięcia macicy przypada na wieki XVI i XVII, z których pochodzi kilka notowań opisujących takie operacje. Pierwszy był włoski anatom Giacomo Berengario da Carpi, który w 1517 r. odciął wypadającą macicę [2]. W tym czasie powodem odcięcia macicy było albo jej wypadanie, albo rak szyjki macicy. Większość wczesnych prób chirurgicznego leczenia tych dolegliwości i chorób w praktyce ograniczała się do odcięcia tylko szyjki i dolnej części trzonu macicy – tak jak w opisie Osiandera dotyczącym ośmiu leczonych przez niego pacjentek z rakiem szyjki. W kwietniu 1812 r. także włoski chirurg G.B. Palletta z Mediolanu niechcący wykonał wycięcie całej macicy, planując odcięcie samej szyjki z podejrzeniem raka. Pacjentka umarła w 3. dobie po operacji z powodu zakażenia.

Pierwszą planową operację pochwowego wycięcia macicy wykonał w 1813 r. Konrad Langenbeck (informację o tym opublikował dopiero w 1817 r.). Pacjentką była 50-letnia kobieta prawdopodobnie z rakiem szyjki macicy. Langenbeck wykonał operację bez znieczulenia i asysty [3]. Uważał, że otwarcie otrzewnej może być dla pacjentki bardzo niebezpieczne, dlatego przezornie wykonywał operację całkowicie pozaotrzewnowo, pozostawiając część dna macicy nieruszoną. Mimo dużej utraty krwi podczas operacji pacjentka przeżyła jeszcze 26 lat. Umierając w 76. roku życia poświadczyła tym samym, że podjęte przez Langenbecka leczenie było słuszne. Konrad Johan Martin Langenbeck (1776–1851) był profesorem anatomii i chirurgii w Getyndze.

Jak wynika z opisu dokonanego przez Percivala Willoughby’ego (1596–1685), w XVII wieku w Derby pewna kobieta będąca położną, cierpiąca z powodu wypadania macicy, wierząc, że sama może sobie pomóc, własnoręcznie, za pomocą noża odcięła sobie macicę wraz z częścią pochwy i szyi pęcherza moczowego. Chociaż rana była bardzo duża, krwawienie opanowano, jednak wytworzyła się przetoka pęcherzowo-pochwowa, której nie udało się wyleczyć. Mimo cierpień z tym związanych kobieta przeżyła wiele lat po zabiegu [4].

Pierwszą planową operację pochwowego wycięcia macicy z innego powodu niż wypadanie tego narządu, wykonaną z otwarciem jamy otrzewnej, przeprowadził 22 stycznia 1822 r. Sauter z Baden [5]. Wskazaniem do operacji był rak szyjki macicy. Operator bardzo dokładnie opisał wypadnięcie jelita przez otwartą otrzewną pod koniec operacji. Pacjentka (z powstałą po operacji przetoką pęcherzowo-pochwową) przeżyła jeszcze 6 miesięcy i zmarła wskutek dalszego rozwoju raka.

Następnymi, którzy z powodu raka szyjki macicy wycięli macicę przez pochwę, byli niemiecki ginekolog Adam Elias von Siebold (kwiecień 1824 r.) i James Blundell z Londynu (styczeń 1828 r.). Operacje te przeprowadzane były bez znieczulenia, bez zacisków oraz bez mającego zahamować krwawienie podwiązywania tętnic macicznych [6].

Dopiero w lipcu 1829 r. paryski chirurg Joseph Récamier wykonał pochwowe wycięcie macicy, podwiązując obie tętnice maciczne i więzadła szerokie macicy. Operacja trwała 20 minut. Pacjentka przeżyła zabieg, później zmarła z powodu dalszego rozwoju raka szyjki macicy. W tym czasie śmiertelność okołooperacyjna związana z histerektomią pochwową była bardzo wysoka – do 1830 r. na 15 wykonanych operacji przeżyły tylko 3 kobiety [7].

Polska historiografia odnotowuje pierwsze próby wycięcia macicy przez pochwę w połowie XIX wieku. Lekarze, którzy podjęli się tych operacji, związani byli z ośrodkiem warszawskim. Pierwszą niezamierzoną operację wycięcia macicy drogą pochwową wykonał Aleksander Antoni Le Brun (1803–1868), naczelny lekarz Szpitala Dzieciątka Jezus.

Drugie wycięcie macicy przez pochwę wykonał, również w Warszawie, Adam Gliszczyński. Wskazaniem do operacji było wynicowanie macicy, któremu towarzyszyły krwotoki i infekcje. Po nieudanej próbie odprowadzenia macicy Gliszczyński zdecydował się na operację wycięcia macicy za pomocą odgniatacza. Chora zmarła w 3 godziny po operacji wskutek wstrząsu pooperacyjnego lub krwotoku wewnątrzotrzewnowego.

Trzecią w kolejności operację wycięcia macicy przez pochwę wykonaną w Polsce przeprowadził Polikarp Girsztowt 3 stycznia 1867 r. z powodu „nowotworowego owrzodzenia” szyjki macicy z naciekaniem na przednią ścianę pochwy. Była to pierwsza w Polsce planowo przeprowadzona operacja wycięcia macicy przez pochwę przy jej prawidłowym położeniu. Operacja trwała 30 minut i wykonywana była bez znieczulenia. Po okrojeniu części pochwowej szyjki macicy palcami oddzielono macicę od pęcherza moczowego i odbytnicy, następnie założono odgniatacz i wycięto macicę. Chora zmarła w 11. dobie po operacji z powodu kałowego zapalenia otrzewnej spowodowanego wylewaniem się treści kałowej z pęknięcia nowotworowo zmienionej ściany okrężnicy.

Dalszy rozwój operacji wycięcia macicy drogą pochwową związany był z kliniką chirurgiczną w Krakowie, kierowaną przez profesora Jana Mikulicza-Radeckiego. To on wprowadził liczne zmiany w technice pochwowego wycięcia macicy, polegające na starannym zakładaniu podwiązek en masse na małe pęczki tkankowe, przy czym nie zszywał otrzewnej miednicy mniejszej z obawy przed zatrzymaniem odpływu wydzieliny z jamy otrzewnej i stworzeniem warunków dla rozwoju bakterii chorobotwórczych. Po operacji zakładał do pochwy gazę jodoformową jako środek antyseptyczny.

Wszystkie wczesne próby przeprowadzenia wycięcia macicy w trakcie laparotomii kończyły się tragicznie. Potrzeba było aż 36 lat, by po pierwszej nieudanej operacji wycięcia macicy doczekać się sukcesu.

Wypracowanie metody brzusznego wycięcia macicy związane jest ściśle z dokonaniami chirurgów, którzy jako pierwsi wykonali i opisali operacje wycięcia jajników. W 1809 r. Ephraim McDowell (1771–1830) z Kentucky wykonał pierwszą z trzech (opisanych przez niego dopiero w 1817 r.) pierwszych zakończonych sukcesem laparotomii przeprowadzonych z zamiarem wycięcia guzów jajnika [8]. Po nim operację taką powtórzyło wielu innych, co spowodowało, że w połowie XIX wieku wycięcie guzów jajnika stało się najczęściej wykonywaną procedurą chirurgiczną w ginekologii. W tym czasie przeżywalność po takiej operacji znacząco się poprawiała, do czego przyczyniło się także wprowadzenie anestezji. Przy całkowitym braku wiedzy w zakresie zasad aseptyki chirurdzy nie byli świadomi, dlaczego najlepsze wyniki po wykonaniu laparotomii w celu wycięcia guza jajnika mieli ci z nich, którzy podobnie jak McDowell, wykazywali pedantyczne upodobanie do schludności i czystości.

W Europie pionierem, który udanie przeprowadził kilka takich operacji, był Charles Clay (1801–1893) z Manchesteru. Gdy 17 listopada 1843 r. zaczynał swoją piątą laparotomię z zamiarem wycięcia guza jajnika, nie przypuszczał, że przejdzie do historii jako ten, który pierwszy wykonał nadszyjkowe wycięcie macicy. Kiedy rozciął powłoki brzuszne, pacjentka zakaszlała, co spowodowało wypadnięcie przez ranę na brzuchu zmienionej mięśniakowato dużej macicy, której Clay w żaden sposób nie mógł włożyć z powrotem. Zdecydował się na pierwsze nadszyjkowe wycięcie macicy. Towarzyszyło mu bardzo obfite krwawienie, z powodu którego kobieta krótko po operacji zmarła. Cztery dni później Ashton Marlow Heath, inny chirurg pochodzący z Manchesteru, dokonał podobnego wyczynu, wycinając mięśniakowatą macicę w przekonaniu, że jest to olbrzymia torbiel jajnika. I ta pacjentka zmarła z powodu wykrwawienia. W 1844 r. Clay operował 52-letnią kobietę z powodu olbrzymiej torbieli jajnika. Po jej wydobyciu stwierdził dodatkowo ważące 9 kg mięśniaki macicy. Wykonał nadszyjkowe wycięcie macicy wraz z przydatkami, używając nawoskowanych konopi indyjskich jako podwiązki założonej na kikut szyjki. Po operacji pacjentka czuła się względnie dobrze, w 13. dobie wstała z łóżka, by zmienić pościel. Dwa dni później zmarła. Clay był więc pierwszym, który wykonał brzuszną histerektomię, ale nie pierwszym, którego operacja zakończyła się szczęśliwie [9].

Pierwszą planowaną brzuszną histerektomię z powodu mięśniaków macicy wykonał John Bellinger (1804–1860) z Charleston w 1846 r. Pacjentka zmarła z powodu zakażenia w 5. dniu po operacji.

Pierwszym, który wykonał operację (nieplanowaną) brzusznego wycięcia macicy, był Walter Burnham (1808–1883) z Lowell w Massachusetts. Burnham, podobnie jak Clay, zamierzając wyciąć torbiel jajnika, stwierdził dodatkowo mięśniakowato zmienioną macicę, która wypadłszy przez nacięcie powłok wykonane przez chirurga, nie dawała się schować. Operacja wykonywana była w znieczuleniu chloroformem. Podczas operacji Burnham podwiązał najpierw dwie tętnice jajnikowe, następnie powoli i dokładnie oddzielił zmienioną macicę od więzadeł i wszystkich otaczających ją tkanek aż do niezmienionej szyjki macicy. W tym miejscu podwiązał obie tętnice maciczne. Pacjentka przeżyła operację dzięki między innymi takim środkom jak brandy i opium. Burnham uważał operację za niezwykle trudną i skomplikowaną [10].

Zaszczyt przeprowadzenia pierwszej planowej i zakończonej sukcesem histerektomii brzusznej spada na Gilmana Kimballa (1804–1892). Dokonał tego u pacjentki z mięśniakami macicy, którym towarzyszyły obfite, zagrażające życiu krwawienia. W 1853 r. Kimball przeprowadził nadszyjkowe brzuszne wycięcie macicy, po którym chora wyzdrowiała. Wcześniej Kimball wykonał dwie histerektomie przypadkowo, operując z powodu torbieli jajnika, ale obie kobiety po operacji zmarły [11].

Na podstawie doświadczeń uzyskanych podczas prób wycięcia macicy drogą pochwową i z dostępu brzusznego zaproponowano wykonanie tej operacji z jednoczesnym wykorzystaniem obu metod. Koncepcję wysunął, ale nigdy jej nie wypróbował, niemiecki chirurg Maxentius Joseph Gutberlet. Zaprojektował ściśle przywierającą do szyjki macicy obręcz z uchwytami. Za jej pomocą można było wypychać macicę ku górze, do brzucha. Przez małe nacięcie brzuszne odcinano macicę od jej więzadeł. Ostatnim elementem operacji było pochwowe usunięcie macicy. Pierwszym, który w 1825 r. wyciął macicę, stosując oba dostępy (pochwowy i brzuszny), był Konrad Langenbeck. Nie posługiwał się jednak narzędziem skonstruowanym przez Gutberleta. Wykorzystał je w 1830 r. francuski chirurg Jacques Mathieu Delpech.

W połowie XIX wieku śmiertelność związana zarówno z wykonywaniem pochwowych, jak i brzusznych histerektomii była tak wysoka, że zniechęcała chirurgów do angażowania się w te procedury. Szczególnie niebezpieczne było wykonywanie histerektomii brzusznej (śmiertelność 70%). Wraz z rozwojem anestezji, wprowadzeniem zasad aseptyki oraz ulepszeniem narzędzi chirurgicznych pod koniec XIX wieku wyniki leczenia związane z histerektomią zaczęły być bardziej optymistyczne.

Wielu europejskich ginekologów, a wśród nich Eugene Koeberlé (1828–1915) ze Strasburga i Jules-Emil Péan (1830–1898) z Paryża, byli zwolennikami stosowania różnych zacisków naczyniowych, bardzo pomocnych przy zakładaniu podwiązek na naczynia podczas wykonywania histerektomii. Niektórzy w trakcie histerektomii pochwowej w miejsce podwiązek zakładali zaciski na naczynia i pozostawiali je na 24–48 godzin.

W 1878 r. Wilhelm Freund (1833–1918) opublikował standardową technikę całkowitego brzusznego wycięcia macicy [12]. Przedstawił w niej zasady stosowania zacisków oraz zakładania szwów na więzadła szerokie, naczynia maciczne, więzadła podstawowe i krzyżowo-maciczne.

Pod koniec XIX wieku za sprawą kilku ginekologów, między innymi Czerny’ego z Freiburga, Garceau i Segonda, wzrosło zainteresowanie histerektomią pochwową w leczeniu łagodnych chorób ginekologicznych. Z danych dotyczących Francji i opublikowanych przez Garceau śmiertelność po histerektomii pochwowej wykonanej z powodu mięśniaków wynosiła 1,7%, a z powodu chronicznego zapalenia w obrębie miednicy mniejszej 4,7%. W 1892 r. paryski ginekolog Eugène Doyen (1859–1916) na 112 przeprowadzonych przez siebie histerektomii pochwowych zanotował odsetek śmiertelności 5,3%. Doyen był wielkim orędownikiem wykonywania operacji pochwowych. Zwykł mawiać, że ten, kto nie potrafi wykonać pochwowej histerektomii, nie może się nazywać prawdziwym ginekologiem [13].

Na początku XX wieku śmiertelność kobiet po histerektomii brzusznej zaczęła się zmniejszać, a nawet zrównywać z wynikami osiąganymi po histerektomii pochwowej. Jako przykład można podać porównanie londyńskich wyników histerektomii brzusznej z powodu mięśniaków macicy w 1896 r. (śmiertelność 22%) i 1906 r. (śmiertelność 3,4%).

W Polsce pierwszą operację nadpochwowego wycięcia macicy bez przydatków drogą brzuszną przeprowadził w 1867 r. Polikarp Girsztowt. Zabieg wykonano w znieczuleniu chloroformem. Po otwarciu jamy brzusznej wycięto dziesięciokilogramowy guz wychodzący z tylnej ściany macicy. W okolicy ujścia wewnętrznego macicy założono grubą podwiązkę obejmującą szyjkę macicy i dokonano nadpochwowego wycięcia macicy za pomocą odgniatacza (ecraseur). Obfity krwotok śródoperacyjny opanowano, przyżegając rozżarzonym żelazem krwawiące naczynia. Po kontroli hemostazy zszyto powłoki brzuszne. Chora zmarła w 23. godzinie po operacji [14]. Drugą operację nadszyjkowego wycięcia macicy wraz z lewym jajnikiem przeprowadził Ludwik Neugebauer w 1868 r. w Warszawie. Chora zmarła na 2. dzień po operacji [15]. Trzecią podobną operację w Polsce wykonał w 1869 r. Hipolit Korzeniowski w Warszawie. Chora zmarła w 6. dobie po operacji [16].

