© Copyright by Wydawnictwo Naukowe PWN S.A., Warszawa 2023

Wszystkie prawa zastrzeżone.

Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci całości bądź części książki bez pisemnej zgody wydawcy są zabronione.

Autorzy i Wydawnictwo dołożyli wszelkich starań, aby opisy wskazań i dawkowania leków zamieszczone w tym podręczniku były zgodne z aktualnymi wytycznymi i praktyką kliniczną. Jednak, ze względu na dynamiczny rozwój wiedzy, zmiany regulacji prawnych i nieprzerwany napływ nowych wyników badań dotyczących podstawowych i niepożądanych działań leków, Czytelnik musi brać pod uwagę informacje zawarte w ulotce dołączonej do każdego opakowania, aby nie przeoczyć ewentualnych zmian we wskazaniach i dawkowaniu. Dotyczy to także specjalnych ostrzeżeń i środków ostrożności. Należy o tym pamiętać, zwłaszcza w przypadku nowych lub rzadko stosowanych substancji.

Wydawca: Anna Plewa

Redaktor prowadzący: Barbara Nowak-Pacholczak

Redaktor merytoryczny: Urszula Pawłowska

Producent: Marta Kubica

Projekt okładki i stron tytułowych: cybul.art

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2023 r. (wyd. III uaktualnione i rozszerzone)

Warszawa 2023

PZWL Wydawnictwo Lekarskie

ISBN 978-83-01-23276-4

DOI: https://doi.org/10.53271/2023.077

Wydawnictwo Naukowe PWN S.A.

ul. G. Daimlera 2

02-460 Warszawa

pwn.pl

Księgarnia wysyłkowa:

tel. 42 680 44 88; infolinia: 801 33 33 88

e-mail: wysylkowa@pzwl.pl

Informacje w sprawie współpracy reklamowej: BR.PZWL@pwn.pl

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwa Naukowego PWN: mobisfera.pl

Autorzy – tom 2

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Dr hab. n. med. Eliza Blicharska, prof. UM

Dr hab. n. farm. Anna Błażewicz, prof. UM

Dr n. farm. Piotr Drączkowski

Prof. dr hab. n. farm. Sławomir Dresler

Prof. dr hab. n. farm. Tadeusz Dzido

Prof. dr hab. n. farm. Władysław Gołkiewicz

Dr n. farm. Aneta Hałka-Grysińska

Dr hab. n. farm. Mirosław Hawrył, prof. UM

Dr n. farm. Grzegorz Jóźwiak

Prof. dr hab. n. chem. Ryszard Kocjan

Prof. dr hab. n. farm. Łukasz Komsta

Dr n. chem. Jerzy Kuczyński

Dr n. chem. Wojciech Markowski

Prof. dr hab. n. farm. Grażyna Matysik

Dr n. farm. Magdalena Pizoń

Dr hab. n. farm. Beata Polak, prof. UM

Prof. dr hab. n. farm. Stanisław Przeszlakowski

Dr n. farm. Jan Sawicki, prof. UM

Prof. dr hab. n. farm. Edward Soczewiński

Prof. dr hab. n. farm. Ireneusz Sowa

Dr hab. n. farm. Anna Sroka-Bartnicka, prof. UM

Dr hab. n. farm. Maciej Strzemski, prof. UM

Prof. dr hab. n. farm. Halina Szumiło

Dr n. farm. Ryszard Świeboda

Dr n. farm. Andrzej Torbicz

Prof. dr hab. n. farm. Monika Waksmundzka-Hajnos

Część I Wstęp

1 Zagadnienia ogólne Ryszard Kocjan

1.1. Ogólna charakterystyka analizy instrumentalnej

Rozwój chemii analitycznej i metod analitycznych był i jest ściśle związany z pojawianiem się nowych przyrządów pomiarowych. Pierwsze analizy ilościowe opierały się na metodach grawimetrycznych (wagowych), których opracowanie stało się możliwe dzięki wynalezieniu precyzyjnych wag. Wkrótce potem wprowadzenie wzorcowanych naczyń szklanych umożliwiło powstanie metod objętościowych (miareczkowych). Metody wagowe i objętościowe oparte na właściwościach chemicznych analizowanych substancji, nazywane także metodami klasycznymi, pozostawały przez wiele lat jedynymi metodami ilościowymi dostępnymi dla większości analityków.

Jednak wraz z koniecznością oznaczania coraz mniejszych ilości analizowanych substancji, metody klasyczne okazywały się niewystarczająco czułe, a także często czaso- i pracochłonne. Oznaczanie małych, a nawet bardzo małych ilości pierwiastków lub związków chemicznych stawało się możliwe dzięki metodom analitycznym, wykorzystującym właściwości fizyczne lub fizykochemiczne oznaczanych substancji.

Spośród różnych właściwości fizycznych lub fizykochemicznych w analityce wykorzystuje się na ogół te, których nasilenie jest zależne od stężenia (ilości) analizowanej substancji. Aby pomiar wartości wykorzystywanej w danej metodzie właściwości fizycznej lub fizykochemicznej był możliwy, należy dysponować odpowiednimi aparatami (instrumentami) pomiarowymi. W ten sposób powstawały i rozwijały się instrumentalne metody analizy chemicznej.

Podział metod analitycznych na klasyczne i instrumentalne ze względu na aparaturę pomiarową nie jest jednak ścisły i jednoznaczny. Przykładowo do wykonania analizy wagowej konieczna jest waga analityczna, będąca niewątpliwie aparatem fizycznym, a mimo to analizę tę zalicza się do klasycznych, natomiast np. chromatografia cienkowarstwowa (czy wcześniej stosowana chromatografia bibułowa), niewymagająca skomplikowanej aparatury, zaliczana jest do metod instrumentalnych.

Wątpliwości budzi także, do jakich metod zaliczyć metody ekstrakcyjne, które na ogół nie wymagają złożonej aparatury. Biorąc jednak pod uwagę charakter procesów zachodzących w metodach ekstrakcyjnych i ich duże podobieństwo do niektórych procesów chromatograficznych, w podręczniku ekstrakcja zamieszczona jest wśród metod instrumentalnych.

Mimo tego typu wątpliwości, tradycyjnie przyjmuje się, że instrumentalne metody analizy chemicznej oparte są na wykorzystaniu zjawisk fizycznych lub fizykochemicznych, a do wykonania takich analiz konieczna jest odpowiednia aparatura fizyczna lub fizykochemiczna.

1.2. Porównanie metod klasycznych i instrumentalnych

Najważniejszą zaletą metod instrumentalnych jest ich duża czułość, a tym samym duża wykrywalność i oznaczalność w porównaniu do metod chemicznych (klasycznych). W metodach klasycznych można oznaczać zawartości składników rzędu 10–1 % w analizie objętościowej i 10–2 % w analizie wagowej, natomiast metodami instrumentalnymi można oznaczać zawartości rzędu 10–5 % i mniejsze.

Ważną zaletą metod instrumentalnych jest na ogół duża szybkość wykonania analiz, która w wielu technologiach przemysłowych ma bardzo istotne znaczenie. Przykładowo podczas wytapiania metali z ich rud trzeba na bieżąco kontrolować skład wytopu. Jest to możliwe dzięki metodzie spektralnej, która umożliwia przeprowadzenie oznaczenia badanej mieszaniny w ciągu kilku minut, wykazując przy tym dużą selektywność. Należy jednak pamiętać, że w wielu metodach instrumentalnych łączny czas oznaczenia rozpoczynający się przygotowaniem próbki, a kończący na właściwym pomiarze może trwać dość długo, dłużej nawet niż w metodach klasycznych.

Niewątpliwą zaletą metod instrumentalnych jest ich obiektywność, ponieważ pomiar dokonywany jest zwykle przy użyciu odpowiedniego miernika elektrycznego lub odczytu cyfrowego. Obiektywności tej nie należy jednak mylić z dokładnością oznaczenia. Metody instrumentalne nie są niestety metodami dokładnymi, a często także nie są precyzyjne. Zazwyczaj jest tak, że im większa czułość danej metody, tym mniejsza jej dokładność i większe wartości popełnianych błędów. Dlatego pod względem dokładności i precyzji lepsze są metody klasyczne.

W analizie wagowej lub miareczkowej względna dokładność oznaczenia jest rzędu dziesiątych części procenta, podczas gdy w analizie instrumentalnej kilku lub kilkunastu procent. Podobnie jest ze względną precyzją oznaczeń wyrażaną wartością względnego odchylenia standardowego. W metodach klasycznych wartość tego odchylenia jest rzędu dziesiątych lub setnych części procenta, natomiast w metodach instrumentalnych jest rzędu kilku procent. Ogólnie można stwierdzić, że względna dokładność i precyzja metod klasycznych są o około rząd wielkości większe niż metod instrumentalnych.