Dalszy rozwój techniki wycięcia macicy na ziemiach polskich związany był z osobą Ludwika Rydygiera, który swoją pierwszą operację wycięcia macicy drogą brzuszną wykonał w 1880 r. Rydygier otwierał jamę brzuszną cięciem od spojenia łonowego do pępka, brzegi rany brzusznej obrębiał wraz z otrzewną, po czym wyjmował jelita i zawijał w chustę namoczoną 2% kwasem karbolowym. Po założeniu szwu cuglowego na trzon macicy następowało otwarcie zagłębienia pęcherzowo-macicznego i przecięcie przedniej i tylnej ściany pochwy. Potem Rydygier identyfikował tętnice maciczne, podwiązywał je i przecinał. Następnie podwiązywał i odcinał przymacicza wraz z więzadłami macicy. Operację kończyło oczyszczanie pola operacyjnego, zeszycie otrzewnej miednicy mniejszej, włożenie jelit i zeszycie powłoki jamy brzusznej [17]. Podobną technikę wycięcia macicy per laparotomiam stosował poznański ginekolog Heliodor Święcicki [18].

Pierwszą histerektomię położniczą wykonał Horacy Robinson Storer z Bostonu w 1868 r. u kobiety, która nie mogła urodzić dziecka z powodu dużego mięśniaka szyjkowego. Podjął decyzję o przeprowadzeniu zabiegu z powodu obfitego, zagrażającego życiu krwawienia. Po cięciu cesarskim wykonał nadszyjkowe wycięcie macicy. Niestety kobieta zmarła w 3. dobie po operacji.

Mimo wprowadzenia anestezji pod koniec XIX wieku śmiertelność związana z wykonywaniem cięcia cesarskiego była nadal bardzo wysoka. Wynikało to głównie z długiego czasu trwania porodów, z trudnymi do uniknięcia powikłaniami, takimi jak krwawienie czy zakażenie. Rozwiązanie tego problemu przypisuje się włoskiemu położnikowi Edoardo Porro (1842–1902) z Padwy. Uznał on, że przyczyną krwawienia po cięciu cesarskim jest macica, dlatego właściwym postępowaniem powinno być jej wycięcie. Wykonał wycięcie macicy 21 maja 1876 r. u ciężarnej, u której sprzężna prawdziwa wynosiła 4 cm. Najpierw przeprowadził cięcie cesarskie, następnie wyciął macicę wraz z przydatkami, przyszywając kikut szyjki do powłok brzusznych w miejscu ich przecięcia w celu usunięcia szyjki i pochwy z jamy otrzewnej. Kobieta i jej dziecko były pierwszymi, które przeżyły cięcie cesarskie w tej klinice [19]. Przez jakiś czas technika zaproponowana przez Porro znajdowała naśladowców, później Kehrer i Sanger wykazali, że dokładne zszycie macicy pozwala na jej zachowanie.

W okresie obejmującym drugą połowę XIX wieku wyniki leczenia raka szyjki macicy, niezależnie od tego, czy stosowano pochwową czy brzuszną histerektomię, były przerażające. Jeśli chora nie umarła w konsekwencji wykonanej operacji, to zwykle umierała z powodu szybkiego rozwoju choroby kilka miesięcy później. W 1895 r. John Clarke, w tym czasie pracujący jako rezydent w Klinice Ginekologii John Hopkins Hospital, oraz Emil Ries, jeden z uczniów Freunda, zauważyli, że rak szyjki zwykle rozwija się w tkankach poza macicą, obejmując liczne węzły chłonne, które pozostają często poza cięciem wykonywanym podczas standardowo przeprowadzonej histerektomii. Każdy z nich zaproponował bardziej radykalną operację, obejmującą wycięcie części więzadła szerokiego macicy, pochwę i okoliczne węzły chłonne [20, 21].

W 1898 r. Ernst Wertheim (1864–1920) wykonał jako pierwszy radykalne wycięcie macicy, a metoda operacji do dziś nosi jego imię. Technika Wertheima wynikała ze spostrzeżenia, iż rak szyjki macicy rozprzestrzenia się poza granice macicy dopiero w późnych stadiach choroby, obejmując przymacicza i węzły chłonne. Założył on, że operując radykalnie we wczesnym okresie choroby, usuwa się nacieki nowotworowe. Skuteczność takiego postępowania potwierdziły znacząco lepsze wyniki leczenia raka szyjki macicy [22].

Bardziej radykalne pochwowe wycięcie macicy związane jest z takimi nazwiskami jak Karl Schuchardt (1856–1901) z Getyngi oraz Frederich Schauta (1849–1919) z Wiednia. Mimo tego, że z dostępu pochwowego można wyciąć więcej przymacicz niż z dostępu brzusznego, niemożność wykonania wycięcia węzłów chłonnych w tej procedurze spowodowała, że obowiązującym standardem postępowania we wczesnych postaciach raka szyjki macicy stała się histerektomia radykalna sposobem Wertheima [23].

Zainteresowanie technikami laparoskopowymi w ginekologii pojawiło się w drugiej połowie XX wieku. Na początku wykorzystywano laparoskopię głównie jako metodę diagnostyczną i do tzw. małych procedur w ginekologii operacyjnej, np. podwiązania jajowodów. W latach 80. XX wieku coraz liczniejsi chirurdzy (do wiodących w tej dziedzinie należał Kurt Semm z Kilonii w Niemczech) zaczęli wykonywać coraz bardziej zaawansowane rodzaje operacji. W 1988 r. ginekolog amerykański Harry Reich jako pierwszy przeprowadził całkowite laparoskopowe wycięcie macicy. Wszystkie niezbędne elementy wymagane dla bezpiecznego wycięcia macicy Reich wykonał laparoskopowo, usuwając macicę na zewnątrz przez nacięcie pochwy, które przez niego (podobnie jak następcze zszycie pochwy) również zostało wytworzone laparoskopowo [24]. Po tej operacji zainteresowanie technikami i możliwościami laparoskopii i jej zastosowaniem w ginekologii wśród ginekologów z jednej strony, a firm produkujących narzędzia i sprzęt medyczny z drugiej, bardzo wzrosło.

Procedura zaproponowana przez Reicha rozwinęła się w kierunku histerektomii pochwowej w asyście laparoskopowej. W tej metodzie przy użyciu laparoskopu przecina się więzadła macicy oraz podwiązuje lub koaguluje i przecina tętnice maciczne, a resztę elementów operacyjnych przeprowadza się drogą pochwową.

Rozwinięta metoda mocno przypomina oryginalną technikę histerektomii pochwowej przez przednią kolpotomię opisaną w 1906 r. przez Doderleina i Kroniga. W Ameryce zapoznano się z metodą Doderleina dopiero w 1916 r. za sprawą angielskiego tłumaczenia wykonanego przez amerykańskiego ginekologa Williama Gravesa z Bostonu. Niestety, na tamte czasy metoda okazała się mniej korzystną, niż się spodziewano. Obarczona była też dużą liczbą powikłań, głównie urologicznych. To spowodowało, że wycofano się z niej. Jednak w porównaniu z tą metodą laparoskopowe wycięcie macicy wymaga więcej czasu od operatora, a także wiąże się z dodatkowymi, zwykle znacznymi środkami finansowymi, z których korzysta właściwie tylko mała grupa praktykujących ginekologów. Jakkolwiek nie należy zapominać, że laparoskopia w wytrenowanych i zdolnych rękach operatora stanowi fantastyczne narzędzie, którego użycie gwarantuje doskonałe efekty lecznicze.

Trzeba dodać, że trudności wynikające z konieczności uzupełniania sprzętu i brak stanowisk treningowych powoduje, że zastosowanie metody w szerszym zakresie, głównie jako powszechnej, nie jest możliwe. Dlatego większość ginekologów, opierając się na bardziej realistycznych przesłankach, dąży do tego, by tylko niektóre elementy (niezbędne minimum) wykonywać laparoskopowo, zaś histerektomię przeprowadzać z dostępu pochwowego. W celu ograniczenia powikłań urologicznych Semm zaproponował laparoskopową histerektomię nadszyjkową.

Kierunki dalszego rozwoju metod wycięcia macicy

Stały rozwój chirurgii, w tym również operacyjnych metod w ginekologii, spowodował, że śmiertelność związana z wykonywaniem histerektomii z poziomu 70% w drugiej połowie XIX wieku zmniejszyła się do 2–3% w 1920 r. dla obu metod – brzusznej i pochwowej. Dalszy postęp w rozwoju chirurgii na przełomie XIX i XX wieku wynikał głównie z wprowadzenia znieczulenia ogólnego oraz postępowania antyseptycznego i aseptycznego, a także zrozumienia znaczenia specjalistycznej opieki nad pacjentką w okresie okołooperacyjnym. Podstawy naukowe postępowania aseptycznego w chirurgii stworzyła szybko rozwijająca się mikrobiologia. Olbrzymi wpływ na dalszy rozwój chirurgii miały postępy w zakresie doskonalenia narzędzi, uzupełniania płynów, rozwój anatomii patologicznej oraz wprowadzenie chemioterapii.

Na początku XX wieku, zanim ginekologia jako samodzielna dziedzina medycyny wyodrębniła się z chirurgii, większość histerektomii wykonywana była przez chirurgów ogólnych, którzy zwykle byli mało doświadczeni w operacjach pochwowych, stąd faworyzowali dostęp brzuszny. Wraz ze wzrostem bezpieczeństwa związanego z operacją wycięcia macicy rozszerzał się zakres wskazań do tej operacji. Najczęściej histerektomię wykonywano z powodu mięśniaków macicy lub obfitych krwawień macicznych. W tym okresie, mimo preferowania wycięcia macicy na drodze laparotomii, zarówno w Ameryce, jak i w Europie (szczególnie w Wielkiej Brytanii), było wielu entuzjastów, którzy po mistrzowsku potrafili wyciąć macicę przez pochwę. W Wielkiej Brytanii Vivian Bartley Green-Armytage (1882–1961) przedstawił raport z 500 przeprowadzonych przez siebie histerektomii pochwowych w okresie pomiędzy 1928 a 1938 r. (prawie wszystkie operacje wykonał z powodu łagodnych procesów nowotworowych w macicy). Mógł się poszczycić 1,2% wskaźnikiem śmiertelności oraz całkowitym brakiem powikłań urologicznych. Szeroko promował histerektomię pochwową, uważając, że w porównaniu z histerektomią brzuszną charakteryzuje się ona mniejszą urazowością, mniejszym wstrząsem okołooperacyjnym, możliwością szybszej rekonwalescencji, mniejszymi kosztami oraz mniejszą śmiertelnością.

W Ameryce Północnej najgorętszym entuzjastą wykonywania histerektomii pochwowej był Noble Sproat Heaney (1880–1955) z Chicago. W 1934 r. opublikował wyniki wykonanych samodzielnie 627 pochwowych histerektomii z powodu mięśniaków macicy lub obfitych krwawień macicznych. Na tę liczbę operacji 3 zakończyły się zgonem pacjentek. Heaney był wielkim propagatorem tej metody operacji. Zwykł mawiać, że ginekolodzy, którzy stale doskonalą się w wykonywaniu histerektomii pochwowej, stopniowo mogą sobie pozwolić na omijanie przeciwwskazań do tej operacji, ustawicznie podnoszonych przez grupę chirurgów, którzy nigdy takiej operacji nie wykonali.

Innymi powszechnie znanymi operatorami propagującymi pochwowe wycięcie macicy byli Atlee w Kanadzie, Babcock w Filadelfii i wielu innych w Austrii i Niemczech, jak np. Navratil.

Do połowy XX wieku w zasadzie wszystkie histerektomie przeprowadzane z przyczyn innych niż choroba nowotworowa wykonywano z pozostawieniem szyjki macicy. W porównaniu z operacjami obejmującymi poza wycięciem trzonu także wycięcie szyjki macicy, częściowe wycięcie macicy było łatwiejsze, towarzyszyło mu zdecydowanie mniejsze krwawienie, rzadziej rozwijało się zakażenie oraz znacznie rzadziej dochodziło do jatrogennych urazów w obrębie dolnego odcinka układu moczowego. Przełomowym momentem, w którym zmieniono powszechne stanowisko względem rozległości operacji wycięcia macicy w przypadkach innych niż choroba nowotworowa, był rok 1940. Zauważono, że subtotalna histerektomia wiąże się z niskim, ale istotnym (1%) występowaniem raka szyjki macicy w zachowanym kikucie oraz utrzymującym się skąpym krwawieniem pochodzącym z pozostawionego endometrium w dolnym segmencie macicy u 5% operowanych. Z tych powodów, w warunkach coraz bezpieczniejszego znieczulenia i stałego rozwoju technik operacyjnych, chirurdzy zmienili nastawienie i prawie powszechnie rozpoczęto wykonywanie całkowitego wycięcia macicy sposobem opisanym przez Richardsona. Mimo dynamicznego rozwoju specjalistycznego szkolenia w zakresie położnictwa i ginekologii oraz coraz częstszego wykonywania histerektomii ze wskazań innych niż rak, zdecydowana większość ginekologów także zmieniła stanowisko w sprawie rozległości tej operacji. W rezultacie w Stanach Zjednoczonych i Wielkiej Brytanii odsetek totalnych histerektomii brzusznych ze wskazań pozaonkologicznych wynosił 60–80%, mimo rosnącej liczby doniesień świadczących o mniejszej liczbie powikłań okołooperacyjnych oraz szybszej rekonwalescencji wiążącej się z wcześniejszym rozpoczęciem pracy po przebytej histerektomii pochwowej w porównaniu z brzuszną.

Jak na ironię wprowadzenie metody pochwowego wycięcia macicy w asyście laparoskopowej spowodowało odrodzenie się zainteresowania histerektomią pochwową. Ginekolodzy z praktyką w operacjach laparoskopowych, którzy pierwotnie mieli własne doświadczenia z operacjami pochwowego wycięcia macicy z powodu jej wypadania, stwierdzali, że pochwowy etap operacji wycięcia macicy w asyście laparoskopowej jest znacznie łatwiejszy, bezpieczniejszy i krócej trwający niż ten, który wymaga laparoskopu. W wyniku takich spostrzeżeń wielu ginekologów, nawet tych bardzo dobrze wyszkolonych w operacjach laparoskopowych, wykonuje coraz więcej operacji pochwowego wycięcia macicy jako jedynej procedury. Ponowne „narodziny” metody histerektomi pochwowej znalazły nawet swoją nową, nieco cyniczną i humorystyczną nazwę trocar-less vaginal histerectomy. W ten sposób prawdziwa rola laparoskopii mającej ułatwić operację pochwową ostatecznie znalazła większe zastosowanie dla tych sytuacji klinicznych, w których dostęp pochwowy uniemożliwia przeprowadzenie ważnych etapów operacji wykonalnych jedynie z dostępu brzusznego (np. wycięcie biodrowych węzłów chłonnych jako etap radykalnej histerektomii pochwowej). Coraz częściej uznawany jest pogląd, że zamiast długiego i kosztownego szkolenia laparoskopowego, dużo bezpieczniej, łatwiej i taniej można wyszkolić ginekologa w prawidłowym wykonywaniu histerektomii pochwowej.