Do wad metod instrumentalnych należy również ich porównywalny charakter. W metodach porównawczych nie oblicza się zawartości badanego składnika na podstawie wyznaczonej wielkości, ponieważ obliczenie takie byłoby bardzo skomplikowane, a niekiedy wręcz niemożliwe. W pomiarach instrumentalnych nie otrzymuje się bowiem bezpośrednich danych o stężeniu analizowanego składnika, tylko wartości odpowiednich wielkości fizycznych lub fizykochemicznych, które w dalszej kolejności służą do określenia ilości badanej substancji. Przykładowo w metodzie spektrofotometrii absorpcyjnej mierzy się absorbancję, w polarografii natężenie prądu, w konduktometrii przewodność roztworów, w potencjometrii potencjał elektrody itd.

Należy przy tym pamiętać, że nie zawsze można mierzyć bezpośrednio wartości niektórych wielkości fizycznych W takich przypadkach konieczne jest zastosowanie odpowiednich detektorów, które stanowią bardzo ważny element aparatury pomiarowej. Wiele metod instrumentalnych znacznie się rozwinęło również dzięki opracowaniu nowoczesnych detektorów.

Detektor zamienia wykrywany sygnał na formę możliwą do obserwacji lub rejestracji. Przykładowo w wielu metodach detektory zamieniają trudne do zmierzenia natężenia promieniowania elektromagnetycznego (światło) w łatwo mierzalny prąd elektryczny. Więcej informacji ogólnych i opis poszczególnych detektorów znajduje się w kolejnych rozdziałach tego tomu.

Aby na podstawie uzyskanych danych określić stężenie (ilość) badanej substancji, należy zazwyczaj wykonać wstępną kalibrację, która polega na doświadczalnym wyznaczeniu zależności między ilością danego składnika w próbce a wynikiem pomiaru danej wielkości. Kalibrację wykonuje się używając próbek wzorcowych o znanych zawartościach oznaczanego składnika. Podczas przygotowywania i przechowywania takich próbek oraz ich analizowania można popełnić wiele błędów, które w sposób znaczący wpływają na dokładność całego oznaczenia.

Metody klasyczne są natomiast metodami bezwzględnymi. Zastosowane w nich reakcje chemiczne umożliwiają otrzymanie wielkości analitycznej, różniącej się od wielkości mierzonej jedynie tzw. mnożnikiem analitycznym. Bezwzględne metody analityczne nie wymagają przygotowania wzorców (poza roztworami mianowanymi) i na tym polega ich przewaga nad metodami instrumentalnymi, w których wzorce są potrzebne i analizowane metodami klasycznymi.

Metody instrumentalne w przeciwieństwie do metod klasycznych można stosunkowo łatwo automatyzować i komputeryzować, co wpływa dodatnio na skrócenie czasu analizy oraz wzrost dokładności i precyzji wyników poprzez eliminację subiektywnych błędów przypadkowych. Automatyzacja zmniejsza także znacząco koszty analiz seryjnych i umożliwia otrzymywanie wyników w formie gotowych wydruków.

Do wad metod instrumentalnych, oprócz opisanych wcześniej porównawczości oraz stosunkowo małej dokładności i precyzji, należy konieczność stosowania odpowiedniej, niekiedy bardzo kosztownej aparatury.

Z powodu ważkich zalet metod instrumentalnych (głównie dużej czułości), co powoduje szybki rozwój tych metod, często traktuje się je jako zdecydowanie lepsze i nowocześniejsze w stosunku do metod klasycznych. Należy jednak stwierdzić, że ocena taka jest niesłuszna, ponieważ metody klasyczne i instrumentalne często wzajemnie się uzupełniają, mając przy tym zarówno zalety, jak i wady. Dlatego od analityka należy oczekiwać umiejętności posługiwania się i metodami klasycznymi i instrumentalnymi.

1.3. Zarys rozwoju instrumentalnych metod analizy chemicznej

Zastosowanie w chemii analitycznej metod instrumentalnych rozpoczęło się w XVIII wieku na podstawie prac na temat absorpcji promieniowania widzialnego. Ich twórcami byli P. Bouger (1729), J.H. Lambert (1760) i A. Beer (1852). Wyniki prac tych badaczy stały się podstawą kolorymetrii, a następnie spektrofotometrii absorpcyjnej. W 1859 roku R. Bunsen i G. Kirchhoff podali podstawy atomowej analizy spektralnej, co stało się podstawą rozwoju takich metod jak: spektrografia, fotometria płomieniowa i emisyjna spektrometria atomowa. W latach 1953–1955 A. Walsh oraz C.T. Alkemade i J.M. Milatz opracowali podstawy absorpcyjnej spektrometrii atomowej.

Następną dużą grupę metod instrumentalnych stanowią metody elektrochemiczne, które pojawiły się w drugiej połowie XIX wieku. Dokładniej ich początek datuje się od 1864 roku, kiedy W. Gibbs opracował metodę elektrolitycznego oznaczania miedzi i niklu. W 1893 roku powstała praca R. Behrenda, poświęcona miareczkowaniu potencjometrycznemu. W 1922 roku J. Heyrovsky przedstawił podstawy polarografii, której rozwój i późniejsze znaczenie sprawiły, że badacz ten otrzymał w 1957 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.

W 1895 roku W.K. Roentgen odkrył promienie X, zwane dziś powszechnie rentgenowskimi, co zapoczątkowało rozwój rentgenowskich metod analizy. Wkrótce potem, bo w 1898 roku H. Becquerel, P. Curie i nasza rodaczka M. Skłodowska-Curie odkryli zjawisko promieniotwórczości, za co w 1903 roku otrzymali Nagrodę Nobla. Odkrycie to stało się podstawą radiometrycznych metod analizy. Dalszy rozwój tych metod stał się możliwy dzięki otrzymaniu w 1935 roku przez Irenę i Fryderyka Joliot-Curie sztucznych izotopów promieniotwórczych, za co w tym samym roku otrzymali Nagrodę Nobla.

W 1904 roku M.S. Cwiet opublikował pracę o rozdzieleniu barwników zawartych w roślinach na kolumnie wypełnionej węglanem wapnia, początkując tym powstanie metod chromatograficznych. O dziwo, praca ta nie znalazła wówczas właściwego uznania i dopiero 25 lat później nastąpił intensywny rozwój chromatografii. Stało się tak w wyniku prac R. Kuhna i E. Lederera, a następnie A.J. Martina i R.L. Synge’a (Nagroda Nobla w 1952 r.), R. Consdena, A.H. Gordona, O. Samuelsona i innych.

Jak wynika z wyżej wymienionych danych, podstawy wielu metod instrumentalnych opracowane zostały dość dawno, ale zasadniczy ich rozwój nastąpił po II wojnie światowej. Obecny szybki rozwój metod instrumentalnych jest związany głównie z rozwojem techniki, a szczególnie elektroniki, co umożliwiło seryjną produkcję, a tym samym obniżenie ceny coraz bardziej zautomatyzowanych aparatów, które masowo znajdują zastosowanie w laboratoriach analitycznych.

1.4. Podział instrumentalnych metod analizy chemicznej

Tabela 1.1. Metody instrumentalne oparte na zjawiskach fizycznych

Lp.

Obserwowane zjawisko

Metoda analityczna

1.

Absorpcja promieniowania

Spektrometria absorpcyjna cząsteczkowa (VIS, UV, IR)

Absorpcyjna spektrometria atomowa (ASA)

Absorpcja promieni rentgenowskich

Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)

Elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR, ESR)

2.

Rozproszenie i absorpcja

Turbidymetria

3.

Rozproszenie promieniowania

Nefelometria

Dyfrakcja promieni rentgenowskich

4.

Odbicie światła

Reflektometria

5.

Załamanie światła

Refraktometria

Interferometria

6.

Skręcenie płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego

Polarymetria

7.

Emisja promieniowania

Fotometria płomieniowa

Spektrografia i spektrometria emisyjna

Fluorescencja rentgenowska

Fluorescencja atomowa

Spektrofluorymetria

8.

Strumień cząstek naładowanych w polu magnetycznym o różnym stosunku m/z

Spektrometria mas

9.

Strumień elektronów lub jonów o różnej energii

Spektrometria elektronów i jonów

10.

Efekty cieplne

(bez zmiany masy)

Termiczna analiza różnicowa (DTA)

Szybki rozwój i duża różnorodność metod instrumentalnych stwarzają wiele problemów przy w pełni przejrzystym ich sklasyfikowaniu, ponieważ istnieje wiele metod, które znajdują się na pograniczu możliwych do ustalenia ich grup.

Tabela 1.2. Metody instrumentalne oparte na zjawiskach fizykochemicznych

Lp.

Obserwowane zjawisko

Metoda analityczna

1.

Wydzielanie elektrolityczne

Elektrograwimetria,

Kulometria i miareczkowanie kulometryczne

2.

Przepływ prądu między elektrodami

Polarografia

Woltamperometria

Amperometria i miareczkowanie amperometryczne

3.

Zmiana potencjału elektrody wskaźnikowej

Potencjometria i miareczkowanie potencjometryczne

4.

Przewodnictwo elektryczne roztworów

Konduktometria i miareczkowanie konduktometryczne

Oscylometria i miareczkowanie oscylometryczne

5.

Promieniowanie α, β, γ

powstające w wyniku reakcji jądrowych

Metody radiometryczne

6.

Zmiana masy ogrzewanej próbki

Termograwimetria (TG)

7.

Efekty cieplne (związane ze zmianą masy)

Termiczna analiza różnicowa (DTA)

Dyskusyjne jest także kryterium podziału, dlatego w podręcznikach różnych autorów podziały te mogą być różne. W starszych podręcznikach część autorów proponowała podział metod instrumentalnych na:

– metody spektroskopowe (optyczne),

– metody elektrochemiczne,

– metody radiometryczne,

– metody chromatograficzne.

Do niedawna stosowano podział instrumentalnych metod analizy chemicznej na pięć grup:

– metody optyczne,

– metody spektroskopowe,

– metody elektroanalityczne,

– metody radiometryczne,

– metody rozdzielcze.

W ostatnich latach obserwuje się znaczny wzrost zainteresowania metodami analizy termicznej. Dlatego w proponowanym podręczniku zastosowano podział instrumentalnych metod analizy chemicznej na sześć grup:

1. Metody optyczne związane ze sprężystym oddziaływaniem promieniowania elektromagnetycznego na próbkę.

2. Metody spektroskopowe związane z niesprężystym oddziaływaniem promieniowania elektromagnetycznego na próbkę.

3. Metody elektroanalityczne (nazwa zalecana przez IUPAC) nazywane wcześniej elektrochemicznymi, związane z efektami towarzyszącymi przepływowi prądu elektrycznego przez badany roztwór lub spowodowane reakcjami zachodzącymi na elektrodach zanurzonych w badanym roztworze.

4. Metody rozdzielcze polegające na przeprowadzeniu oznaczanego składnika mieszaniny lub substancji przeszkadzających do innej fazy.

5. Metody radiometryczne związane z efektami naturalnej lub sztucznej promieniotwórczości oraz efektami współdziałania promieniowania jądrowego z badaną próbką.

6. Metody termoanalityczne polegające na badaniu przemian fizycznych i chemicznych zachodzących podczas kontrolowanych zmian temperatur.

1.4.1. Metody optyczne

Promieniowanie elektromagnetyczne jest rodzajem energii, mogącej przybierać różne formy, z których najbardziej znane to światło i promieniowanie cieplne. Promieniowanie elektromagnetyczne można traktować dwojako: jako falę (model fali sinusoidalnej) lub jako strumień fotonów (model korpuskularny). Oddziaływanie promieniowania elektromagnetycznego z próbką może mieć różny charakter i towarzyszyć mu mogą różne procesy, w zależności od właściwości próbki i energii promieniowania. Generalnie oddziaływania te mogą być sprężyste i niesprężyste.

W czasie oddziaływań sprężystych nie zachodzą zmiany ilości energii promieniowania, a wyłącznie zmiany jego kierunku (fali lub promieniowania korpuskularnego).

Metody te noszą nazwę metod optycznych i należą do nich (w nawiasie podano rodzaj zjawiska wykorzystywanego w danej metodzie):

1. Refraktometria (załamanie światła).

2. Interferometria (interferencja światła).

3. Polarymetria (polaryzacja światła i skręcenie płaszczyzny polaryzacji).

4. Nefelometria (rozproszenie światła).

5. Turbidymetria (rozproszenie światła).

1.4.2. Metody spektroskopowe

W przeciwieństwie do oddziaływania sprężystego – podczas niesprężystego oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego z badaną próbką zachodzi między nimi wymiana energii zgodnie z regułami kwantowo-optycznymi.

Oddziaływania niesprężyste pozwalają na lepsze scharakteryzowanie badanej próbki, a metody na nich oparte, zwane metodami spektroskopowymi, są szeroko rozpowszechnione. W wyniku tego rodzaju oddziaływań można uzyskać dwa rodzaje widm, które są podstawą odpowiednich metod spektroskopowych: absorpcyjnych i emisyjnych. Do metod spektroskopowych należą metody, w których wykorzystuje się promieniowanie elektromagnetyczne z zakresu 10⁶–10¹⁹ Hz, począwszy od częstotliwości radiowej do częstotliwości rentgenowskiej włącznie. Zakres powyżej 10¹⁹ Hz należy do metod radiometrycznych (tab. 1.3).

Tabela 1.3. Widmo elektromagnetyczne, jego dane charakterystyczne i zastosowania analityczne

Zakres

Częstotliwość drgań [Hz]

Liczba falowa [cm–1]

Długość fali

Energia kwantu [EV]

Generator

Detektor

Metoda analityczna

Fale akustyczne

10³–10⁵

300 km – 3 km

Mechaniczny

Fale radiowe

10⁶–10⁸

3000 m – 1 m

10–6–10–9

Obwody elektroniczne, kryształy

Antena

Magnetyczny i kwadrupolowy rezonans jądrowy

Mikrofale

10⁹–10¹¹

300 mm – 3 mm

10–3–10–5

Klistron, magnetron

Bolometr

Elektronowy rezonans paramagnetyczny (rotacja cząsteczek)

Podczerwień (IR)

10¹²–4 . 10¹⁴

30–12 000

300 μm – 0,8 μm

5 . 10–2–1

Źródło ciepła

Bolometr, ogniwo PbS

Spektrofotometria IR (oscylacja grup i cząsteczek)

Promienie widzialne (VIS) i nadfiolet (UV)

4 . 10¹⁴–
3 . 10¹⁵

12 000–100 000

800 nm – 100 nm

1–100

Lampa żarowa, wodorowa, rtęciowa itp.

Ogniwo fotoelektryczne,

fotopowielacz, płyta fotograficzna

Spektrofotometria VIS i UV (przejścia elektronowe)

Promienie rentgenowskie (X)

10¹⁶–10¹⁹

30 nm – 0,03 nm

10²–10⁵

Lampa rentgenowska

Liczniki, płyta fotograficzna

Metody rentgenowskie

Promienie γ

10¹⁹–10²²

3 . 10–9 cm –
3 . 10–12 cm

10⁴–10⁷

Bombardowanie ciężkich pierwiastków

Liczniki, fotopowielacz

Spektrometria γ

Promienie jądrowe o niskiej energii

10¹⁹–10²³

3 . 10–9 cm –
3 . 10–13 cm

10⁴–10⁸

Naturalne promieniotwórcze jądra

Liczniki

Metody radiometryczne

Promienie jądrowe o wysokiej energii

10²³–10²⁶

3 . 10–13 cm –
3 . 10–17 cm

10⁸–10¹²

Akceleratory

Komora pęcherzykowa, iskrowa

Pośrednio w metodach

aktywacyjnych

Do metod opartych na zjawisku absorpcji promieniowania (o różnym zakresie długości fali) przez cząsteczki badanego ośrodka należą:

1. Spektrofotometria UV (zakres nadfioletu).

2. Spektrofotometria VIS (zakres światła widzialnego).

3. Spektrofotometria IR (zakres podczerwieni).

4. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego NMR (zakres fal radiowych).

5. Spektroskopia paramagnetycznego rezonansu elektronowego EPR lub ESR (zakres mikrofal).

Na absorpcji promieniowania przez atomy próbki oparte są metody:

6. Atomowej spektrometrii absorpcyjnej AAS (zakres UV i VIS).

7. Absorpcji rentgenowskiej.

Pochłonięta (zaabsorbowana) energia jest następnie tracona przez daną próbkę w wyniku emisji odpowiedniego kwantu promieniowania lub w wyniku przejść bezemisyjnych (rozproszenie cieplne).

Do metod opartych na zjawisku wzbudzenia, a następnie emisji promieniowania przez cząsteczki ośrodka badanego należą:

8. Fluorymetria (zakres UV i VIS).

9. Spektrometria ramanowska (zakres IR).

Natomiast zjawiska wzbudzenia i emisji promieniowania przez atomy badanego ośrodka są wykorzystywane w następujących metodach:

10. Fluorescencja rentgenowska (wzbudzenie promieniami rentgenowskimi).

11. Fluorescencja atomowa (wzbudzenie promieniowaniem UV i VIS).

12. Fotometria płomieniowa (wzbudzenie termiczne w płomieniu palnika).

13. Spektrografia i spektrometria emisyjna (wzbudzenie termiczne np. z użyciem łuku lub iskry elektrycznej).

Do metod spektroskopowych zaliczana jest na ogół także spektrometria mas, w której wykorzystuje się zjawisko jonizacji oznaczanych składników próbki i odchylania powstałych jonów w polu magnetycznym proporcjonalnie do stosunku ich ładunku do masy (z/m). W efekcie powstaje widmo badanej próbki, które służy do oznaczenia jej składników jakościowych i ilościowych.

1.4.3. Metody elektroanalityczne

Do metod elektroanalitycznych zaliczane są metody wykorzystujące zjawiska związane z przepływem prądu elektrycznego przez roztwory elektrolitów lub związane z reakcjami zachodzącymi na elektrodach zanurzonych w takich roztworach.

Ze względu na zróżnicowanie metod elektroanalitycznych istnieją różne sposoby ich klasyfikacji; często metody te dzieli się na pięć zasadniczych grup:

1. Metody potencjometryczne, polegające na pomiarze potencjału elektrody wskaźnikowej zanurzonej w badanym roztworze, przy czym potencjał ten jest proporcjonalny do stężenia oznaczanego jonu. Do metod potencjometrycznych należą potencjometria bezpośrednia i miareczkowanie potencjometryczne.