Zwiększone zainteresowanie histerektomią pochwową nie jest jedynym powrotem do dawniej uznanych technik operacyjnych w ginekologii, jaki obserwowano w ostatniej dekadzie XX wieku. Można powiedzieć, że koniec XX wieku był czasem ponownych narodzin zainteresowania wycięciem macicy z pozostawieniem kikuta szyjki macicy. Stało się tak wskutek rozpowszechnionego wśród ginekologów poglądu o roli szyjki jako narządu znacznie poprawiającego doznania seksualne kobiet, a także mającego duże znaczenie w zachowaniu integralności dna miednicy mniejszej. Chociaż liczba histerektomii, w których szyjka macicy zostaje zachowana, nie jest duża, wydaje się, że najlepszą metodą operacyjną w takich przypadkach jest laparoskopowe nadszyjkowe wycięcie macicy. Przy wycinaniu macicy o normalnych rozmiarach i kształcie lub tylko nieznacznie powiększonej można też zastosować nadszyjkowe przezpochwowe wycięcie jej zmodyfikowaną metodą Döderleina-Kröniga.

Ostatnie lata są czasem poszukiwania innych, mniej inwazyjnych metod leczenia, które w konsekwencji mogą wpłynąć na zmniejszenie ciągle dużej liczby histerektomii wykonywanych z powodu mięśniaków macicy lub niereagującego na leczenie, obfitego krwawienia z macicy. Jak wynika z coraz liczniejszych doniesień naukowych, do technik, które wpływają na zmniejszenie liczby wykonywanych histerektomii, zaliczyć należy chirurgię histeroskopową, embolizację naczyń macicznych w leczeniu mięśniaków i stosowanie lewonorgestrelu we wkładkach domacicznych [25].

Piśmiennictwo

1. Baskett T.F.: Hysterectomy: evolution and trends. Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol., 2005, 19: 295–305. 2. Garrison FH.: An introduction to the history of medicine. W.B. Saunders, Filadelfia 1929. 3. Langenbeck C.J.M.: Geschichte einer von mir glucklich verichteten extirpation der ganger gebarmutter. Biblioth. Chir. Ophth. Hanover, 1817; 1: 557. 4. Willughby G.I., Blenkinsop H.: Observations in midwifery. Shakespeare Printing Press, Warwick 1863. 5. Ricci J.V.: The development of gynaecological surgery and instruments. Blakiston, Filadelfia 1949. 6. Blundell J.: Two cases in which extirpation of the uterus was performed. Lond. Med. Gaz., 1828, 2: 733. 7. Benrubi GI.: History of hysterectomy. J. Fla. Med. Soc., 1988, 75: 533–538. 8. Baskett T.F.: On the shoulders of giants: eponyms and names in obstetrics and gynaecology. RCOG Press, Londyn 1996. 9. Sutton C.: Hysterectomy: a historical perspective. Clin. Obstet. Gynaecol., 1997, 11: 1–22. 10. Burnham W.: Extirpation of the uterus and ovaries for sarcomatous disease. Nelson’s Am. Lancet., 1854, 8: 147–151. 11. Kimball G.: Successful case of extirpation of the uterus. Boston Med. Surg. J., 1855, 52: 249–255. 12. Freund W.: Eine neue Methode der Exstirpation des ganzen Uterus. Somml. Klin. Vortr. Gynäk., 1878, 41: 911–924. 13. Green-Armytage V.B.: The rise of surgical gynaecology 1800–1950. w Historical review of British obstetrics and gynaecology (red. J.M. Kerr JM, R.W. Johnstone, M.H. Phillips). E&S Livingstone, Edynburg 1950. 14. Girsztowt P.: Extirpatio uteri. Pamiętnik Towarzystwa Lekarskiego Warszawskiego, 1867, 58: 364–365. 15. Neugebauer L.A.: Wycięcie wielkiego guza macicy wraz z lewym jajnikiem. Pamiętnik Towarzystwa Lekarskiego Warszawskiego, 1869, 61: 241–252. 16. Korzeniowski H.: Kol. Korzeniowski podaje następujący opis ważnej operacji dokonanej w klinice chirurgicznej w Szpitalu Świętego Ducha. Pamiętnik Towarzystwa Lekarskiego Warszawskiego, 1869, 61: 221–226. 17. Rydygier L.: Drugi przypadek wycięcia całej macicy wraz z jajnikami i kilka uwag o zmianach poczynionych w sposobie operowania Freuda. Przegląd Lekarski, 1880, 38: 487–489. 18. Święcicki H.: Kilka słów o wycinaniu mięśniakowatej i zrakowaciałej macicy. Nowiny Lekarskie, 1894, 6: 396–399. 19. Porro E. Della amputazione utero–ovarica come complemento di taglio cesarea. Ann. Univ. Med. Chir. (Milan), 1876, 237: 289–350. 20. Clark J.G.: A more radical method of performing hysterectomy for cancer of the uterus. Johns Hopkins Hosp. Bull., 1895, 36: 212–240. 21. Ries E.: Eine neue Operationsmethode des Uteruscarcinoms. Ztschr. Geburtsh. Gynäk., 1895, 32: 266–274. 22. Wertheim E.: Zur Frage der Radicaloperation beim Uteruskerbs. Arch. Gynäk., 1900, 61: 627–668. 23. Köhler C., Possover M.: Renaissance der Operation nach Schauta. Der Gynäkologe, 2002, 35: 132–145. 24. Reich H., de Cripo J., McGlynn F.: Laparoscopic hysterectomy. J. Gynaecol. Surg., 1989, 5: 213–215. 25. Baskett T.F., Skedgell C.D., Pennock M.: Hysterectomy trends in Nova Scotia: 1992–2000. J. Obstet. Gynaecol. Can., 2002, 24: 662.

2 Perspektywy leczenia raka jajnika Jan Kotarski, Barbara Marzec-Kotarska, Rafał Tarkowski, Iwona Wertel

Rak jajnika jest nowotworem o złym rokowaniu. Wiele chorych w zaawansowanym stadium, leczonych operacyjnie oraz chemioterapią z zastosowaniem platyny i taksoidów dobrze reaguje na terapię, lecz niestety u większości z nich szybko dochodzi do nawrotu choroby. Pomimo postępu w leczeniu operacyjnym oraz farmakoterapii raka jajnika 5-letnie przeżycie w zależności od zaawansowania nowotworu w chwili rozpoznania oraz pozostawionej choroby resztkowej wynosi od 19 do 90%.

Powstawanie nowotworów nie jest procesem opartym na prostych zależnościach przyczynowo-skutkowych. Stanowi wynik zaburzeń wieloczynnikowych, efekt wzajemnego oddziaływania wielu różnych komórek zarówno nowotworowych, jak i towarzyszących guzowi, warunkujących proces powstawania i wzrastania guza, naciekanie otaczających tkanek i narządów, a także występowanie przerzutów odległych. Nadal nie ma jednoznacznych wyników badań określających sekwencję zdarzeń molekularnych prowadzących do transformacji nowotworowej w jajniku. Takie wyraźne zmiany morfologiczne i etapy poprzedzające powstanie nowotworu opisano w przypadku raka jelita grubego i wielu innych nowotworów nabłonkowych [1, 2].

W komórce nowotworowej uruchomione zostają mechanizmy niefunkcjonujące w komórkach prawidłowych. Efektem tych zmian jest niekontrolowana proliferacja komórek, będąca następstwem zaburzenia regulacji cyklu komórkowego, aktywacji protoonkogenów komórkowych lub inaktywacji genów supresorowych.

Nowe klasyfikacje raka jajnika oparte są głównie na charakterystyce molekularnej odniesionej do właściwości klinicznych i biologicznych guza. Na tej podstawie Kurman zaproponował podział raków jajnika na dwa typy [3, 4].

Guzy typu I charakteryzują się mutacjami wielu genów i stosunkowo dużą stabilnością genetyczną. Stwierdza się w nich najczęściej mutacje genów KRAS, BRAF, PTEN i β-kateniny [5–7]. W wysoko zróżnicowanych rakach surowiczych oraz guzach surowiczych o granicznej złośliwości wykazano takie same sekwencje mutacji w onkogenach KRAS, BRAF i ERBB2. Mutacje w genach KRAS i BRAF występują już na bardzo wczesnym etapie powstawania nowotworu surowiczego o granicznej złośliwości, a także były obecne w sąsiadującej tkance torbielakogruczolaka. Mutacje w genach KRAS i BRAF stwierdzono również w około 10%, a mutacje genu PTEN w 20% raków endometrioidalnych jajnika.

Do typu II zaliczono nowotwory dynamicznie rozwijające się i wykazujące znaczną niestabilność genetyczną oraz mutacje w genie białka p53. Nie wykrywa się natomiast mutacji charakterystycznych dla guzów typu I. Niestabilności mikrosatelitarne charakteryzujące się zmianami długości sekwencji powtarzalnych rozrzuconych po całym genomie odgrywają ogromną rolę w procesie nowotworzenia [8–10]. Występowanie powtórzeń sekwencji (mikrosatelity) jest wskaźnikiem uszkodzenia systemu naprawczego.

W typie II raka jajnika zmiany prekursorowe nie zostały jak dotąd poznane [3]. Wykazano, że predyspozycje do powstawania nowotworów uwarunkowane są zaburzeniami w ludzkich genach systemu naprawczego (MMR – mismatch repair, naprawa błędnie sparowanych nukleotydów), tj. hMSH-2, hMLH-1, hPMS-1, hPMS-2 oraz hMSH3, będących odpowiednikami bakteryjnych genów mutS i mutL [11]. Uważa się, że te nowotwory powstają de novo z nabłonka celomicznego (jam ciała). Do grupy tej zalicza się niskozróżnicowane raki, złośliwe mieszane guzy mezodermalne i raki niezróżnicowane.

Apoptoza stanowi obok proliferacji kluczowy mechanizm rozwoju i utrzymania homeostazy wielokomórkowego organizmu. Jest ważnym mechanizmem obronnym organizmu usuwającym komórki z uszkodzeniami w DNA. W chorobach nowotworowych zaburzenie apoptozy ma znaczenie nie tylko dla patogenezy guza, lecz także dla jego wrażliwości lub oporności na chemio- i radioterapię.

Wykorzystanie wyników badań uzyskanych z macierzy genowych prawdopodobnie będzie odgrywać rolę w zidentyfikowaniu pacjentek pierwotnie opornych na standardowe leczenie oparte na pochodnych platyny i taksoidach. Pozwoliłoby to na stosowanie u tych chorych innych sposobów leczenia skojarzonego i celowanych terapii, a w efekcie wpłynęłoby na wydłużenie czasu przeżycia.

Potti i wsp. oceniali ekspresję genów w komórkach pierwotnych, zaawansowanych, surowiczych raków jajnika oraz linii komórkowych raka jajnika w odniesieniu do wrażliwości na chemioterapeutyki [12]. W warunkach in vitro oceniano wrażliwość komórek nowotworowych na powszechnie stosowane chemioterapeutyki, jak paklitaksel, docetaksel, 5-fluorouracyl, topotekan, doksorubicyna, etopozyd i cyklofosfamid. Na podstawie profilu ekspresji genów przewidziano odpowiedź chorych na chemioterapię ze zgodnością wynoszącą 81%. Analiza regresji uzyskanych danych wykazała związek zaburzenia regulacji szlaku 3-OH-kinazy fosfatydyloinozytolu z opornością na docetaksel. Uzyskane wyniki sugerują możliwość wykorzystania inhibitorów tej kinazy w grupie pacjentek opornych na docetaksel.

Epigenetyczna regulacja aktywności genu u chorych na raka jajnika

Mechanizmy epigenetyczne są to zmiany dziedziczne w architekturze chromatyny wpływające na ekspresję genów bez zaburzeń pierwotnej sekwencji DNA [13]. Zalicza się do nich metylację DNA, modyfikacje histonów i ekspresję miRNA.

Metylacja DNA

Metylacja DNA, polegająca na przyłączeniu grup metylowych i katalizowana przez metyltransferazy DNA, dotyczy cytozyn tworzących dinukleotydy z guaninami (CpG). Zlokalizowane są one przede wszystkim w regionach bogatych w cytozyny i guaniny, zwanych wyspami CpG, w obrębie promotorów genów [14]. Zmetylowana cytozyna, nazywana także piątą zasadą DNA, moduluje ekspresję genów poprzez wyciszanie genów o funkcjach supresorowych lub też, jeśli pozostaje wolna od grup metylowych, prowadzi do aktywacji onkogenów. Analiza profilu metylacji w tkance nowotworowej jajnika wykazała, że liczne geny o udowodnionej roli w onkogenezie, podlegają inaktywacji epigenetycznej.

W raku jajnika, podobnie jak w innych nowotworach pochodzenia nabłonkowego, dochodzi do hipermetylacji wysp CpG w obrębie promotorów genów supresorowych, której towarzyszy wyciszenie ich ekspresji. W guzach nowotworowych obserwuje się także hipometylację bogatych w CpG sekwencji powtarzalnych w genomie, co przyczynia się do jego destabilizacji.

Jednym z genów o udokumentowanej roli w nowotworzeniu, m.in. w jajniku, jest BRCA1 (breast cancer early onset gene 1), zaangażowany w utrzymanie stabilności genomu i procesy naprawy DNA [15]. W 15% przypadków sporadycznego raka jajnika stwierdzano jego całkowitą lub częściową inaktywację wskutek hipermetylacji promotora. Towarzyszyło jej obniżenie ekspresji BRCA1. Hipermetylacja promotora BRCA1 jest zjawiskiem występującym wyłącznie w sporadycznych nowotworach jajnika. U kobiet z mutacjami germinalnymi w genie BRCA1 nie obserwuje się tego typu zmian [16]. Hipermetylacja promotora BRCA1 w raku jajnika stanowi też korzystny czynnik rokowniczy u pacjentek leczonych cisplatyną [17].

W raku jajnika dochodzi także do hipometylacji regionów centromerowych i subtelomerowych, co indukuje niestabilność genomu, sprzyjając translokacjom i reaktywując tzw. sekwencje ruchome, czyli transpozony. Hipometylacja tego typu sekwencji jest charakterystyczna dla zaawansowanych i niskozróżnicowanych nowotworów jajnika, a także stanowi negatywny czynnik prognostyczny [18].