Tabela 1.4. Klasyfikacja metod elektroanalitycznych na podstawie zjawisk zachodzących w ogniwie

Lp.

Zjawisko

Wielkość mierzona

Nazwa metody analitycznej

1.

Przez ogniwo nie płynie prąd stały (nie pobiera prądu z ogniwa)

Przewodność (opór elektryczny)

Konduktometria i miareczkowanie konduktometryczne; oscylometria i miareczkowanie oscylometryczne

Potencjał elektrody

Potencjometria i miareczkowanie potencjometryczne

2.

Elektroliza w całej masie roztworu

Masa metalu lub tlenku metalu wydzielona na elektrodzie

Elektrograwimetria

Porównanie elektrogramów. Masa substancji rozpuszczonej elektrodowo

Elektrografia

Nabój elektryczny

Kulometria i miareczkowanie kulometryczne

3.

Elektroliza warstwy dyfuzyjnej

Natężenie prądu jako funkcja przyłożonego napięcia

Polarografia stałoprądowa, zmiennoprądowa i pulsowa;

woltamperometria

Natężenie prądu przy stałym napięciu

Miareczkowanie amperometryczne

Różnica potencjałów elektrod

Miareczkowanie potencjometryczne przy stałym niewielkim natężeniu prądu

2. Metody elektrolityczne, polegające na przepływie prądu elektrycznego między elektrodami zanurzonymi w roztworze i wydzieleniu oznaczanego składnika na jednej z elektrod, a następnie jego zważeniu. Do metod elektrolitycznych należą elektrograwimetria (elektroliza) i elektroliza wewnętrzna.

3. Metody kulometryczne, polegające na pomiarze ładunku elektrycznego przepływającego przez badany roztwór elektrolitu, niezbędnego do przeprowadzenia reakcji elektroutlenienia lub elektoredukcji oznaczanego składnika. Wartość zmierzonego ładunku elektrycznego umożliwia bezpośrednie obliczenie masy oznaczanego składnika. W przypadku oznaczania pośredniego do badanego roztworu wprowadza się odpowiednio dobraną substancję, której produkt utlenienia lub redukcji reaguje ilościowo z oznaczanym składnikiem. Rozróżnia się metody kulometryczne przy stałym potencjale lub przy stałym natężeniu prądu.

4. Metody oparte na pomiarze przewodności lub pojemności elektrycznej badanego roztworu; do metod tych należą konduktometria, miareczkowanie konduktometryczne, oscylometria i miareczkowanie oscylometryczne.

5. Metody woltamperometryczne, polegające na pomiarze natężenia prądu elektrycznego płynącego w układzie dwu odpowiednich elektrod, zanurzonych w badanym roztworze, pod wpływem napięcia przyłożonego do tych elektrod. Do metod woltamperometrycznych należą m.in. polarografia stałoprądowa, polarografia zmiennoprądowa, polarografia pulsowa, oscylopolarografia, woltamperometria oraz miareczkowanie amperometryczne z jedną lub dwiema elektrodami polaryzowanymi.

1.4.4. Metody rozdzielcze

Ważną operacją poprzedzającą oznaczenie danej substancji jest oddzielenie lub maskowanie przeszkadzających składników mieszaniny. Bardzo niewiele metod analitycznych charakteryzuje się specyficznością, także selektywność wielu metod jest ograniczona, dlatego na ogół przed oznaczaniem wydziela się badany składnik lub oddziela przeszkadzające składniki matrycy. Często podczas rozdzielania badanej mieszaniny ma miejsce zatężanie (koncentracja) analizowanego składnika, przez co zwiększa się czułość oznaczenia. Istnieje wiele technik rozdzielczych (tab. 1.5).

Tabela 1.5. Wybrane metody rozdzielania

Podziałowe

Wytrąceniowe

Elektroanalityczne

Fizyczne

Mechaniczne

Ekstrakcja

Chromatografia

(gazowa, cieczowa) Wymiana jonowa

Wytrącanie,

Wytrącanie z nośnikiem

Elektroliza

Amalgamacja Elektroforeza

Elektrodializa

Destylacja

Suszenie

Krystalizacja

Wymrażanie

Sublimacja

Sedymentacja

Ultrawirowanie

Dializa

Sita molekularne

Sączenie sitowe i żelowe

Najczęściej stosowanymi instrumentalnymi metodami rozdzielczymi są:

1. Chromatografia, w której wykorzystuje się zjawisko podziału składników mieszaniny między fazę nieruchomą (stacjonarną) i ruchomą układu chromatograficznego.

2. Ekstrakcja, w której wykorzystuje się selektywne przemieszczanie oddzielanego składnika z jednej fazy do drugiej.

3. Elektroforeza, w której wykorzystuje się zróżnicowaną szybkość poruszania się naładowanych cząstek badanej mieszaniny w polu elektrycznym.

1.4.5. Metody radiometryczne

Metody radiometryczne polegają na pomiarze promieniowania jądrowego emitowanego przez naturalne i sztuczne izotopy promieniotwórcze. W metodach tych wykorzystywane są także efekty naświetlania badanej próbki promieniowaniem jądrowym.

Wśród metod radiometrycznych można wyróżnić następujące grupy:

1. Metody oparte na absorpcji i odbiciu promieniowania jądrowego.

2. Metody oznaczania naturalnych pierwiastków promieniotwórczych w wyniku bezpośredniego pomiaru ich aktywności.

3. Metody aktywacyjne, polegające na naświetlaniu badanej próbki odpowiednim promieniowaniem (głównie neutronami i fotonami). W efekcie zachodzących w próbce przemian jądrowych powstają izotopy promieniotwórcze pierwiastków, emitujące promieniowanie, którego pomiar pozwala na identyfikację i oznaczenie danego pierwiastka. Do najważniejszych metod aktywacyjnych należą: metoda aktywacji neutronami termicznymi (reaktorowa), metoda aktywacji neutronami szybkimi (generatorowa) i metoda fotoaktywacji (betatronowa).

4. Metody polegające na wzbudzeniu atomów poprzez naświetlanie ich promieniowaniem γ ze źródeł izotopowych. Wzbudzone atomy emitują następnie charakterystyczne promieniowanie fluorescencyjne, którego pomiar umożliwia oznaczenie badanych pierwiastków. Metoda nosi nazwę niedyspersyjnej fluorescencji rentgenowskiej.

5. Metody wskaźników promieniotwórczych, których stosowanie ma istotne znaczenie w innych metodach analitycznych, szczególnie w metodach rozdzielczych.

Ponieważ w metodach radiometrycznych wykorzystuje się izotopy promieniotwórcze, podczas pracy z nimi niezbędne są odpowiednio wyposażone laboratoria i konieczność przestrzegania przepisów ochrony radiologicznej. Ze względu na specyfikę praktycznego stosowania tych metod, nie będą one omawiane w dalszej części tego podręcznika.

1.4.6. Metody termoanalityczne

Metody termoanalityczne, a szczególnie DSC lub DTA stosowane alternatywnie oraz TG, są nowoczesnymi, zautomatyzowanymi i skomputeryzowanymi technikami instrumentalnymi, które umożliwiają badanie w szerokim zakresie temperatur przemian fizycznych i chemicznych, jakim ulegają różne substancje i mieszaniny tych substancji, na różnych etapach procesu technologicznego podczas zmian temperatur zachodzących w kontrolowany sposób.

W odróżnieniu od powszechnie stosowanych innych metod analizy instrumentalnej, takich jak: techniki spektrofotometryczne, elektroanalityczne, chromatograficzne lub elektroforetyczne, metody analizy termicznej zapewniają szybką analizę próbki bez konieczności jej wstępnego przygotowania.

Tabela 1.6. Przegląd metod analizy termicznej

Mierzony parametr

Metoda

Skrót

Temperatura

Krzywe ogrzewania i studzenia

Różnica temperatury

Różnicowa analiza termiczna

DTA

Swobodny przepływ strumienia ciepła (heat flux)

Różnicowa kalorymetria skaningowa

DSC

Kompensowany przepływ ciepła (power compensation)

Różnicowa kalorymetria skaningowa

DSC

Zmiana masy

Termograwimetria

TG

Objętość wydzielającego się składnika gazowego

Detekcja produktów gazowych

EGD

Analiza składu chemicznego wydzielanych gazów

Analiza składu produktów gazowych

EGA

Oznaczanie wydzielających się radioaktywnych składników gazowych

Emanacyjna analiza termiczna ETA

ETA

Dyfrakcja promieni X

Termodyfraktometria

Przepływ prądu elektrycznego

Termoelektrometria

Polaryzacja elektryczna

Dielektryczna analiza termiczna

Magnetyzacja

Termomagnetometria

Zmiana wymiarów

Termodylatometria

TD

Deformacja pod wpływem obciążeń

Analiza termomechaniczna

TMA

Moduł tłumienia drgań wywołanych oscylacyjnym obciążeniem

Dynamiczna analiza termomechaniczna

DTMA

Przepływ fal akustycznych

Termoakustymetria

TA

Natężenie efektów dźwiękowych

Termosonimetria

TS

Współczynnik załamania światła

Termorefraktometria

Luminescencja

Termoluminescencja

Pomiar widma światła przechodzącego lub odbitego

Termospektroskopia

Obraz mikroskopowy

Termomikroskopia

Spośród technik analizy termicznej największe znaczenie w praktyce zyskały:

1. Różnicowa analiza termiczna (DTA). Polega na pomiarze różnicy temperatury (ΔT) między próbką (Ts) i substancją odniesienia (Ti). Obie substancje ogrzewane są równocześnie w jednakowych warunkach przy liniowym wzroście lub obniżaniu temperatury. Uzyskaną różnicę temperatury rejestruje się w funkcji czasu (t) lub temperatury (T), otrzymując krzywą DTA:

2. Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC). Rejestruje się tutaj energię konieczną do sprowadzenia do zera różnicy temperatur między próbką i substancją odniesienia. Podobnie jak w DTA, obie próbki ogrzewa się lub chłodzi w sposób kontrolowany, a krzywa DSC odzwierciedla ilość ciepła wymienionego przez próbkę z otoczeniem w jednostce czasu w funkcji czasu (t) lub temperatury (T):

3. Termograwimetria (TG). W metodzie tej rejestruje się zmiany masy, jej ubytek, względnie przyrost (Δm), zachodzące w wyniku ogrzewania próbki w warunkach liniowego wzrostu temperatury i wykreśla się te zmiany w funkcji czasu (t) lub temperatury (T), otrzymując krzywą TG:

lub rejestruje się szybkość zmiany masy (dm/dt), uzyskując różniczkową krzywą termograwimetryczną (DTG):

Pozostałe metody termoanalityczne nie znajdują tak szerokiego zastosowania, ponieważ wymagają bardzo skomplikowanej aparatury i mogą być wykorzystane jedynie w przypadku badania wąskiej grupy substancji.

1.5. Literatura książkowa

Wymienione niżej książki są na ogół podręcznikami studenckimi lub stanowią opracowania zagadnień wchodzących w zakres instrumentalnych metod analitycznych.

1. Alpert N.L., Keiser W.E., Szymański H.A.: Spektroskopia w podczerwieni. PWN, Warszawa 1974.

2. Barańska H., Łabudzińska A., Terpiński J.: Laserowa spektrometria ramanowska. PWN, Warszawa 1981.

3. Brzózka Z. (red.): Laboratorium analizy instrumentalnej. Politechnika Warszawska, Warszawa 1998.

4. Brzózka Z. (red.): Miniaturyzacja w analityce. Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, Warszawa 2005.

5. Bulska E., Pyrzyńska K. (red.): Zastosowanie metod spektrometrii atomowej w przemyśle i ochronie środowiska. Komitet Chemii Analitycznej PAN, Warszawa 1999.

6. Camman K.: Zastosowanie elektrod jonoselektywnych. WNT, Warszawa 1977.

7. Cygański A.: Metody spektroskopowe w chemii analitycznej. WNT, Warszawa 2017.

8. Cygański A.: Metody elektroanalityczne. WNT, Warszawa 1995.

9. Dittrich K.: Absorpcyjna spektrometria atomowa. PWN, Warszawa 1988.

10. Galus Z.: Teoretyczne podstawy elektroanalizy chemicznej. PWN, Warszawa 1977.

11. Ewing G.W.: Metody instrumentalne w analizie chemicznej. PWN, Warszawa 1980.

12.  Farmakopea Polska V. T. 1–3. Wydawnictwo Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego, Warszawa 2016.

13. Jarosz M., Malinowska E.: Pracownia chemiczna. Analiza instrumentalna. Wydawnictwa Szkolne i Pedagogiczne, Warszawa 1994.

14. Kalwoda R. (red.): Elektroanaliza w ochronie środowiska naturalnego. WNT, Warszawa 1992.

15. Kęcki Z.: Podstawy spektroskopii molekularnej. PWN, Warszawa 1992.

16. Kryściak J.: Chemiczna analiza instrumentalna. PZWL, Warszawa 1989.

17. Michalski R.: Chromatografia jonowa. Podstawy i zastosowania. WNT, Warszawa 2020.

18. Marczenko Z.: Spektrofotometryczne oznaczanie pierwiastków. PWN, Warszawa 2001.

19. Minczewski J., Chwastowska J., Dybczyński R.: Analiza śladowa. WNT, Warszawa 1973.

20. Minczewski J., Marczenko Z.: Chemia analityczna. T. 3. Analiza instrumentalna. PWN, Warszawa 2018.

21. Namieśnik J. (red.): Metody instrumentalne w kontroli zanieczyszczeń środowiska. Politechnika Gdańska, Gdańsk 1992.

22. Nowicka-Jankowska T. (red.): Spektrofotometria UV-VIS w analizie chemicznej. PWN, Warszawa 1988.

23. Pinta M.: Absorpcyjna spektrometria atomowa. PWN, Warszawa 1977.

24. Przeszlakowski S.: Obliczenia w chemii analitycznej. Akademia Medyczna, Lublin 1996.

25. Suprynowicz Z. (red.): Współczesne kierunki chromatografii. UMCS, Lublin 1986.

26. Szczepaniak W.: Metody instrumentalne w analizie chemicznej. PWN, Warszawa 2022.

27. Szmal Z.S., Lipiec T.: Chemia analityczna z elementami analizy instrumentalnej. PZWL, Warszawa 1996.

28. Szyszko E.: Instrumentalne metody analityczne. PZWL, Warszawa 1982.

29. Wesołowski M., Szefer K., Zimna D.: Zbiór zadań z analizy chemicznej. WNT, Warszawa 2021.

30. Witkiewicz Z., Kałużna-Czaplińska J.: Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych. WNT, Warszawa 2017.

31. Witkiewicz Z., Wardencki W.: Chromatografia gazowa. PWN, Warszawa 2021.

32. Zuba D., Parczewski A. (red.). Chemometria w analityce: wybrane zagadnienia. Wydawnictwo Instytutu Ekspertyz Sądowych, Kraków 2008.

Część II Metody optyczne

2 Refraktometria Anna Błażewicz

2.1. Podstawy teoretyczne

Światło padające na powierzchnię oddzielającą od siebie dwa ośrodki przezroczyste częściowo ulega na granicy tych ośrodków odbiciu, a częściowo przechodzi do II ośrodka, zmieniając na powierzchni granicznej kierunek swego biegu. Jeżeli światło rozchodzi się w tych ośrodkach z różną prędkością, wtedy następuje zjawisko jego załamania (refrakcji), będącego wynikiem zmiany długości fali świetlnej (ryc. 2.1).

Rycina 2.1. Kąt padania, odbicia i załamania.

Zjawiska odbicia i załamania światła zostały ujęte ilościowo w 1626 roku przez Snelliusa w postaci następujących praw optyki geometrycznej:

1. Promień padający, odbity, załamany i prosta prostopadła do płaszczyzny rozgraniczającej obydwa ośrodki w punkcie padania promienia leżą w jednej płaszczyźnie.

2. Kąt padania równa się kątowi odbicia.

3. Stosunek sinusa kąta padania do sinusa kąta załamania jest dla danych dwóch ośrodków wielkością stałą, zwaną względnym współczynnikiem załamania lub współczynnikiem refrakcji n₂₁ (ośrodka drugiego względem pierwszego).

(2.1)

gdzie:

α – kąt padania,

β – kąt załamania.

Kierując się obowiązującą w optyce geometrycznej zasadą odwracalności biegu promieni (jeżeli promień biegnący w ośrodku II pada na granicę ośrodków pod kątem β, to promień załamany w ośrodku I będzie biegł pod kątem α), można zapisać definicję współczynnika załamania ośrodka pierwszego względem drugiego następująco:

(2.2)

gdzie:

n₁₂ – współczynnik załamania ośrodka I względem II.

Zależność między n₂₁ a n₁₂ jest następująca:

(2.3)

Zgodnie z falową teorią światła współczynnik załamania n₂₁ wyraża stosunek prędkości światła w obu ośrodkach:

(2.4)

gdzie:

v₁ – prędkość światła w I ośrodku,

v₂ – prędkość światła w II ośrodku.

Załamanie światła jest przyczyną tego, że przedmioty znajdujące się w ośrodku o większym współczynniku załamania, np. w szkle lub w wodzie, obserwowane z powietrza wydają się bliższe niż w rzeczywistości, np. rzeka z czystą wodą wydaje się płytsza niż z wodą mętną.

Jeżeli kąt padania α jest większy od kąta załamania β, to ośrodek I jest optycznie rzadszy niż ośrodek II i odwrotnie, gdy kąt α jest mniejszy od kąta β, to ośrodek I jest optycznie gęstszy od ośrodka II. Ośrodek optycznie gęstszy to ośrodek o większym współczynniku załamania (mniejszej prędkości światła), a ośrodek optycznie rzadszy to ośrodek o mniejszym współczynniku załamania (większej prędkości rozchodzenia się światła).

Rycina 2.2. Kąt graniczny.