Charakterystyczną cechą nowotworów złośliwych jajnika, różnicującą z guzami łagodnymi, jest inaktywacja genu E-kadheryny wskutek zwiększonej metylacji wysp CpG w obrębie jego promotora [19]. Profil metylacji genomowego DNA w raku jajnika, w tym frakcji pozakomórkowej uwalnianej do surowicy (cell free DNA) pozwolił na wyselekcjonowanie 7 genów (APC – adenomatous polyposis coli, RASSF1A – ras association domain-containing protein 1, CDH1 – cadherin-1, RUNX3 – runt-related transcription factor 3, TFPI2 – tissue factor pathway inhibitor 2, SFRP5 – secreted frizzled-related protein 5 i OPCML – opioid-binding protein/cell adhesion molecule) wykazujących wysoką specyficzność i czułość (odpowiednio 90,5% i 85,3%) w niezaawansowanym raku jajnika (FIGO I) [20]. Rola metylacji DNA jako biomarkera w detekcji i leczeniu raka jajnika jest obiecująca. Jego zastosowanie kliniczne stwarza jednak problemy ze względu na brak technik molekularnych godzących wysoką jakość z niskimi kosztami badań.

Istnieją dwa typy inhibitorów metylacji DNA – analogi nukleozydowe i nienukleozydowe. Do pierwszej grupy należą azacytydyna i decytabina – inhibitory metylotransferaz DNA (DNMT – DNA metylotransferases), stosowane w terapii zespołów mielodysplastycznych. Wykazano, że decytabina wywiera potężny demetylujący wpływ na geny supresorowe w licznych liniach komórkowych. W badaniach na modelach zwierzęcych udowodniono, że związek ten dodatkowo zmniejsza znacząco oporność na cisplatynę komórek nowotworowych jajnika [21]. Podobne badania kliniczne przeprowadzone z udziałem pacjentek z rakiem jajnika opornych na leczenie chemiczne potwierdziły skuteczność obydwu związków [22].

Modyfikacja histonów

Kowalentne modyfikacje aminokwasów budujących histony są kolejnym epigenetycznym mechanizmem regulującym ekspresję genów. Zmiany te obejmują potranslacyjne, katalizowane przez enzymy, modyfikacje ogona N-terminalnego białek histonowych. Należą do nich acetylacje, metylacje, fosforylacje i ubikwitynacje. W obrębie pojedynczego białka histonowego może zachodzić wiele typów modyfikacji. Wzór modyfikacji histonów determinujący ekspresję genu zwany jest kodem histonowym.

Deacetylacja histonów prowadzi do kondensacji chromatyny i w konsekwencji utraty aktywności transkrypcyjnej, natomiast acetylacja sprzyja jej rozluźnianiu i odpowiada za aktywację transkrypcji [23].

Sirtuiny (gen SIRT1) są jednymi z białek wykazujących właściwości deacetylaz, nie tylko histonów, ale także białek niehistonowych, takich jak p53 [24]. W złośliwych nowotworach jajnika, szczególnie surowiczych, ekspresja SIRT1 jest znacząco podwyższona [25]. SIRT1, wpływając na mikrośrodowisko guza (działa proangiogennie) i proces naprawy DNA, promuje przeżycie nowotworowych komórek macierzystych i lekooporność. Rozważa się zatem użycie SIRT1 jako celu terapeutycznego u chorych z surowiczym, lekoopornym rakiem jajnika [26].

W związku z jednoznacznym zaangażowaniem nieprawidłowej modyfikacji histonów w onkogenezę jajnika wprowadzono do terapii leki będące inhibitorami deacetylaz histonowych (HDAC – histone deacetyltransferases), takie jak kwas walproinowy, kwas suberanilohydroksamowy (worynostat) czy romidepsyna. Innym dobrze tolerowanym i skutecznym inhibitorem HDAC w leczeniu pacjentek z nawracającym rakiem jajnika jest belinostat [27].

MikroRNA (miRNA)

Badania nad ludzkim transkryptomem wykazały, że epigenetyczna kontrola ekspresji genu może odbywać się także za pośrednictwem małych niekodujących cząsteczek zwanych miRNA. Należą one do licznej rodziny tzw. niekodujących RNA. Niekodujące RNA pełnią nadrzędne funkcje regulatorowe, biorąc udział w rozpoznawaniu specyficznych sekwencji w obrębie genomu. Regulacja ekspresji genu z udziałem miRNA może zachodzić na wielu poziomach i etapach ekspresji genów. MikroRNA regulują ekspresję genów poprzez inhibicję translacji lub degradację RNA. Istnieją także doniesienia, że mogą one aktywować transkrypcję genów, przyłączając się specyficznie do ich promotorów [28].

W badaniach nad rakiem jajnika zidentyﬁkowano grupę miRNA, która odróżniała tkankę nowotworową od prawidłowej. Do cząsteczek ulegających nadekspresji w raku jajnika zaliczono miRNA z rodziny miR-200 (miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141, miR-429, miR-21, miR-23a, miR-23b, miR-27a, miR-93). Natomiast miRNA o charakterystycznie obniżonej ekspresji to miR-10b, miR-26a, miR-29a, miR-99a, miR-100, miR-125a, miR-125b, miR-143, miR-145, miR-199a, miR-214, and let-7b [29].

Ocena miRNA wykorzystywana jest w diagnostyce różnych nowotworów. Stanowi też ważny czynnik prognozujący efektywność leczenia. Badania nad miRNA pod kątem ich wykorzystania jako celów terapeutycznych znajdują się w początkowej fazie. Wymagają poszerzenia wiedzy naukowców na temat zawiłych zależności i regulacji genów kodujących białka przez poszczególne miRNA.

Rola układu immunologicznego w powstawaniu i rozwoju raka jajnika

Wyniki badań eksperymentalnych i obserwacji klinicznych wskazują, że układ immunologiczny rozpoznaje i jest w stanie zniszczyć komórki nowotworowe. Wiadomo jednak też, że nowotwory wykształciły liczne mechanizmy, poprzez które mogą hamować reakcje odpornościowe zarówno układowe, jak i zachodzące w lokalnym mikrośrodowisku. Stwierdzono, że nasilenie infiltracji tkanki guza przez limfocyty T CD3⁺ silnie dodatnio koreluje z przeżyciem chorych. Rekrutacja komórek immunologicznych o działaniu cytotoksycznym i eliminacja komórek regulujących tolerancję immunologiczną są interesującym przedmiotem badań i zastosowania w immunoterapii.

Rekrutowane komórki układu odpornościowego wytwarzają interferon gamma (IFN-γ), który w dalszym etapie indukuje syntezę angiostatycznych chemokin, tj. CXCL10, CXCL9 i CXCL11. Chemokiny te między innymi hamują tworzenie nowych naczyń krwionośnych (neoangiogenezę), co prowadzi do obumierania komórek rakowych [30]. Ponadto nasilają one migrację komórek NK, komórek dendrytycznych, makrofagów oraz innych komórek efektorowych układu immunologicznego w miejsce guza [31, 32]. Komórki NK niszczą komórki nowotworowe w mechanizmie uwalniania perforyn, oddziaływania Fas-FasL, TRAIL-TRAIL-L (TNF-related apoptosis-inducing ligand, ligand czynnika martwicy nowotworów indukujący apoptozę) [33, 34]. Pod wpływem IFN-γ makrofagi naciekające guza nabierają właściwości fagocytarnych [30, 33]. Obumarłe komórki nowotworowe są pochłaniane przez niedojrzałe komórki dendrytyczne, które wędrują do węzłów chłonnych, gdzie jako dojrzałe komórki dendrytyczne prezentują antygeny nowotworowe dziewiczym limfocytom T pomocniczym (CD4⁺) lub cytotoksycznym (CD8⁺) [30, 35]. Ciągłe oddziaływanie układu immunologicznego na komórki nowotworowe indukuje powstawanie nowych populacji komórek rakowych [30, 33].

Istotną rolę w opisywanym procesie odgrywają czynniki obecne w mikrośrodowisku nowotworowym. U chorych na raka jajnika obserwuje się wysokie stężenia cytokin immunosupresyjnych, tj. interleukiny (IL-10) [36–38], transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-β – transformin growth factor β) [39], czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF – vascular endothelial growth factor) [40] i prostaglandyny E2 (PGE2), a także prozapalnych (IL-6) [41], które hamują aktywność komórek układu immunologicznego [42]. Komórki nowotworowe stają się oporne na działanie czynników immunologicznych, a rozwój nowotworu przechodzi w fazę ucieczki spod nadzoru immunologicznego – naciekania tkanek i tworzenia przerzutów [30, 35, 43].

Cechą charakterystyczną raka jajnika jest wewnątrzotrzewnowy rozsiew, który może wynikać z niesprawności komórek układu immunologicznego występujących lokalnie w jamie otrzewnej. W przypadku rozwoju rozsianego procesu nowotworowego w obrębie jamy brzusznej guzy indukują zwiększone wytwarzanie płynu otrzewnowego [44]. W warunkach fizjologicznych jego skład zależy głównie od funkcji otrzewnej i aktywności hormonalnej jajników [45]. Źródłem składników płynu otrzewnowego są także płyn jajowodowy, wydalina docierająca do jamy brzusznej drogą miesiączkowania wstecznego, oraz produkty uwalniane przez makrofagi [46, 47].

Spośród komórek płynu otrzewnowego istotną rolę w indukcji odpowiedzi immunologicznej odgrywają komórki dendrytyczne, makrofagi, limfocyty B, limfocyty T, komórki NK, komórki mezotelialne, eozynofile oraz komórki tuczne [46, 48, 49]. Ponadto badania ostatnich lat wykazały w tym płynie obecność supresorowych populacji komórkowych. Wśród nich znajdują się komórki supresorowe pochodzące z linii mieloidalnej (MDSC – myeloid-derived suppressor cells) [50], limfocyty T regulatorowe (tumor-associated Tregs) [51, 52] oraz komórki dendrytyczne plazmocytoidalne [53, 54].

Ponadto w skład frakcji komórkowej wchodzą komórki nowotworowe (pojedyncze i w pakietach) [55, 56].

U chorych na raka jajnika w związku z nieszczelnością naczyń włosowatych guza i niedrożnością naczyń limfatycznych [44] objętość płynu zaczyna przeważać nad możliwościami jego resorpcji. Komórki nowotworowe, które migrują do przestrzeni limfatycznej i naczyń limfatycznych otrzewnej i przepony upośledzają drenaż jamy brzusznej i powodują zwiększenie w niej objętości płynu wysiękowego, co skutkuje wytworzeniem wodobrzusza.

W płynie otrzewnowym w wysokich stężeniach występują markery nowotworowe, takie jak CA-125 (cancer antigen 125, antygen nowotworowy 125), HE4 (human epididymis protein 4, podfrakcja czwarta ludzkiego białka komórek nabłonkowych), CEA (carcinoembryonic antigen, antygen rakowo-płodowy), CA19–9 (carbohydrate antigen 19–9, antygen węglowodanowy 19–9), TPS (tissue polypeptide specific antigen, tkankowy swoisty antygen polipeptydowy) [57, 58, 59]. Stężenia antygenów CA-125 i TPS są znacznie wyższe w płynie otrzewnowym niż w surowicy krwi i dodatkowo korelują dodatnio ze stopniem zaawansowania raka jajnika według klasyfikacji FIGO [57]. Ponadto do antygenów nowotworowych wywołujących reakcję immunologiczną w przypadku raka jajnika należą: HER2 (human epidermal growth factor receptor 2, receptor ludzkiego czynnika wzrostu naskórka 2) [60, 61], MUC1 (mucyna) [62], OA3 [63], receptor α kwasu foliowego [64], TAG-72 (tumor-associated glycoprotein 72, glikoproteina towarzysząca nowotworom 72) [65], mezotelina [66], NY-ESO-1 [67] oraz sialo-Tn [68].

W płynie otrzewnowym chorych na raka jajnika wykrywa się także wiele czynników stymulujących neoangiogenezę. Czynnikiem najczęściej opisywanym jest VEGF [69, 70, 71], którego stężenie koreluje z krótszym czasem przeżycia pacjentek [71]. Do innych należą IL-8 oraz FGF-β (fibroblast growth factor beta, czynnik wzrostu fibroblastów beta) [69].

Poznanie funkcji układu immunologicznego u kobiet z rakiem jajnika wykorzystane zostało w różnych formach immunoterapii. Układ immunologiczny często rozpoznaje nowotworowo zmienione komórki jako własne. Różnicowanie pomiędzy komórkami własnymi i zmienionymi związane jest z ekspresją specyficznych antygenów nowotworowych (TSAs – tumor specific antigens) lub antygenów związanych z nowotworem (TAAs – tumor associated antigens). Antygeny specyficzne dla nowotworów zostały wykorzystane w immunoterapii.

Terapie celowane w raku jajnika

Stosowane obecnie metody immunoterapii można usystematyzować następująco: przeciwciała, inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych (immune checkpoint), szczepionki ACT (adoptive cell therapy, adoptywna terapia komórkowa). W fazie badań klinicznych znajdują się także terapie złożone, wykorzystujące kilka mechanizmów działania układu immunologicznego [72].

Przeciwciała monoklonalne

Monoklonalne humanizowane przeciwciało (bewacyzumab) jest ligandem wiążącym się z receptorami VEGF, który odgrywa kluczową rolę w tworzeniu nowych naczyń w guzie. Skuteczność terapeutyczna tego leczenia została wykazana w wielu guzach litych. W rakach jajnika zastosowana ze standardową chemioterapią powoduje wydłużenie całkowitego czasu przeżycia bez progresji (PFS) i czasu przeżycia (OS) [73]. Szczegółowe omówienie klinicznego wykorzystania tego przeciwciała znajduje się w innej części podręcznika [patrz str. 517].

W terapii antyangiogennej wykorzystuje się następujące molekuły:

● aflibercept – heterodimeryczna cząsteczka zawierająca domenę wiążącą ligand receptora 1 i 2 VEGF połączona ze stałym regionem IgG [74];

● nintedanib – hamuje angiogenezę poprzez oddziaływanie na VEGF, FGF i PDGF (platelet-derived growth factor, płytkopochodny czynnik wzrostu);

● pazopanib – mechanizm działania jak nintedanib [75];

● trebananib – blokuje wiązanie angiopoetyny 1 i 2 z receptorem Tie-2;

● sorafenib i sunitinib – blokują receptory czynników angiogennych (VEGFR-2; PDGFR-β; c-kit; Flt-3) [76];

● kabozantynib – hamuje receptory proangiogenne działające przez aktywacje kinazy tyrozynowej.

Stwierdzenie silnej ekspresji cząsteczki adhezyjnej komórek nabłonkowych (EpCAM – epithelial cell adhesion molecule) w tkance raka jajnika stało się podstawą do wykorzystania przeciwciała katumaksomab. Działa ono poprzez aktywację komórek NK i limfocytów T-cytotoksycznych. Hamuje ponadto tworzenie wysięku otrzewnowego, wydłużając czas pomiędzy punkcjami jamy otrzewnej [77].

Około ²⁄₃ raków jajnika wykazuje ekspresję receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR – epithelial growth factor receptor). W badaniach in vitro linii komórkowych raka jajnika przeciwciało anty-EGFR (cetuksymab) wykazywało działanie antyproliferacyjne i nasilało apoptozę komórek nowotworowych. Dotychczas prowadzone badania kliniczne nad wykorzystaniem przeciwciał anty-EGFR (cetuksymab i panitumumab) w połączeniu z chemioterapią nie dały jednoznacznych informacji o korzyściach klinicznych [78].