Jeżeli zwiększy się kąt padania α do 90°, wówczas kąt załamania β również się zwiększy i w tym przypadku osiągnie maksymalną wartość, zwaną kątem granicznym (β× = βgran.). Wtedy wzór na współczynnik n21 przyjmie postać:

stąd

(2.5)

Pomiar kąta granicznego βgran. umożliwia obliczenie wartości współczynnika załamania światła w danym ośrodku.

W praktyce nie wyznacza się współczynnika załamania światła z pomiaru kąta padania i kąta załamania na granicy powietrze–substancja badana, ale bada się układ substancja badana–pryzmat szklany o dokładnie znanym n. Badana substancja (ciecz lub ciało stałe) jest ośrodkiem optycznie rzadszym (o współczynniku załamania n₁), a ośrodkiem optycznie gęstszym jest pryzmat szklany o współczynniku załamania światła n₂ > n₁. Znając wartość liczbową kąta granicznego βgran. i współczynnika załamania światła pryzmatu n₂, można obliczyć współczynnik załamania badanej substancji z równania:

(2.6)

Tak więc, aby określić wartość współczynnika załamania światła jakiegoś ośrodka n₁, wystarczy znać wartość współczynnika załamania innego ośrodka n₂ oraz kąta granicznego w drugim ośrodku βgran., zakładając, że współczynnik załamania w ośrodku II jest większy od współczynnika załamania ośrodka I.

Powyższe rozważania dotyczą ośrodków izotropowych, czyli takich, które we wszystkich kierunkach wykazują jednakowe właściwości fizyczne (np. gazy, ciecze niewykazujące zmiany współczynnika załamania światła w czasie ruchu w stosunku do stanu spoczynku, kryształy układu regularnego).

Zjawisko załamania światła w ośrodkach anizotropowych jest bardziej złożone (załamanie różne w różnych kierunkach).

W literaturze najczęściej podawane są tzw. bezwzględne współczynniki załamania, czyli współczynniki załamania ośrodków względem próżni. Mają one zawsze wartość większą od 1, ponieważ światło rozchodzi się w próżni z prędkością większą niż w jakimkolwiek innym ośrodku. Próżnię jako ośrodek odniesienia stosuje się zwykle przy pomiarach współczynnika załamania gazów, natomiast dla substancji stałych i ciekłych współczynniki załamania oblicza się w stosunku do powietrza. Prędkość światła w powietrzu niewiele różni się od prędkości światła w próżni, dlatego błąd pomiaru w przypadku obliczeń w stosunku do powietrza zamiast do próżni jest niewielki i wynosi ok. 0,03%.

Istnieje prosta zależność między względnymi i bezwzględnymi współczynnikami załamania dwóch sąsiadujących ze sobą ośrodków, a mianowicie skoro a  przy czym c oznacza prędkość światła w próżni, n₁ i n₂ – bezwzględne współczynniki załamania odpowiednich ośrodków, to:

(2.7)

Wartość współczynnika załamania światła dla danych dwóch ośrodków zależy m.in. od długości fali, przy czym rośnie ona w miarę stosowania coraz krótszych długości fali użytego światła. W celu zwiększenia dokładności pomiarów laboratoryjnych używa się światła monochromatycznego o długości fali linii D sodu λ = 589,3 nm, oznaczając współczynnik załamania symbolem nD. Użycie światła białego powoduje, że pomiar będzie niezbyt dokładny, ponieważ poszczególne jego składowe załamują się pod różnymi kątami.

Na wartość współczynnika załamania wpływa również temperatura. Dla ciekłych związków organicznych wzrost temperatury o 1°C wywołuje na ogół zmniejszenie wartości współczynnika załamania o wartość od 3,5 · 10–4 do 5,5 · 10–4. Zwykle dokonuje się pomiarów w temperaturze 20°C, a wartość współczynnika załamania zapisuje symbolem .

Tabela 2.1. Wartości współczynników załamania światła niektórych substancji przy świetle sodowym (λ = 589,3 nm) zmierzone względem powietrza pod ciśnieniem normalnym (1013 hPa) w temperaturze 20°C

Substancja

[n]D²⁰

Woda

1,332988

Etanol

1,3617

Szkło kwarcowe

1,4584

Sól kuchenna

1,544258

Jodek metylenu

1,742

Diament

2,4173

Zależność współczynnika załamania światła od długości fali zwana jest dyspersją (rozszczepieniem) światła i prowadzi do rozszczepienia światła przy przejściu przez pryzmat. Najczęściej wyznacza się współczynniki załamania światła dla linii widm następujących pierwiastków (w odniesieniu do powietrza w temperaturze 15°C i pod ciśnieniem 1013 hPa).

Ca – symbol linii H,

 λ = 396,8 nm

Ca – symbol linii G,

 λ = 430,8 nm

Hβ – symbol linii F,

 λ = 486,1 nm

He – symbol linii E,

 λ = 587,6 nm

Na – symbol linii D₁,

 λ = 589,0 nm

D,

 λ = 589,3 nm

D₂,

 λ = 589,6 nm

Hα – symbol linii C,

 λ = 656,3 nm

K – symbol linii A,

 λ = 769,9 nm

Rozróżnia się dyspersję średnią , dyspersję względną oraz dyspersję właściwą , gdzie d – gęstość cieczy mierzona w temperaturze, w której wyznaczono współczynnik załamania nF i nC. Odwrotność dyspersji względnej nazywa się współczynnikiem dyspersji lub liczbą Abbégo V:

(2.8)

Na podstawie znajomości dyspersji światła można identyfikować w mieszaninach, składniki o bardzo zbliżonych wartościach współczynnika załamania.

Nieznaczny wpływ na wartość współczynnika załamania ma ciśnienie. Wzrost ciśnienia o 1013 hPa zwiększa wartość n o ok. 3 · 10–5. Zależność współczynnika załamania od ciśnienia ma większe znaczenie dla ośrodków gazowych, gdzie wartość bezwzględnego współczynnika załamania gazów N wyraża się następująco:

·

(2.9)

gdzie:

N – bezwzględny współczynnik załamania światła dla gazu w temperaturze t (w °C) i pod ciśnieniem p (w hPa),

N₀ – bezwzględny współczynnik załamania dla gazu w 0°C i pod ciśnieniem p = 1013 hPa,

α – współczynnik rozszerzalności termicznej gazu

Należy zauważyć, że współczynnik załamania światła jest wielkością bezwymiarową, a jego wartość dla wodnych roztworów związków nieorganicznych i ciekłych związków organicznych zawarta jest w granicach od 1,3 do 1,8, a dla ciał stałych od 1,3 do 2,5.

Współczynnik załamania światła jako wielkość charakterystyczna dla danej substancji umożliwia jej identyfikację, a jego zależność od stężenia wykorzystywana jest w analizie ilościowej.

Zależności te wykorzystuje się w metodzie analitycznej, zwanej refraktometrią.

Refraktometria umożliwia także identyfikację badanych substancji oraz badanie struktury związków chemicznych. Dzięki znajomości współczynników załamania, gęstości oraz mas cząsteczkowych związków chemicznych można obliczyć ze wzoru Lorenza i Lorentza wielkość stałą dla danego związku, zwaną refrakcją molową RM.

(2.10)

gdzie:

M – masa molowa,

d – gęstość.

Tabela 2.2. Wartości refrakcji molowych niektórych związków chemicznych w temperaturze 20°C

Związek chemiczny

Refrakcja [ml ∙ mol–1]

Woda

3,75

Aceton

16,15

Etanol

12,78

Kwas octowy

12,99

Tetrachlorek węgla

26,51

Benzen

26,14

Refrakcja molowa jest wielkością addytywną, tzn. stanowi sumę refrakcji przypisanych poszczególnym atomom, grupom funkcyjnym i rodzajom wiązań w danej cząsteczce, co można zapisać następująco:

(2.11)

gdzie:

– liczba atomów albo wiązań w danej cząsteczce,

Ra – refrakcja atomowa.

Z powyższego założenia można obliczyć refrakcję molową związku o złożonej strukturze i dokonać porównania obliczonej wartości z wartością refrakcji wyznaczonej doświadczalnie (dla zmierzonej gęstości i współczynnika załamania światła – patrz wzór 2.10).

Wartość refrakcji molowej nie zależy od temperatury i stanu skupienia cząsteczek, a jej wymiarem jest [ml ∙ mol–1]. Przyjęto, że refrakcja molowa RM oznacza taką objętość, która w molu badanej substancji jest zajęta przez materię korpuskularną. Potwierdzeniem tego jest fakt, że refrakcje molowe pary wodnej i ciekłej wody są prawie jednakowe – w świetle żółtej linii D światła sodowego RM dla pary wodnej w temperaturze 100°C wynosi 3,716 ml, a dla ciekłej wody w temperaturze 20°C wynosi 3,715 ml. Wartość refrakcji molowej zależy jedynie od rodzaju i liczby atomów wchodzących w skład cząsteczki oraz od rodzaju wiązań występujących między nimi. Ponadto wprowadzenie określonej grupy funkcyjnej zwiększa refrakcję danego związku.

2.2. Aparatura w refraktometrii

Główną częścią refraktometrów są dwa pryzmaty wykonane ze szkła flintowego o znanym współczynniku załamania światła n₂, tak dobranym, aby n₂ było większe od współczynnika załamania światła badanej substancji n₁ umieszczonej pomiędzy tymi pryzmatami.

Rycina 2.3. Bieg promieni w dwóch pryzmatach.

Bieg promieni świetlnych w dwóch pryzmatach przedstawia rycina 2.3. Przy obrocie pryzmatów zmienia się kąt e, pod którym promień świetlny pada na płaszczyznę graniczną (pryzmat–ciecz badana) i pod którym przechodzi w pryzmacie górnym. Jeżeli zostanie przekroczony kąt graniczny wewnętrznego odbicia, wtedy promień świetlny nie wchodzi do cieczy badanej. Przy obrocie pryzmatów pojawia się w okularze linia rozgraniczająca pole jasne i ciemne, którą ustawia się na skrzyżowaniu tzw. nici pajęczych w okularze.

Rycina 2.4. Refraktometr RL 2 widziany od strony pryzmatów: 1 – ruchomy pryzmat pomiarowy (górny), 2 – pryzmat pomiarowy nieruchomy (dolny), 3 – końcówki do podłączenia ultratermostatu, 4 – termometr, 5 – pokrywa zamykająca wlot światła do pryzmatu górnego, uniesiona jak do pomiaru w świetle przechodzącym, 6 – lusterko odchylone jak do pomiaru w świetle odbitym, 7 – pokrętło do usuwania barwy na granicy światła i cienia, 8 – okular.

Rycina 2.5. Refraktometr RL 2 widziany od strony okularu: 1 – okular, 2 – pokrętło do ustawiania granicy światła i cienia, 3 – lusterko do oświetlania skali widocznej w okularze.

W polskich laboratoriach, najczęściej stosowanym przyrządem do pomiarów współczynnika załamania światła jest refraktometr typu RL 2, ewentualnie RL 3 (odmiana refraktometru Abbégo), produkcji PZO (ryc. 2.4 i 2.5). Refraktometry te umożliwią pomiar współczynnika refrakcji w świetle przechodzącym lub w świetle odbitym. W większości przypadków pomiaru dokonuje się w świetle przechodzącym. Jeżeli jednak analizowana ciecz silnie pochłania światło, wtedy wartość współczynnika mierzy się w świetle odbitym. Górny pryzmat aparatu (1) jest ruchomy, a po jego podniesieniu na dolnym pryzmacie (2) umieszcza się analizowaną ciecz. Wartość współczynnika refrakcji zależy od temperatury, dlatego aparat posiada końcówki (3) do połączenia z ultratermostatem, w celu utrzymywania pryzmatów w stałej temperaturze.

Jeżeli do oświetlenia pryzmatów używa się światła białego, wtedy w okularze zamiast ostrej granicy między polem jasnym i ciemnym powstanie barwna smuga spowodowana dyspersją światła (kąt graniczny jest dla każdej długości fali inny). Usunięcie tej „przeszkody” umożliwia urządzenie zwane kompensatorem (7). Kompensator składa się z dwóch pryzmatów a vision directe. Pryzmat a vision directe rozszczepia światło, nie zmieniając kierunku biegu światła żółtej linii sodu. Jest on zestawiony z trzech pryzmatów ze szkła crown i flint o odpowiednio dobranych kątach łamiących.

Rycina 2.6. Pryzmat prostego widzenia (a vision directe).

W zależności od wzajemnej orientacji pryzmatów można zmieniać wartość dyspersji od zera do wartości maksymalnej (przy czym światło sodowe o λ = 589,3 nm nie ulega odchyleniu). Pokręcając śrubą kompensatora, uzyskuje się ostry obraz granicy, której położenie odpowiada wartości współczynnika załamania światła. Poprzez obrót pokrętła (2) ustawia się rozgraniczenie pól na środku widocznego w okularze krzyża.

Pole widzenia w okularze (ryc. 2.7) składa się z prostokątnego okienka i znajdującej się poniżej skali z dwiema podziałkami – górnej podającej wartości współczynnika załamania światła i dolnej wyrażającej procentową zawartość cukru w roztworze.

Refraktometr RL 2 (lub RL 3) umożliwia pomiar współczynników załamania światła w zakresie od 1,30 do 1,70 z dokładnością do ok. 1 · 10–4, w zakresie temperatury od 0 do 75°C. Przyrząd wykorzystuje się również do określania procentowej zawartości cukru w roztworach wodnych w zakresie od 0 do 85% i do oznaczania dyspersji cieczy. Może on służyć także do wyznaczenia współczynników załamania światła ciał

Rycina 2.7. Pole widzenia w okularze refraktometru RL 2.

stałych o płaskiej powierzchni. W takim przypadku badane ciało stałe należy położyć na pryzmat dolny, natomiast pryzmat odchylający podnieść. Aby zapewnić kontakt optyczny, między stykające się powierzchnie wprowadza się cienką warstwę cieczy, której współczynnik załamania światła jest mniejszy lub równy współczynnikowi załamania ciała stałego.

Przed wykonywaniem pomiarów należy zapoznać się z instrukcją obsługi aparatu. Należy dodać, że pomiary refraktometryczne wymagają bezwzględnego zachowania wysokiej czystości pracy oraz ścisłego przestrzegania stałej temperatury pomiaru.

2.3. Zastosowanie refraktometrii

Dużymi zaletami metody refraktometrycznej są szybkość pomiaru i małe zużycie badanej substancji. Refraktometria umożliwia identyfikację wielu substancji oraz oznaczenia ilościowe, np. białka całkowitego w surowicy krwi, cukru, tłuszczu itd. Wykorzystuje się przy tym liniową zależność współczynnika załamania światła od stężenia oznaczanych substancji. Metodę można stosować do określania składu dwuskładnikowych mieszanin substancji o współczynnikach załamania dostatecznie różniących się między sobą, a także do badania środków leczniczych, spożywczych oraz w wielu procesach technologicznych. Opisane wcześniej wyznaczanie refrakcji molowej pozwala na wyciągnięcie wniosków odnośnie do budowy cząsteczki związku chemicznego.

3 Polarymetria Anna Błażewicz

3.1. Podstawy teoretyczne

3.1.1. Polaryzacja światła

Badania Maxwella dotyczące teorii zjawisk elektromagnetycznych doprowadziły do stwierdzenia, że światło jest falą elektromagnetyczną, której drgania zachodzą we wszystkich możliwych kierunkach (płaszczyznach), zawsze prostopadłych do kierunku biegu promienia. Światło takie jest niespolaryzowane (ryc. 3.1a).

Rycina 3.1a, b. Kierunki drgań świetlnych: a – różne kierunki w wiązce światła niespolaryzowanego, b – jeden kierunek w wiązce światła spolaryzowanego.

Światło spolaryzowane jest natomiast takim światłem, w którym drgania fali świetlnej są uporządkowane w jednej płaszczyźnie (ryc. 3.1b).

Drgania wektora natężenia pola elektrycznego E i wektora natężenia pola magnetycznego H są w fali świetlnej wzajemnie prostopadłe do siebie i do kierunku rozchodzenia się fali. Wektor E, zwany wektorem świetlnym, wyznacza kierunek drgań promieni świetlnych. Płaszczyzna, w której zachodzą drgania, nazywa się płaszczyzną drgań, a płaszczyzna prostopadła do niej płaszczyzną polaryzacji (ryc. 3.2).

Rycina 3.2. Schemat światła spolaryzowanego liniowo: E – wektor natężenia pola elektrycznego, H – wektor natężenia pola magnetycznego, r – promień.

Rycina 3.3a–c. Zjawiska, w których powstaje światło spolaryzowane: a – odbicie światła od powierzchni pod kątem Brewstera, b – dwójłomność, c – dichroizm.

Najprostsze sposoby otrzymywania światła spolaryzowanego oparte są na:

1. Odbiciu światła od ośrodka o współczynniku załamania n pod tzw. kątem Brewstera j, czyli kątem padania, przy którym promień odbity jest prostopadły do promienia załamanego, spełniającego zależność n = tg j (promień odbity jest całkowicie spolaryzowany, a promień załamany częściowo spolaryzowany) (ryc. 3.3a). Dla szkła o współczynniku załamania n = 1,5 kąt Brewstera równa się 56,3°, a dla wody wynosi 53° i zależy od długości fali światła.

2. Zjawisku dwójłomności, polegającym na tym, że promień światła niespolaryzowanego padający na pewne substancje anizotropowe (np. minerał kalcyt zwany szpatem islandzkim) rozdziela się na dwa promienie spolaryzowane w płaszczyznach wzajemnie prostopadłych (ryc. 3.3b).

3. Zjawisku dichroizmu, czyli różnego (wybiórczego) pochłaniania promienia zwyczajnego i nadzwyczajnego w ośrodku anizotropowym (ryc. 3.3c).