Przeciwciała przeciwko makrofagom infiltrującym guz

Makrofagi są najliczniejszymi komórkami infiltrującymi nowotwór jajnika. Wyróżnia się dwa ich podtypy: M1 – aktywowane przez IFN-γ, wytwarzające cytokiny prozapalne i immunostymulujące, oraz M2 – aktywowane przez cytokiny Th2, wydzielające czynniki przeciwzapalne. Makrofagi M2 naciekające raki jajnika indukują immunosupresję w mikrośrodowisku nowotworu. Wydzielając chemokinę CCL22, stymulują one migrację Treg do guza. Blokada CCL22 i innych antygenów makrofagów M2 (CSF-1R, B7-H4) może być obiecującą opcją terapii raka jajnika [79].

Przeciwciała przeciwko CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4, antygen 4 limfocytów T cytotoksycznych) zostały wprowadzone do leczenia czerniaka (ipilimumab). Obecnie trwają badania nad ich wykorzystaniem w leczeniu raka jajnika wrażliwego na platynę. CTLA-4 odgrywa ważną rolę w regulowaniu aktywacji i inaktywacji limfocytów T. Blokada tego białka przesuwa równowagę w mikrośrodowisku guza w kierunku aktywacji limfocytów cytotoksycznych, prowadząc do eliminacji guza u zwierząt doświadczalnych [80].

Interesującym przedmiotem wykorzystania w immunoterapii jest PD-L1 (programmed death-ligand 1, receptor programowanej śmierci 1). Wysokie stężenie PD-L1 w surowicy krwi chorych na raka jajnika koreluje ze złą prognozą. Ekspresja PD-L1 na komórkach raka jajnika hamuje działanie limfocytów T cytotoksycznych i zmniejsza lizę komórek nowotworowych guza [81].

Blokada PD-L1 przywraca działanie cytotoksyczne limfocytów. Trwają badania kliniczne nad wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych osi PD-1/PD-L1 (niwolumab; pembrolizumab) [82].

IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase, 2,3-dioksygenaza indoloaminy) jest enzymem katalizującym tryptofan odgrywającym ważną rolę w regulacji aktywności komórek układu immunologicznego. IDO wykrywana jest immunohistochemicznie w 56% tkanek raków jajnika. Jej ekspresji towarzyszy redukcja limfocytów infiltrujących guz oraz komórek NK, wzrasta także nasilenie angiogenezy. Badania na zwierzętach wykazały, że zahamowanie IDO zwiększa skuteczność chemioterapeutyków. Obecnie wiele inhibitorów IDO znajduje się w fazie badań klinicznych [83, 84].

Szczepionki nowotworowe

Komórki prezentujące antygen (APCs – antigen presenting cells) dziewiczym limfocytom T, limfocytom B i komórkom NK odgrywają istotną rolę w indukcji tolerancji lub eliminacji guza. Komórki dendrytyczne są bardzo silnym prezenterem antygenów. Szczepionki wykorzystujące je stanowią obiecującą opcję terapeutyczną. Pobrane od pacjentki monocyty stymulowane odpowiednimi cytokinami przekształcają się w warunkach in vitro w komórki dendrytyczne, które eksponuje się na antygeny guza i podaje pacjentce w postaci powtarzanych iniekcji podskórnych. Do prezentacji komórkom wykorzystywane są charakterystyczne dla nowotworów antygeny, np. MUC-1, peptydy, np. CA-125, p53, Her-2, lub homogenaty tkanki guza [85].

Do wprowadzania antygenów nowotworowych do komórek immunologicznych wykorzystywane są także rekombinowane szczepionki wirusowe (np. wirusa ospy wietrznej i półpaśca). Stosując wektory retrowirusów, konwertowano limfocyty krwi obwodowej na wywołujące efekt cytotoksyczny i ukierunkowano ich działanie na komórki guza. W chwili obecnej prowadzonych jest kilka badań klinicznych różnych szczepionek opartych na komórkach dendrytycznych [86, 87].

Terapie celowane naprawy DNA

Inhibicja polimerazy poli-ADP-rybozy (PARP) – PARP1 jest enzymem o kluczowym znaczeniu w naprawie uszkodzenia pojedynczej nici DNA poprzez mechanizm wycięcia zasad. Wyłączenie aktywności PARP prowadzi do kumulacji uszkodzeń pojedynczej nici DNA, co powoduje rozerwanie drugiej nici i w konsekwencji śmierć komórki. Defekt w naprawie DNA w następstwie mutacji BRCA1 i BRCA2 potęgowany jest inhibitorami PARP i prowadzi do obumarcia komórki nowotworowej [88].

Prowadzone są intensywne badania nad molekułami hamującymi różne drogi przekazu informacji w komórce. Należy spodziewać się, że zostaną opracowane nowe terapie celowane na kinazę fosfoinozytolu-3 (PI3K), kinazę białkową B (AKT), drogę sygnałową mTOR (rapamycyna).

Leki celowane na Src – Src jest kinazą tyrozynową niebędącą elementem receptora. Odgrywa ważną rolę w proliferacji, migracji, inwazji i angiogenezie nowotworowej. Ekspresję Src obserwowano w zaawansowanym raku jajnika. W badaniach na liniach komórkowych raka jajnika stwierdzono, że zahamowanie Src przywraca komórkom niewrażliwym na chemioterapię wrażliwość na paklitaksel i platynę. Opracowano inhibitory Src: dasatynib i saracatynib, które są w trakcie badań klinicznych [89].

Około 70% pierwotnych i 82% nawrotowych raków jajnika wykazuje obecność receptora folanowego alfa (α-FR). Farletuzumab jest monoklonalnym przeciwciałem przeciwko α-FR. Przeprowadzone badania wykazały, że lek jest dobrze tolerowany i około 90% pacjentek leczonych karboplatyną i taksanem w połączeniu z farletuzumabem wykazywało normalizację stężenia CA-125, a około 70% odpowiedź kliniczną [90].

Obiecujące wyniki uzyskano w badaniach nad rolą insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF – insulin-like growth factors). Prowadzone są badania nad wykorzystaniem monoklonalnego przeciwciała przeciw receptorowi IGF-1. Kliniczne znaczenie blokady połączonych szklaków sygnałowych IGF i PI3K/Akt/mTOR jest oceniane w przeprowadzanych aktualnie badaniach [91].

Ogromny postęp w badaniach nad biologią nabłonkowych nowotworów jajnika zainspirował dynamiczne poszukiwania leków działających na szlaki metaboliczne lub sygnałowe, które wykazują zwiększoną aktywność w komórkach nowotworowych. Wiele z przeprowadzonych eksperymentów można logicznie uporządkować, stworzyć obraz sekwencji zdarzeń wewnątrzkomórkowych i zaplanować ingerencję w ich przebieg. Wielokrotnie okazuje się jednak, że wysiłki idą na marne, bowiem uzyskane wyniki kliniczne są rozczarowujące. Należy jednak mieć nadzieję, że w końcu uda się stworzyć skuteczną terapię tej nieuleczalnej dzisiaj choroby.

Piśmiennictwo

1. Fearon E.R., Vogelstein B.: A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 1990, 61: 759–767. 2. Vogelstein B., Kinzler K.W.: The multistep nature of cancer. Trends Genet., 1993, 9: 138–141. 3. Kurman R.J., Shih I.M.: Pathogenesis of ovarian cancer: lessons from morphology and molecular biology and their clinical implications. Int. J. Gynecol. Pathol., 2008, 27: 151–160. 4. Singer G., Kurman R.J., Chang H.W, Cho S.K., Shih I.M.: Diverse tumorigenic pathways in ovarian serous carcinoma. Am. J. Pathol., 2002, 160: 1223–1228. 5. Nakayama K., Nakayama N., Kurman R.J. i wsp.: Sequence mutations and amplification of PIK3CA and AKT2 genes in purified ovarian serous neoplasms. Cancer Biol. Ther., 2006, 5: 779–785. 6. Singer G., Oldt R 3rd, Cohen Y. i wsp.: Mutations in BRAF and KRAS characterize the development of low-grade ovarian serous carcinoma. J. Natl. Cancer. Inst., 2003, 95: 484–486. 7. Singer G., Stohr R., Cope L. i wsp.: Patterns of p53 mutations separate ovarian serous borderline tumors and low- and high-grade carcinomas and provide support for a new model of ovarian carcinogenesis: a mutational analysis with immunohistochemical correlation. Am. J. Surg. Pathol., 2005, 29: 218–224. 8. Abeln E.C., Smit V.T., Wessels J.W. i wsp.: Molecular genetic evidence for the conversion hypothesis of the origin of malignant mixed mullerian tumors. J. Pathol., 1997, 183: 424–431. 9. Gallardo A., Matias-Guiu X., Lagarda H. i wsp.: Malignant mullerian mixed tumor arising from ovarian serous carcinoma: a clinicopathologic and molecular study of two cases. Int. J. Gynecol. Pathol., 2002, 21: 268–272. 10. Sakamoto T., Murase T., Urushibata H. i wsp.: Microsatellite instability and somatic mutations in endometrial carcinomas. Gynecol. Oncol., 1998, 71: 53–58. 11. Fishel R., Wilson T.: MutS homologues in mammalian cells. Curr. Opin. Genet. Dev., 1997, 7: 105–113. 12. Potti A., Dressman H.K., Bild A. i wsp. Genomic signatures to guide the use of chemotherapeutics. Nat. Med., 2006, 12: 1294–1300. 13. Baylin S.B., Ohm J.E.: Epigenetic gene silencing in cancer – a mechanism for early oncogenic pathway addiction? Nat. Rev. Cancer, 2006, 6: 107–116. 14. Auclair G., Weber M.: Mechanisms of DNA methylation and demethylation in mammals. Biochimie, 2012, 94: 2202–2211. 15. Li M.L., Greenberg R.A.: Links between genome integrity and BRCA1 tumor suppression. Trends Biochem. Sci., 2012, 37: 418–424. 16. Bai X., Fu Y., Xue H. i wsp.: BRCA1 promoter hypermethylation in sporadic epithelial ovarian carcinoma: Association with low expression of BRCA1, improved survival and co-expression of DNA methyltransferases. Oncol. Lett., 2014, 7: 1088–1096. 17. Stefansson O.A., Villanueva A., Vidal A., Martí L., Esteller M.: BRCA1 epigenetic inactivation predicts sensitivity to platinum-based chemotherapy in breast and ovarian cancer. Epigenetics, 2012, 7: 1225–1229. 18. Pattamadilok J., Huapai N., Rattanatanyong P. i wsp.: LINE–1 hipomethylation level as a potential prognostic factor for epithelial ovarian cancer. Int. J. Gynecol. Cancer, 2008, 18: 711–717. 19. Xing B.L., Li T., Tang Z.H. i wsp.: Cumulative methylation alternations of gene promoters and protein markers for diagnosis of epithelial ovarian cancer. Genet. Mol. Res., 2015, 14: 4532–4540. 20. Zhang Q., Hu G., Yang Q. i wsp.: A multiplex methylation-specific PCR assay for the detection of early-stage ovarian cancer using cell-free serum DNA. Gynecol. Oncol., 2013, 130: 132–139. 21. Plumb J.A., Strathdee G., Sludden J., Kaye S.B., Brown R.: Reversal of drug resistance in human tumor xenografts by 2’-deoxy-5-azacytidine-induced demethylation of the hMLH1 gene promoter. Cancer Res., 2000, 60: 6039–6044. 22. Fu S., Hu W., Iyer R., Kavanagh J.J. i wsp.: Phase 1b–2a study to reverse platinum resistance through use of a hipomethylating agent, azacitidine, in patients with platinum-resistant or platinum-refractory epithelial ovarian cancer. Cancer, 2011, 117: 1661–1669. 23. Sawan C., Herceg Z.: Histone modifications and cancer. Adv. Genet., 2010, 70: 57–85. 24. Roth M., Chen W.Y.: Sorting out functions of sirtuins in cancer. Oncogene, 2014, 33: 1609–1620. 25. Jang K.Y., Kim K.S., Hwang S.H. i wsp.: Expression and prognostic significance of SIRT1 in ovarian epithelial tumors. Pathology, 2009, 41: 366–371. 26. Wang Z., Chen W.: Emerging Roles of SIRT1 in Cancer Drug Resistance. Genes Cancer, 2013, 4: 82–90. 27. Mackay H.: A phase II trial of the histone deacetylase inhibitor belinostat (PSC101) in patients with platinum resistant epithelial ovarian tumors and micropapillary/borderline (LMP) ovarian tumors. A PMH phase II consortium trial. J. Clin. Oncol., 2008, 26: 5518 (suppl). 28. Valinezhad Orang A., Safaralizadeh R., Kazemzadeh-Bavili M.: Mechanisms of miRNA-mediated gene regulation from common downregulation to mRNA-specific upregulation. Int. J. Genomics, 2014, 2014: 970607. 29. Kinose Y, Sawada K, Nakamura K, Kimura T. The role of microRNAs in ovarian cancer. 30. Biomed. Res. Int., 2014, 2014: 249393. 31. Dunn G.P., Bruce A.T., Ikeda H., Old L.J., Schreiber R.D.: Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat. Immunol., 2002, 3: 991–998. 32. Matzinger P.: Tolerance, danger, and the extended family. Annu. Rev. Immunol., 1994, 12: 991–1045. 33. Smyth M.J., Godfrey D.I., Trapani J.A.: A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat. Immunol., 2001, 2: 293–299. 34. Kim R., Emi M., Tanabe K.: Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape. Immunology, 2007, 121: 1–14. 35. Smyth M.J., Takeda K., Hayakawa Y. i wsp.: Nature’s TRAIL – on a path to cancer immunotherapy. Immunity, 2003, 18: 1–6. 36. Dunn G.P., Old L.J., Schreiber R.D.: The three Es of cancer immunoediting. Ann. Rev. Immunol., 2004, 22: 329–360. 37. Zhou J., YE F., Chen H., Lv W., Gan N.: The expression of interleukin-10 in patients with primary ovarian epithelial carcinoma and in ovarian carcinoma cell lines. J. Int. Med. Res., 2007, 35: 290–300. 38. Rabinovich A., Medina L., Piura B., Huleihel M.: Expression of IL-10 in human normal and cancerous ovarian tissues and cells. Eur. Cytokine Netw., 2010, 21: 122–128. 39. Wertel I., Polak G., Tarkowski R., Kotarska M.: Evaluation of IL-10 and TGF-β levels and myeloid and lymphoid dendritic cells in ovarian cancer patients. Ginekol. Pol., 2011, 82: 414–420. 40. Toutirais O., Chartier P., Dubois D. i wsp.: Constitutive expression of TGF-beta1, interleukin-6 and interleukin-8 by tumor cells as a major component of immune escape in human ovarian carcinoma. Eur. Cytokine Netw., 2003, 14: 246–255. 41. Santin A.D., Hermonat P.L., Ravaggi A., i wsp.: Secretion of vascular endothelial growth factor in ovarian cancer. Eur. J. Gynaecol. Oncol., 1999, 20: 177–181. 42. Offner F.A., Obrist P., Stadlmann S. i wsp.: IL-6 secretion by human peritoneal mesothelial and ovarian cancer cells. Cytokine, 1995, 7: 542–547. 43. Bennaceur K., Chapman J.A., Touraine J.L., Portoukalian J.: Immunosuppressive networks in the tumor environment and their effect in dendritic cells. Biochim. Biophys. Acta, 2009, 1795: 16–24. 44. Wang E., Panelli M.C., Monsurro V., Marincola F.M.: A global approach to tumor immunology. Cell Mol. Immunol., 2004, 1: 256–265. 45. Nuzhat A., Stenvers K.L.: Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy-based translational research. Front Oncol., 2013, 3: 256. 46. Kotarski J.: Znaczenie płynu otrzewnowego w patogenezie endometriozy. W: Endometrioza (red. Jakowicki J.A.). Wydawnictwo Folium, Lublin 1997. 47. Oral E., Olive D.L., Arici A.: The peritoneal environment in endometriosis. Hum. Reprod. Update, 1996, 2: 385–398. 48. Gazvani R., Templeton A.: Peritoneal environment, cytokines and angiogenesis in the pathophysiology of endometriosis. Reproduction, 2002, 123: 217–226. 49. Kubicka U., Olszewski W.L., Tarnowski W. i wsp.: Normal human immune peritoneal cells: subpopulations and functional characteristics. Scand. J. Immunol., 1996, 44: 157–163. 50. Harada T., Iwabe T., Terakawa N.: Role of cytokines in endometriosis. Fertil. Steril., 2001, 76: 1–10. 51. Gabrilovich D.I., Bronte V., Chen S.H. i wsp.: The terminology issue for myeloid-derived suppressor cells. Cancer Res., 2007, 67: 425. 52. Curiel T.J., Coukos G., Zou L. i wsp.: Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat. Med., 2004, 10: 942–949. 53. Wertel I., Surówka J., Polak G. i wsp.: Macrophage-derived chemokine CCL22 and regulatory T cells in ovarian cancer patients. Tumour Biol. 2015, 36: 4811–4817. 54. Curiel T.J., Cheng P., Mottram P. i wsp.: Dendritic cells subsets differentially regulate angiogenesis in human ovarian cancer. Cancer Res., 2004, 64: 5535–5538. 55. Labidi–Galy S.I., Sisirak V. i wsp.: Quantitative and functional alterations of plasmacytoid dendritic cells contribute to immune tolerance in ovarian cancer. Cancer Res., 2011, 71: 1–12. 56. Haskill S., Becker S., Fowler W., Walton L.: Mononuclear-cell infiltration in ovarian cancer. I. Inflammatory cell infiltrates from tumor and ascites material. Br. J. Cancer, 1982, 45: 728–736. 57. Meunier L., Puiffe M.L., Le Page C. i wsp.: Effect of ovarian cancer ascites on cell migration and gene expression in an epithelial ovarian cancer in vitro model. Transl. Oncol., 2010, 3: 230–238. 58. Sedlaczek P., Frydecka I., Gabryś M. i wsp.: Comparative analysis of CA125, tissue polypeptide specific antigen and soluble interleukin–2 receptor levels in sera, cyst, and ascitic fluids from patients with ovarian carcinoma. Cancer, 2002, 95: 1886–1893. 59. Yurkovetsky Z., Skates S., Lomakin A. i wsp.: Development of a multimarker assay for early detection of ovarian cancer. J. Clin. Oncol., 2010, 28: 2159–2166. 60. Yildirim M., Suren D., Yildiz M. i wsp.: Tumor markers in peritoneal washing fluid – contribution to cytology. Asian Pac. J. Cancer Prev., 2013, 14: 1027–1030. 61. Disis M.L., Gooley T.A., Rinn K. i wsp.: Generation of T-cell immunity to the HER-2/neu protein after active immunization with HER-2/neu peptide-based vaccines. J. Clin. Oncol., 2002, 20: 2624–2632. 62. Disis M.L., Goodell V., Schiffman K., Knutson K.L.: Humoral epitope-spreading following immunization with a HER-2/neu peptide based vaccine in cancer patients. J. Clin. Immunol., 2004, 24: 571–578. 63. Vlad A.M., Kettel J.C., Alajez N.M., Carlos C.A., Finn O.J.: MUC1 immunobiology: from discovery to clinical applications. Adv. Immunol., 2004, 82: 249–293. 64. Campbell I.G., Freemont P.S., Foulkes W., Trowsdale J.: An ovarian tumor marker with homology to vaccinia virus contains an IgV-like region and multiple transmembrane domains. Cancer Res., 1992, 52: 5416–5420. 65. Coliva A., Zacchetti A., Luison E. i wsp.: 90Y Labeling of monoclonal antibody MOv18 and preclinical validation for radioimmunotherapy of human ovarian carcinomas. Cancer Immunol. Immunother., 2005, 54: 1200–1213. 66. Rosenblum M.G., Shawver L.K., Marks J.W. i wsp.: Recombinant immunotoxins directed against the c-erb-2/HER2/neu oncogene product: in vitro cytotoxicity, pharmacokinetics, and in vivo efficacy studies in xenograft models. Clin. Cancer Res., 1999, 5: 865–874. 67. Chang K., Pastan I.: Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 136–140. 68. Odunsi K., Jungbluth A.A., Stockert E. i wsp.: NY-ESO-1 and LAGE-1 cancer-testis antigens are potential targets for immunotherapy in epithelial ovarian cancer. Cancer Res., 2003, 63: 6076–6083. 69. Sandmaier B.M., Oparin D.V., Holmberg L.A. i wsp.: Evidence of a cellular immune response against sialyl-Tn in breast and ovarian cancer patients after high-dose chemotherapy, stem cell rescue, and immunization with Theratope STn-KLH cancer vaccine. J. Immunother., 1999, 22: 54–66. 70. Sadłecki P., Walentowicz-Sadłecka M., Szymański W., Grabiec M.: Porównanie stężeń VEGF, IL-8 oraz β-FGF w surowicy krwi i płynie otrzewnowym u pacjentek leczonych z powodu raka jajnika. Ginekol. Pol., 2011, 82: 498–502. 71. Hazelton D., Nicosia R.F., Nicosia S.V.: Vascular endothelial growth factor levels in ovarian cyst fluid correlate with malignancy. Clin. Cancer Res. 1999, 5: 823–829. 72. Yamamoto S., Konishi I., Mandai M., Kuroda H. i wsp.: Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in epithelial ovarian neoplasms: correlation with clinicopathology and patient survival and analysis of serum VEGF levels. Brit. J. Cancer., 1997, 76: 1221–1227. 73. Chester C., Dorigo O., Berek J.S., Kohrt H.: Immunotherapeutic approaches to ovarian cancer treatment. J. Immunotherapy Cancer, 2015, 3:7. 74. Perren T.J., Swart A.M., Pfisterer J. i wsp.: A phase 3 trial of bevacizumab in ovarian cancer. N. Engl. J. Med., 2011, 365: 2484–2496. 75. Coleman R.L., Duska L.R., Ramirez P.T. i wsp.: Phase 1–2 study of docetaxel plus aflibercept in patients with recurrent ovarian, primary peritoneal, or fallopian tube cancer. Lancet Oncol., 2011, 12: 1109–1117. 76. Du Bois A., Kristensen G., Ray-Coquard I. i wsp.: AGO-OVAR 12: a randomized placebo-controlled GCIG/ENGOT-intergroup phase III trial of standard frontline chemotherapy +/− nintedanib for advanced ovarian cancer. Int. J. Gynecol. Cancer, 2013, 23 (suppl. 1): 7. 77. Westin S.N, Herzog T.J, Coleman R.L.: Investigational agents in development for the treatment of ovarian cancer. Invest. New Drugs, 2013, 31: 213–229. 78. Saimetz D., Lindhofer H., Bokemayer C.: Development and approval of the trifunctional antibody catumaxomab (anti-EpCAM x anti-CD3) as a targeted cancer immunotherapy. Cancer Treat. Rev., 2010, 36: 458–467. 79. Secord A.A., Blessing J.A., Armstrong D.K. i wsp.: Phase II trial of cetuximab and carboplatin in relapsed platinum-sensitive ovarian cancer and evaluation of epidermal growth factor receptor expression: a Gynecologic Oncology Group study. Gynecol. Oncol., 2008, 108: 493–499. 80. Mantovani A., Sozzani S., Locati M., Allavena P., Sica A.: Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends Immunol., 2002, 23: 549–555. 81. De Felice F., Marchetti C., Palaia I. i wsp.: Immunotherapy of ovarian cancer: the role of checkpoint inhibitors. J. Immunol. Res., 2015, 2015: 191832. 82. Terme M., Ullrich E., Aymeric L. i wsp.: IL-18 induces PD-1-dependent immunosuppression in cancer. Cancer Res., 2011, 71: 5393–5399. 83. Hamanishi J., Mandai M., Ikeda T. i wsp.: Safety and antitumor activity of anti-PD-1 antibody, nivolumab, in patients with platinum-resistant ovarian cancer. J. Clin. Oncol., 2015, 33: 4015–4022. 84. Inaba T., Ino K., Kajiyama H., Yamamoto E. i wsp.: Role of the immunosuppressive enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase in the progression of ovarian carcinoma. Gynecol. Oncol., 2009, 115: 185–192. 85. Nonaka H., Saga Y., Fujiwara H. i wsp.: Indoleamine 2,3–dioxygenase promotes peritoneal dissemination of ovarian cancer through inhibition of natural killercell function and angiogenesis promotion. Int. J. Oncol., 2011, 38: 113–120. 86. Coosemans A., Baert T., Vergote I.: A view on dendritic cell immunotherapy in ovarian cancer: how far have we come? Facts Views Vis. Obgyn., 2015, 7: 73–78. 87. Chiang C.L., Kandalaft L.E., Tanyi J. i wsp.: A dendritic cell vaccine pulsed with autologous hipochlorous acid-oxidized ovarian cancer lysate primes effective broad antitumor immunity: from bench to bedside. Clin. Cancer Res., 2013, 19: 4801–4815. 88. Yuan J., Kashiwagi S., Reeves P. i wsp.: A novel mycobacterial Hsp70-containing fusion protein targeting mesothelin augments antitumor immunity and prolongs survival in murine models of ovarian cancer and mesothelioma. J. Hematol. Oncol., 2014, 7: 15. 89. Fong P.C., Boss D.S., Yap T.A. i wsp.: Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers. N. Engl. J. Med., 2009, 361: 123–134. 90. Chen T., Pengetnze Y., Taylor C.C.: Src inhibition enhances paclitaxel cytotoxicity in ovarian cancer cells by caspase-9-independent activation of caspase-3. Mol. Cancer Ther., 2005, 4 : 217–224. 91. Kalli K.R., Oberg A.L., Keeney G.L. i wsp.: Folate receptor alpha as a tumor target in epithelial ovarian cancer. Gynecol. Oncol., 2008, 108: 619–626. 92. Spentzos D., Cannistra S.A., Grall F. i wsp.: IGF axis gene expression patterns are prognostic of survival in epithelial ovarian cancer. Endocr. Relat. Cancer, 2007, 14: 781–790.

3 Zastosowanie metod biologii molekularnej w profilaktyce i diagnostyce nowotworów narządów płciowych oraz w kwalifikacji do leczenia skojarzonego Marzena Anna Lewandowska

Badania związane z sekwencjonowaniem genomu człowieka oraz z tworzeniem atlasu genomu wybranych nowotworów otworzyły nowe możliwości precyzyjnej interpretacji wyników dzięki interdyscyplinarnemu powiązaniu innowacyjnych technologii z zakresu biologii molekularnej i medycyny z wykorzystaniem eksploracji danych (data-mining). Medycyna spersonalizowana, która wykorzystuje ustaloną dla konkretnego pacjenta sygnaturę genetyczną, znajduje zastosowanie zarówno w profilaktyce (np. u nosicielek mutacji w genie BRCA1 lub BRCA2, czy też kobiet przetrwale zakażonych onkogennym typem HPV), jak i w podejmowaniu decyzji terapeutycznych u pacjentek onkologicznych.

Na podstawie obecnej wiedzy i aktualnych możliwości diagnostycznych u chorych na choroby nowotworowe można oznaczyć charakterystyczne biomarkery onkologiczne, które można podzielić na prognostyczne i predykcyjne. Te pierwsze odgrywają rolę w różnicowaniu nowotworu, dają możliwość oceny jego biologii oraz umożliwiają specyficzne rokowanie, niezależne od zastosowanego leczenia. Markery predykcyjne pozwalają z kolei określić sygnaturę nowotworu i dostarczają informacje dotyczące chemiowrażliwości na określone leki. Odkryte w ostatnim dziesięcioleciu i coraz szerzej stosowane nowoczesne technologie biologii molekularnej wraz z minimalizacją metod inwazyjnych pozwoliły zrewolucjonizować diagnostykę i zastąpić wykonywane wcześniej pojedyncze badania białek początkowo analizami genetycznymi wybranych genów, a następnie wysokoskalowymi technikami badań z wykorzystaniem wysokoprzepustowych technologii.

Metody biologii molekularnej

Od PCR do sekwencjonowania dideoksy

Zrozumienie postępu i dzisiejszych możliwości diagnostyki nowotworów narządów płciowych z wykorzystaniem najnowszych metod biologii molekularnej wymaga przypomnienia starszej metody, szeroko stosowanej od lat 90. ubiegłego wieku, wykorzystującej reakcję łańcuchowej polimerazy (PCR – polymerase chain reaction). Metoda PCR pozwala na powielanie dowolnych fragmentów łańcuchów DNA. Różne potrzeby diagnostyczne (niskokosztowe badania przesiewowe, detekcja najczęstszych mutacji itp.) zainicjowały powstaniem modyfikacji tej techniki, w której zaczęto wykorzystywać nie tylko genomowy DNA jako matrycę do powielania łańcuchów DNA, lecz także cDNA [ryc. 3.1].

A

B

Rycina 3.1. Izolacja kwasów nukleinowych (DNA i/lub RNA). A – panel górny – izolacja kwasów nukleinowych metodą półautomatyczną przy użyciu pompy próżniowej i kolumienek krzemionkowych. B – panel dolny – izolacja kwasów nukleinowych metodą półautomatyczną z wykorzystaniem kulek magnetycznych.

Metody przesiewowe stosowane w latach 90. XX wieku były oparte na reakcji PCR wraz z analizą polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów (PCR-SSCP – PCR-single-strand conformation polymorphism) lub heterodupleksów (PCR-HD – PCR-heteroduplex) oraz na metodach powiązanych z denaturacyjną wysokosprawną chromatografią cieczową (DHPLC) [11, 14, 26].

Rycina 3.2. Przykłady detekcji DNA HPV: metodą hybrydyzacji (A, B) i PCR w czasie rzeczywistym (C, D). A – detekcja genotypów HPV następuje poprzez hybrydyzację produktów amplifikacji badanej próbki do pasków powleczonych sondami oligonukleotydowymi swoistymi dla wysokoonkogennych i wybranych niskoonkogennych genotypów HPV oraz genu kontrolnego. Sondy znakowane są biotyną. Na pasek nakłada się koniugat streptawidyny i peroksydazy chrzanowej, który wiąże się z biotyną. Po nałożeniu roztworu substratu w reakcji barwnej (na niebiesko) znakowane są na pasku miejsca wiązania produktów amplifikacji analizowanej próby oznaczające obecność danego genotypu HPV. B – wzór uzyskanych prążków porównuje się ze wzorem niebieskich linii dla genu kontrolnego oraz poszczególnych genotypów HPV na szablonie zestawu Roche Linear Array HPV Genotyping Test, CE-IVD (Roche). C i D – analiza jakościowa i półilościowa Anyplex™ II HPV28 Detection (Seegene) pozwalająca na wykrycie i dokładne genotypowanie wysokoonkogennych i wybranych niskoonkogennych typów HPV metodą PCR w czasie rzeczywistym – odczyt w systemie CFX96 Real-time PCR System (Bio-Rad). Tabele zawierają podsumowanie wszystkich odczytów na pięciu różnych długościach fal z wykorzystaniem filtrów: FAM, HEX, Cal Red610, Quasar 670, Quasar 705. IC oznacza kontrolę wewnętrzną, znak „−” to brak detekcji badanego genotypu, a znak „+” obecność wirusa danego genotypu. Trzystopniowa analiza krzywej topnienia (cyclic-catcher melting temperature analysis) pozwala na półilościową ocenę stopnia wiremii dla wykrytego genotypu: wiremia niska (+), średnia (++) i wysoka (+++). C – przykładowa krzywa amplifikacji genotypująca wysokoonkogenny HPV16 w badanej próbie (HPV367) oraz wyniki półilościowej oceny dla wszystkich 28 genotypów wykrywanych przez test. D – przykładowe krzywe amplifikacji genotypujące 7 typów HPV w badanej próbie (HPV398), w tym niskoonkogennego HPV6 odpowiedzialnego za kłykciny szyjki macicy i brodawczaki krtani oraz wyniki półilościowej analizy dla wszystkich 28 genotypów wykrywanych przez test.

Zwiększona dostępność sekwencjonowania kapilarnego oraz rozwój nowych technologii, takich jak PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR – real time PCR), diametralnie zmieniły onkologiczną diagnostykę molekularną. Analiza krzywych topnienia produktów PCR w czasie rzeczywistym [ryc. 3.2] pozwala na szybkie badanie przesiewowe próbek dzięki zastosowaniu barwników fluorescencyjnych. Do wykrycia znanej sekwencji często wykorzystuje się hybrydyzację ze specyficznymi sondami oligonukleotydowymi, które pozwalają na odróżnienie allelu dzikiego (prawidłowego) od zmutowanego lub genotypowanie znanych typów HPV.

W celu identyfikacji nie tylko znanej, lecz także przede wszystkim nowej zmiany w DNA wykorzystywane są natomiast metody sekwencjonowania, które pozwalają odszyfrować sekwencję zasad budujących nić DNA: adeninę, tyminę, guaninę i cytozynę. Technika odczytu kolejności ich występowania została opracowana w latach 70. XX wieku przez Allana Maxama i Waltera Gilberta. Polegała na chemicznej degradacji łańcuchów DNA, a następnie rozdziale elektroforetycznym uzyskanych fragmentów znakowanych izotopowo.

Kolejną techniką było sekwencjonowanie metodą Fredericka Sangera, której pierwszy etap obejmował syntetyzowanie nici DNA de novo z wykorzystaniem dideoksyrybonukleotydowych terminatorów, dlatego nazywana jest również metodą dideoksy [24]. Badana nić DNA nie była wstępnie degradowana, ale powielana przy użyciu polimerazy o wysokiej dokładności i mieszaniny nukleotydów z dodatkiem puli 2 lub 3 dideoksynukleotydów. Ich obecność uniemożliwiała dalsze wydłużanie łańcucha DNA, będącego kopią analizowanej nici DNA. Identyfikacja mutacji przy zastosowaniu tej metody również wymagała przeprowadzenia rozdziału elektroforetycznego produktu, przy czym nukleotydy znakowane izotopami promieniotwórczymi z czasem zostały zastąpione barwnikami fluorescencyjnymi, a miejsce żeli poliakrylamidowych i procesu naświetlenia kliszy rentgenowskiej zajęła elektroforeza kapilarna i rejestracja sygnału wzbudzonego barwnika fluorescencyjnego przez kamerę CCD (charge coupled device) [25]. Za wkład w możliwość określenia sekwencji zasad w kwasach nukleinowych zarówno Frederick Sanger, jak i Walter Gilbert zostali uhonorowani w 1980 r. Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii, a parę lat później Nagroda Nobla została przyznana w tej samej dziedzinie Kary’emu Mullisowi za odkrycie reakcji PCR.

Powszechnie stosowana obecnie metoda Sangera jest uznawana za tzw. złoty standard w diagnostyce molekularnej i nadal powinna być wykorzystywana do weryfikacji wyników sekwencjonowania następnych (II i III) generacji (Illumina, Roche454, SOLiD, IonTorrent, Pacific Biosciences) technik opisanych w ostatnim dziesięcioleciu [patrz dalej].

W zależności od technologii, którą posługują się laboratoria genetyczne, sekwencjonowanie polega na identyfikacji nukleotydów z wykorzystaniem:

● metod chemiluminescencyjnych (pirosekwenatory);

● metod fluorescencyjnych, w których sekwencjonowanie zachodzi przez ligację lub syntezę;

● rejestracji zmian potencjału elektrycznego.

Tradycyjnie sekwencjonowaniu poddawano DNA wyizolowane z krwi obwodowej, ale rozwój technik biologii molekularnej w onkologii i medycynie spersonalizowanej rozszerzył zakres badań o DNA wyizolowane z tkanki nowotworowej. Umożliwia to analizę obecności lub braku zarówno mutacji germinalnych, jak i somatycznych bezpośrednio w DNA komórek guza i ma ogromne znaczenie dla podejmowania decyzji terapeutycznych. Obecnie w Polsce prowadzone są prace badawcze nad zastosowaniem NGS (next-generation sequencing, sekwencjonowanie nowej generacji) w diagnostyce genów BRCA1 i BRCA2 [patrz ryc. 3.4 i 3.5] na matrycy DNA wyizolowanego z tkanki nowotworowej pochodzącej od pacjentek z rakiem jajnika [32]. Niejednorodność wykrytych mutacji potwierdza konieczność jednoczesnej analizy BRCA1/2 genów u wszystkich pacjentów ze zdiagnozowanym surowiczym rakiem jajnika [32].

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie nowej generacji

Celem badań nad genomem i zmianami na poziomie DNA i RNA jest stworzenie indywidualnej, wiarygodnej oceny ryzyka powstania raka, rokowania i spersonalizowanego leczenia każdej osoby, ze wszystkimi typami nowotworów. Technologie sekwencjonowania nowej generacji pozwoliły na przejście z sekwencjonowania pojedynczych genów w stronę pełnej, wszechstronnej analizy genomów, przy wykorzystaniu DNA lub RNA jako materiału wyjściowego do badań. Warto również zwrócić uwagę, że materiałem badawczym może być zarówno krew obwodowa, jak i heterogenna tkanka nowotworowa. Wiele zmian w genomie komórek rakowych jest często wykrywanych z niską częstotliwością. Ma to związek z występowaniem nie tylko komórek złośliwych, ale i niezłośliwych w puli komórek użytych do oznaczeń. Sekwencjonowanie następnej generacji rozwiązuje ten problem.

Pierwszą metodą sekwencjonowania wysokoprzepustowego II generacji była technologia 454 (Roche, 454 Life Sciences) oparta na pirosekwencjonowaniu. Podczas określonych reakcji enzymatycznych dochodzi w jej trakcie do uwolnienia pirofosforanu, a następnie jego przekształcenia w strumień fotonów, rejestrowanych przez kamerę CCD. Charakterystyczne dla tej metody było przeprowadzenie amplifikacji fragmentów DNA na kulkach opłaszczonych streptawidyną w trakcie emulsyjnej PCR.

Drugim rozwiązaniem pozwalającym na sekwencjonowanie wielkoskalowe była technologia SOLEXA, intensywnie rozwijana przez firmę Illumina. Technika ta bazuje na tzw. procesie sekwencjonowania przez syntezę (SBS – sequencing by synthesis). W pierwszym etapie dochodzi do amplifikacji jednoniciowych fragmentów DNA na mikropłytce poprzez tworzenie tzw. mostka, co prowadzi do powstania sektorów („polonies” – polymerase generated colonie) reprezentujących jeden powielony fragment DNA. Następnym etapem jest sekwencjonowanie przez syntezę z odwracalną terminacją jednocześnie w każdym sektorze. Terminatory zaopatrzone są w znaczniki fluorescencyjne, które po włączeniu do nowo syntetyzowanej nici DNA emitują sygnał świetlny rejestrowany przez kamerę CCD.

Kolejna metoda sekwencjonowania II generacji, która pojawiła się w laboratoriach biologii molekularnej, to technologia SOLiD wprowadzona przez Life Technologies. Opiera się ona na półprzewodnikowej technologii rejestracji zmian pH (semiconductor sequencing) z detekcją protonów na układzie scalonym.

Sekwencjonowanie III generacji obejmuje natomiast platformę Pacific Biosciences SMRT (PacBio, MenloPark), która wykorzystuje macierze światłowodowe. Metoda ta umożliwia bezpośrednią rejestrację przyłączania przez polimerazę DNA fluorescencyjnie wyznakowanych nukleotydów do zhybrydyzowanej do światłowodu nici DNA.

Sekwencjonowanie następnej generacji dzięki wysokiej przepustowości procesu cieszy się coraz większą popularnością i otwiera nowe możliwości. W diagnostyce molekularnej związanej z nowotworami narządów płciowych sekwencjonowanie metodą dideoksy np. całego genu BRCA1 i BRCA2 było niezmiernie czasochłonne i wymagało żmudnej wielotygodniowej analizy. W przypadku analizy NGS dużej serii próbek badawczych, dzięki wysokoprzepustowej technologii opisanej powyżej, szacunkowy koszt zsekwencjonowania pojedynczego nukleotydu (uwzględniający jednoczesne sekwencjonowanie milionów cząsteczek DNA w pojedynczej reakcji, przy jednym cyklu pracy urządzenia) nie jest wysoki w porównaniu z wcześniej stosowanymi metodami. Niemniej jednak koszt całościowy pojedynczej analizy z sekwencjonowaniem genów BRCA1 i BRCA2 w technologii NGS jest nadal wyższy w porównaniu z rutynowo wykonywaną analizą najczęstszych 3–5 mutacji występujących między innymi w populacji polskiej. Należy jednak pamiętać, że nowe techniki umożliwiają zsekwencjonowanie całych genów, bez ograniczenia analiz do mutacji założycielskich lub najczęściej występujących w danej populacji.

Diagnostyka genetyczna w badaniach profilaktycznych

Diagnostyka molekularna zakażeń HPV w profilaktyce raka szyjki macicy

Badania wykazują, że około 5% zachorowań na nowotwory na świecie wiąże się z zakażeniem HPV wysokiego ryzyka [28, 31]. Większość infekcji HPV wysokiego ryzyka jest bezobjawowa i ustępuje w ciągu 1 roku, chociaż czasem proces zwalczania infekcji może trwać nawet do 3 lat. Zdrowy nabłonek szyjki macicy, nawet jeśli zostanie zainfekowany, potrafi dosyć skutecznie ograniczać aktywność wirusa i z nim walczyć. Niektóre zakażenia HPV mogą jednak trwać wiele lat. Zwykle stan ten łączy się z dodatkowym czynnikiem osłabiającym odporność organizmu lub zaburzającym funkcjonowanie komórek, który pozwala, by wirus przetrwał w organizmie. Takie przetrwałe zakażenia HPV wysokiego ryzyka mogą przyczynić się do poważniejszych zaburzeń lub zmian cytologicznych, mogących skutkować w przypadku braku leczenia rozwojem transformacji nowotworowej.

Badania epidemiologiczne wskazują, iż długotrwałe zakażenie wirusem HPV oraz interakcje wirusowych onkoprotein z białkami regulującymi wzrost komórek gospodarza są głównym czynnikiem ryzyka rozwoju raka szyjki macicy, odbytu, sromu i prącia, a także raka jamy ustnej i gardła [28, 31].

Rak szyjki macicy klasyfikuje się na drugim miejscu pod względem śmiertelności kobiet z powodu zachorowań na nowotwory złośliwe, a w ponad 90% przypadków współobecne jest zakażenie HPV. W związku ze zmianami zachowań seksualnych częstość występowania raka związanego z HPV wzrasta. Szacuje się, że do 2020 r. wirus znacząco wpłynie na wzrost zachorowalności na raka głowy i szyi, w tym raka jamy ustnej i gardła [7]. Aktualnie ponad 50% nowotworów zdiagnozowanych w części ustnej gardła jest bezpośrednio związanych z infekcją wysoce onkogennego HPV typu 16 [7].

Badania Haralda zur Hausena nad etiologią raka szyjki macicy oraz powiązanie tego nowotworu z długotrwałym zakażeniem HPV zostały uhonorowane w 2008 r. Nagrodą Nobla. Odkrycie to zapoczątkowało liczne prace badawcze nad szczepionkami obniżającymi ryzyko zachorowania na ten nowotwór. Zmianie uległy też metody diagnostyczne, z poziomu badań cytologicznych i analizy mikroskopowej do badań molekularnych.

Do tej pory zidentyfikowano około 200 różnych genotypów HPV, wśród których przeszło 40 genotypów wykazuje tropizm do błon śluzowych narządów płciowych, a ich kwalifikacja, biorąc pod uwagę zróżnicowany potencjał onkogenny, została uporządkowana w 2012 r. przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem (IARC – International Agency for Research on Cancer). Zwykle genotypuje się dwa najczęstsze lub wszystkie typy wysokiego ryzyka: HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59. Coraz więcej testów diagnostycznych dodatkowo posiada możliwość detekcji nowo poznanych typów podwyższonego ryzyka, np. HPV68, HPV26, HPV66, HPV67, HPV73 i HPV82 [1], oraz niskoonkogennych typów HPV6 i HPV11 wykrywanych u chorych z kłykcinami kończystymi.

Nowoczesna diagnostyka oparta na molekularnej technice PCR pozwala na wczesne wykrycie DNA i RNA wirusa. Testy diagnostyczne powinny z dużą czułością wykrywać możliwie jak najwięcej genotypów wysokiego ryzyka. Szczególnie ze względu na dalsze postępowanie terapeutyczno-diagnostyczne (kolposkopia i biopsja) ważna jest identyfikacja najczęstszych typów HPV16 oraz HPV18.

Aktualnie dostępna diagnostyka HPV bazuje na molekularnej technice PCR z wykorzystaniem hybrydyzacji ze specyficznymi sondami lub PCR w czasie rzeczywistym [patrz ryc. 3.2]. Technologie takie, jak spektrofotometria masowa dedykowana kwasom nukleinowym (MassArray, AgenaBioscience) [3] czy sekwencjonowanie nowej generacji, są częściej stosowane w badaniach naukowych niż w rutynowej diagnostyce [9]. Ze względu na wysoką czułość najprawdopodobniej w najbliższych latach będą jednak częściej wykorzystywane w procesie diagnostycznym, zwłaszcza przy detekcji infekcji przetrwałych.

Warto podkreślić, że pozytywny wynik testu DNA HPV nie umożliwia odróżnienia zakażenia przejściowego od przetrwałego. Możliwość taka istnieje natomiast poprzez zastosowanie analizy jakościowej mRNA HPV w pobranym materiale cytologicznym. Obecnie stosowana w pojedynczych ośrodkach referencyjnych w Polsce metoda NASBA (nucleic acid sequence based amplification, amplifikacja kwasów nukleinowych oparta na sekwencji) wykorzystująca amplifikację RNA (sondy molekularne wykazują specyficzność dla onkogenów E6 i E7) wykrywa najczęstsze genotypy HPV wysokiego ryzyka: 16, 18, 31, 33 oraz 45. Pozytywny wynik testu mRNA HPV prowadzi do ujawnienia mniejszej liczby kobiet z wynikiem pozytywnym niż testy związane z analizą DNA HPV wszystkich wysokoonkogennych i niektórych niskoonkogennych typów wirusa HPV, ale identyfikuje kobiety z infekcją przetrwałą. Wyniki uzyskane w Centrum Onkologii im prof. F. Łukaszczyka w Bydgoszczy w latach 2012–2015 wskazują na największy udział w infekcji przetrwałej genotypu HPV16 (około połowy pacjentek z przetrwałą infekcją), następnie HPV 18, 31 i 33, a najrzadziej 45. Należy zaznaczyć, że coraz większą grupę stanowią pacjentki < 30. r.ż. z przetrwałą infekcją [23].

Diagnostyka molekularna w profilaktyce raka jajnika

Według Krajowego Rejestru Nowotworów rak jajnika jest najgorzej rokującym nowotworem ginekologicznym, a główny genetyczny czynnik ryzyka jego występowania stanowi obecność mutacji w genie BRCA1 i/lub BRCA2. W latach 80. i 90. XX wieku trwały intensywne badania nad znalezieniem usytuowania tych genów, z wykorzystaniem analizy sprzężeń metodą pozycyjnego klonowania. Zostały one zakończone w 1994 r. identyfikacją locus genu BRCA1 na chromosomie 17 [16], a w 1995 r. BRCA2 na chromosomie 13 [30]. Zarówno BRCA1, jak i BRCA2 są dużymi genami (składającymi się odpowiednio z 24 i 27 eksonów), których produkty biorą udział w naprawie dwuniciowych pęknięć DNA (DSB – double strand breaks) w procesie rekombinacji homologicznej (HR – homologous recombination).

Mutacje w obrębie tych genów upośledzają mechanizmy naprawcze i prowadzą do niestabilności genomu. W krótkim czasie po odkryciu genu BRCA1 dowiedziono użyteczności wcześniej wspomnianych metod PCR-SSCP i PCR-HD oraz RT-PCR w identyfikacji mutacji w tym genie u polskich pacjentów [14, 26]. Dalsze badania populacji polskiej (kilkadziesiąt rodzin z dużą liczbą zachorowań na raka piersi i/lub jajnika) [11], populacji z krajów ościennych i populacji Żydów Aszkenazyjskich dowiodły występowania silnego efektu założyciela mutacji BRCA1 5382insC (c.5266dupC) [patrz ryc. 3.4] i 300T>G (c.181T>G) [patrz ryc. 3.5] w populacji polskiej [4, 12] oraz częstego występowania mutacji 185delAG (c.68_69delAG), 4153delA (c.4034delA) i 3819del5 (c.3700_3704de5), będących odpowiednio mutacjami założycielskimi dla populacji Żydów Aszkenazyjskich, populacji litewskiej i czeskiej. Oszacowano, że częstość tych dwóch mutacji założycielskich w ogólnej populacji Polski wynosi 1 : 240–360 [4].

Badania rodzin z częstymi zachorowaniami na nowotwory piersi i jajnika, u których nie zostały zidentyfikowane mutacje założycielskie bądź pozostałe badane najczęstsze mutacje, wskazują na konieczność przeprowadzenia pogłębionej diagnostyki, np. przy zastosowaniu sekwencjonowania nowej generacji genów BRCA1/2 [13, 20], czy z wykorzystaniem metody MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification, multipleksowa amplifikacja połączonych działaniem ligazy sond molekularnych), umożliwiającej wykrywanie delecji [20].

Sekwencjonowanie z użyciem półprzewodnikowej rejestracji zmian pH pozwoliło na scharakteryzowanie potencjalnie nowych mutacji założycielskich BRCA1 p.Q563X oraz BRCA2 p.N3124I u pacjentek z rakiem piersi i/lub jajnika [13]. W przypadku sekwencjonowania przez syntezę u pacjentek z rakiem jajnika wykazano mniejszą rolę efektu założyciela – 65% wszystkich wykrytych mutacji to znane mutacje identyfikowane w standardowych badaniach genetycznych [20].

Zarówno rodzinny, jak i dziedziczny rak jajnika związany jest z mutacjami w genach BRCA1 i BRCA2, ale nie są to jedyne geny zaangażowane w występowanie rodzinnej agregacji zachorowań na raka jajnika. Również zmiany w genach MLH1, MLH2 i MLH6 prowadzą do zachorowań na ten nowotwór. Innym podłożem genetycznym raka jajnika, a także jajowodu i nowotworów otrzewnej, są m.in. mutacje w genach CHEK2, BARD1, TP53, RAD50, RAD51 [29].

Zastosowanie metod biologii molekularnej w diagnostyce genetycznej raka jajnika

W leczeniu nowotworów coraz częściej stosuje się terapie celowane molekularnie. Klasyczne metody leczenia przeciwnowotworowego, których podstawą w raku jajnika są leczenie chirurgiczne i chemioterapia, nie we wszystkich przypadkach prowadzą do oczekiwanych rezultatów. Rak jajnika nadal należy do nowotworów o najgorszym rokowaniu, ponieważ aż 75% chorych jest zdiagnozowanych w zaawansowanym stadium nowotworu (FIGO III, IV). Dodatkowo u 40–50% pacjentek pomimo uzyskania remisji po leczeniu chirurgicznym i chemioterapii I rzutu pojawia się wznowa.

Jednym z mechanizmów molekularnych warunkujących pierwotne niepowodzenie leczenia w raku jajnika jest amplifikacja regionu 19q12, która została zidentyfikowana przy użyciu wysokoprzepustowych oligonukleotydowych mikromacierzy [10]. Amplifikacja genu cykliny E (CCNE1) ulokowanego w tym regionie jest obserwowana również w innych nowotworach, np. w raku endometrium [17] i stanowi niekorzystny czynnik rokowniczy [10]. Zmianę tę identyfikuje się najczęściej przy użyciu metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH – fluorescent in situ hybridization) [ryc. 3.3].

Rycina 3.3. Przykłady obrazów uzyskanych z preparatu w mikroskopie fluorescencyjnym (z użyciem techniki fluorescencyjnej hybrydyzacja in situ, FISH). Ocenie podlegają nienakładające się na siebie jądra nowotworowych komórek interfazowych jajnika wybarwione DAPI. Zielony sygnał – sonda swoista dla 19 chromosomu (19p13.11) znakowana fluoresceiną; pomarańczowy sygnał – sonda swoista dla locus genu CCNE1 (19q12) znakowana spectrum orange (Empire Genomics). Określenie stosunku liczby sygnałów hybrydyzacji między tymi sondami pozwala na dalszą ocenę amplifikacji genu CCNE1.

W przypadku raka jajnika podjęto również próby weryfikacji analiz mikromacierzowych metodą qRT-PCR (quantitative RT-PCR, ilościowego PCR w czasie rzeczywistym) w materiale mrożonym dla genu CCNE1 oraz CCNB1 i CDKN2A [15]. Prawdopodobnie zarówno wysoka liczba kopii genu CCNE1, jak i nadekspresja cykliny E stanowią onkogenne bodźce aktywacji cyklu komórkowego. Cyklina E1 reguluje przejście z fazy G1 do S poprzez wiązanie i aktywację cyklinozależnej kinazy 2 (CDK2 – cyclin-dependent kinase 2), a kompleks ten odgrywa ważną rolę w inicjacji replikacji i zachowaniu stabilności genomowej. Dodatkowo należy pamiętać, że współistniejące mutacje punktowe w genomie mogą wzmocnić onkogenne działanie nadekspresji CCNE1 [18].

Następnym krokiem do poznania genomu raka jajnika było jego zsekwencjonowanie i porównanie sekwencji uzyskanej z tkanki nowotworowej z sekwencją z linii zarodkowej pochodzącej od tej samej pacjentki. Zaowocowało to identyfikacją kolejnych zmian molekularnych związanych z pojawieniem się nabytej oporności na chemioterapię związkami platyny. Autorzy wykazali, że amplifikacja CCNE1 determinuje pierwotną oporność, a pęknięcia nici DNA zazwyczaj dezaktywują geny supresorowe (RB1, NF1, RAD51B i PTEN) i przyczyniają się do nabytej oporności na chemioterapię. Co więcej, zaobserwowano, że nabytą oporność warunkuje nie jedno – a kilka wydarzeń molekularnych, w tym mutacje genu BRCA1/2 czy metylacja promotora BRCA1 [18].

Metylacja obejmuje dodanie grupy metylowej do DNA, co skutkuje często inaktywacją transkrypcji w danym regionie chromatyny. Już na początku XXI wieku analizie genetycznej i epigenetycznej poddano tkankę nowotworową jajnika i stwierdzono, że utrata funkcjonowania genu BRCA1 wiąże się nie tylko z podłożem genetycznym (dziedzicznymi czy nabytymi zmianami), ale i hipermetylacją [2, 6]. W komórkach nowotworowych często obserwuje się hipermetylację wysp CpG w regionie promotorów genów zaangażowanych w regulację cyklu komórkowego (p16INK4a, p15INK4a, Rb, p14ARF), naprawę uszkodzeń DNA (BRCA1, MGMT) oraz apoptozę (DAPK, TMS1). W przypadku raka jajnika zintegrowana analiza genomu (TCGA – The Cancer Genome Atlas) w 2011 r. wykazała, że w surowiczym raku jajnika wysokiego stopnia (HGSC – ovarian high-grade serous carcinoma), dochodzi nie tylko do hipermetylacji genu BRCA1, lecz także genu RAD51.

Mając na uwadze zmiany epigenetyczne występujące u pacjentek z rakiem jajnika, prowadzi się badania kliniczne nad lekami ukierunkowanymi molekularnie na proces metylacji (inhibitory metylotransferazy) czy modyfikacje białek histonowych (deacetylacja histonów). Fenotyp niedoboru rekombinacji homologicznej, który miałby być określony na podstawie badań genetycznych i epigenetycznych (z oceną metylacji BRCA1 i RAD51C), został zaproponowany jako potencjalne badanie diagnostyczne [8].

Te i wcześniejsze badania nad genomem surowiczego raka jajnika pozwoliły zidentyfikować zmiany genetyczne zarówno w raku surowiczym wysokiego (HGSC – high-grade serous carcinoma), jak i niskiego stopnia (LGSC – ovarian low-grade serous carcinoma). W przypadku LGSC głównie dochodzi do aktywacji protoonkogenów (KRAS, BRAF, PIK3CA) [27], utraty heterozygotyczności oraz dużej niestabilności mikrosatelitarnej. HGSC charakteryzuje się najczęściej inaktywacją genów supresorowych (TP53, BRCA1, BRCA2), zaburzeniami metylacji (BRCA1) i zmianami liczby kopii genu CCNE1 [21]. Zauważono ponadto, że mutacje punktowe, rearanżacje chromosomowe czy nieprawidłowy profil metylacji zostały zidentyfikowane w genach związanych z procesem homologicznej rekombinacji aż u 50% pacjentek z HGSC. Analiza transkryptomu HGSC (dzięki izolacji RNA z tkanki nowotworowej HGSC i sekwencjonowaniu egzonów) udowodniła, że u 8% pacjentek z nawrotem choroby występowała nieprawidłowa ekspresja genu ABCB1 kodującego białko oporności wielolekowej (MDR1 – multidrug-resistant protein). Wysoka ekspresja genu ABCB1 była związana z fuzją promotora i translokacją regionu 5’ (SLC25A40-ABCB1) [18], która aktualnie wydaje się następnym ciekawym celem molekularnym w poszukiwaniach nowych terapii przeciwnowotworowych.

Dostępność nowoczesnych celowanych leków, jak inhibitory polimerazy poli-ADP-rybozy (PARP – poly-ADP-ribose polymerase), których skuteczność działania jest uwarunkowana zaburzeniami funkcjonowania rekombinacji homologicznej (jednego z procesów naprawy uszkodzeń DNA), podkreśla konieczność stosowania wstępnej diagnostyki genetycznej przed rozpoczęciem terapii. Szczególnie ważna jest analiza sekwencji genów BRCA1/2 w celu potencjalnej kwalifikacji pacjentek do leczenia inhibitorami PARP [ryc. 3.4, 3.5 i 3.6] [32].

Rycina 3.4. Detekcja mutacji c.5266dupC (5382insC) w genie BRCA1 u pacjentki z rakiem jajnika za pomocą zestawu BRCA Tumor MASTR Plus CE-IVD (Multiplicom), z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania przez syntezę (Illumina, MiSeq System). Nakładające się sekwencje składane są in silico w kontigi w procesie nazywanym asemblacją. Następnie kontigi są porządkowane dzięki obecności nachodzących na siebie fragmentów poprzez chromosome walking. Uporządkowanie uzyskanych sekwencji prowadzi do powstania sekwencji konsensusowej. Górny panel – rycina prezentuje uporządkowane sekwencje porównane do sekwencji referencyjnej genu BRCA1. Dolny panel – w kontigu, w którym pokrycie wynosiło 117 odczytów (nałożonych na siebie sekwencji) częstość występowania wariantów z insercją C przekraczała 63%.

Rycina 3.5. Detekcja mutacji c.181T>G (p.Cys61Gly) w genie BRCA1 u pacjentki z rakiem jajnika za pomocą zestawu BRCA 1&2 NGS Panel (EntroGen, Inc.) z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania przez syntezę (Illumina, MiniSeq System). Nakładające się sekwencje są składane in silico w kontigi w procesie nazywanym asemblacją z użyciem odpowiednich algorytmów (górny panel). Identyfikacja c.181T>G (p.Cys61Gly) była poprzez odniesienie sekwencji części kodujących genu BRCA1 do sekwencji referencyjnej. Częstość występowania wariantów z substytucją była ~ 60% (zilustrowane na panelu dolnym) [Źródło: EntroGen Inc, USA, 2016].

Rycina 3.6. Profile genetyczne. A – fragment streszczenia interaktywnego raportu profilu genetycznego pacjentki z rakiem jajnika, u której wykryto mutację w genie BRCA2 oraz mutację w genie TP53 metodą sekwencjowania nowej generacji. Zmiany w ekspresji wybranych białek zostały określone dzięki badaniom immunohistochemicznym. Szczegółowa interaktywna mapa pozwala na uzyskanie pełnej informacji o znaczeniu klinicznym wszystkich zmian. Na rycinie przedstawiono schemat działania inhibitorów PARP u osób z mutacją konstytutywną lub somatyczną w genie BRCA2. B – identyfikacja delecji dwóch nukleotydów TT w genie BRCA2 c.6275_6276delTT (p.L2092Pfs*7) z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania przez syntezę z użyciem półprzewodnikowej rejestracji zmian pH [Źródło: OncoDNA, 2016].