Na zasadzie dichroizmu oparte jest działanie polaroidów, czyli cienkich płytek składających się z warstwy jednakowo zorientowanych, bardzo małych kryształów, np. turmalinu lub siarczanu jodochininy, gęsto ułożonych na błonie celuloidowej, zabezpieczonych cienką płytką szklaną. Jeżeli ustawi się błonę prostopadle do wiązki światła niespolaryzowanego, wówczas drgania prostopadłe zostaną praktycznie całkowicie przepuszczone, natomiast równoległe do łańcuchów polimerów nasyconych atomami jodu zostaną pochłonięte przez te atomy. Tak więc, światło niespolaryzowane po przejściu przez polaroid staje się światłem spolaryzowanym liniowo.

Rycina 3.4. Schemat pryzmatu Nicola.

W praktyce w polarymetrach światło spolaryzowane otrzymuje się, stosując pryzmaty Nicola, nazywane potocznie nikolami (ryc. 3.4). Charakterystyczna budowa nikola ma na celu przepuszczenie jednego z promieni – promienia nadzwyczajnego, a zatrzymanie (usunięcie) drugiego – promienia zwyczajnego. Nikol składa się z dwóch pryzmatów kalcytu (CaCO₃) oszlifowanych w taki sposób, aby kąt łamiący pryzmatu wynosił 68° i sklejonych w miejscu przecięcia wzdłuż osi balsamem kanadyjskim o współczynniku załamania n = 1,55.

Promień światła niespolaryzowanego, padając na nikol, rozdziela się na dwa promienie: zwyczajny (nz = 1,66) i nadzwyczajny (nn = 1,49). Obydwa promienie są spolaryzowane i drgają w płaszczyznach prostopadłych do siebie. Promień zwyczajny podlega prawom Snelliusa (patrz rozdz. 2) i padając na granicę ośrodków, kalcyt (ośrodek optycznie gęstszy) – balsam kanadyjski (ośrodek optycznie rzadszy) pod pewnym kątem (większym od βgran.) – ulega całkowicie wewnętrznemu odbiciu i pochłonięciu przez nikol. Promień nadzwyczajny, niepodlegający prawom optyki, przechodzi przez warstwę balsamu kanadyjskiego oraz drugi pryzmat z kalcytu i wychodzi z nikola nieco osłabiony i spolaryzowany liniowo.

Jeżeli ustawi się dwa identyczne nikole tak, aby otrzymane światło spolaryzowane w jednym z nich padało na drugi, wówczas, obracając drugim nikolem, obserwuje się pojawianie i zanikanie jasnego obrazu.

Rycina 3.5. Nikole ustawione równolegle.

Stwierdzono, że światło spolaryzowane przechodzi bez przeszkód przez nikol tylko wtedy, gdy płaszczyzna przecięcia głównego nikola jest równoległa do płaszczyzny drgań wektora świetlnego. Światło spolaryzowane powstałe w jednym nikolu przechodzi przez drugi nikol, jeżeli oba nikole ustawi się płaszczyznami przecięcia głównego równolegle do siebie (ryc. 3.5).

Rycina 3.6. Nikole skrzyżowane.

Jeżeli płaszczyzna drgań światła spolaryzowanego jest prostopadła do płaszczyzny przecięcia głównego nikola, wtedy światło spolaryzowane nie przechodzi przez tak ustawiony nikol. Oznacza to, że światło spolaryzowane wytworzone w jednym z nikoli nie przechodzi przez drugi z nich, jeżeli nikole ustawi się płaszczyznami przecięcia głównego prostopadle do siebie. Tak ustawione nikole nazywa się skrzyżowanymi (ryc. 3.6).

Pierwszy z nich, za którego pomocą otrzymuje się światło spolaryzowane, nazywa się polaryzatorem, a drugi, za którego pomocą można zmierzyć o jaki kąt została skręcona płaszczyzna polaryzacji światła, nazywa się analizatorem.

3.1.2. Czynność optyczna substancji

W metodzie optycznej zwanej polarymetrią mierzy się wartość kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego liniowo. Zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego mają substancje optycznie czynne zarówno organiczne, jak i nieorganiczne, np. kwarc, białka czy roztwory cukrów.

Aktywność optyczna substancji jest związana z budową przestrzenną jej cząsteczek. Najogólniej mówiąc, jeżeli cząsteczki danego związku nie posiadają elementów symetrii (tj. środka symetrii i płaszczyzny symetrii) są optycznie czynne.

Cząsteczki asymetryczne są równocześnie cząsteczkami chiralnymi (gr. cheir – ręka), tzn. nie są identyczne z ich odbiciami lustrzanymi, tak jak relacja pomiędzy prawą i lewą ręką, których nie można nałożyć na siebie tak, aby pokrywały się ze sobą wszystkie palce. Najczęstszym, choć niejedynym powodem asymetrii cząsteczki, jest obecność czterech różnych podstawników związanych z tym samym atomem węgla, tzw. węglem asymetrycznym.

np. aldehyd glicerynowy

Centrami chiralnymi cząsteczek organicznych mogą być nie tylko atomy węgla, lecz także takie heteroatomy, jak azot, siarka czy fosfor.

Substancje optycznie czynne mogą skręcać płaszczyznę polaryzacji światła w prawo (są to tzw. substancje prawoskrętne) lub w lewo (substancje lewoskrętne). Jeżeli substancja skręca płaszczyznę polaryzacji światła w prawo, czyli zgodnie z ruchem wskazówek zegara, oznaczona jest znakiem (+) przed liczbą określającą wartość kąta, jeżeli w lewo, znakiem (–). Kierunek skręcania określamy, patrząc w kierunku przeciwnym do kierunku biegu promienia.

3.1.3. Skręcalność właściwa

Wartość kąta skręcania płaszczyzny polaryzacji światła zależy od stężenia badanego roztworu (próbki), długości naczynia, w którym znajduje się badany roztwór (grubości warstwy roztworu, przez które przechodzi światło), długości fali światła oraz od temperatury.

W analizie jakościowej ważny jest fakt, że kąt ten zmierzony w odpowiednich warunkach to wielkość charakterystyczna dla danej substancji. Jeżeli dokona się pomiaru wartości kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji w temperaturze 20°C w świetle linii D sodu (λ = 589,3 nm), można obliczyć wartość wielkości charakteryzującej daną substancję, tzw. skręcalności właściwej, którą wyraża się wzorem:

(3.1)

gdzie:

α – zmierzony kąt skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła przez badaną próbkę, wyrażony w stopniach,

l – grubość warstwy substancji skręcającej (dla substancji stałych wyrażonej w milimetrach, dla ciekłych w decymetrach),

d – gęstość próbki (g ∙ ml–1).

W przypadku roztworów substancji optycznie czynnych wprowadza się do wzoru na skręcalność właściwą wartość stężenia c tych substancji w roztworze i wówczas wzór (3.1) przyjmuje postać:

(3.2)

gdzie:

c – stężenie wyrażone w gramach na 100 ml roztworu,

l – grubość warstwy roztworu w decymetrach.

Jeżeli stężenie wyrażone jest w g ∙ ml–1, a grubość w dm, to jednostką skręcalności właściwej jest: [(º) ∙ ml ∙ g–1 ∙ dm–1] .

Identyfikacja substancji metodą polarymetryczną polega na wyznaczeniu skręcalności właściwej będącej wielkością indywidualną każdej substancji.

Tabela 3.1. Skręcalność właściwa [α]D²⁰ niektórych roztworów

Substancja optycznie czynna

Roztwór

%

Rozpuszczalnik

[α]D²⁰

Cholesterol

2

etanol 90%

–28° do –31°

Kamfora naturalna prawoskrętna

10

etanol 95%

+40° do +42°

Kamfora syntetyczna lewoskrętna

10

etanol 95%

–32,5° do –42,5°

Kwas winowy

10

woda

+12°

Progesteron

2

dioksan

+172° do +182°

Sacharoza

10

woda

+66,25° do +66,75°

Podstawą oznaczenia ilościowego substancji metodą polarymetryczną jest proporcjonalność kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła do stężenia substancji wywołujących to skręcenie. Po przekształceniu wzoru 3.2 otrzymujemy wzór na wartość stężenia badanego roztworu (wyrażonego w gramach na 100 ml roztworu):

c

(3.3)

3.2. Aparatura polarymetryczna

Aparaty służące do pomiaru kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji nazywają się polarymetrami. Polarymetry dzielą się na dwa zasadnicze typy: polarymetry klinowe i kołowe. W laboratoriach analiz diagnostyczno-lekarskich największe zastosowanie znalazły polarymetry kołowe.

Nazwa polarymetrów kołowych pochodzi stąd, że obracane analizatory połączone są z tarczą kołową, zaopatrzoną w skalę kątową.

Zasada działania polarymetrów kołowych polega na obróceniu analizatora o taki kąt, o jaki skręciła płaszczyznę światła spolaryzowanego (uzyskanego w polaryzatorze) substancja optycznie czynna umieszczona między skrzyżowanymi nikolami, aby ponownie uzyskać największe, jednolite zaciemnienie obrazu w okularze. Zaciemnienie to powinno być identyczne z zaciemnieniem widocznym w okularze przed wprowadzeniem do aparatu substancji optycznie czynnej.

Zasadniczą częścią polarymetru są dwa nikole: polaryzator i analizator, pomiędzy którymi jest umieszczona rurka z badaną substancją. Na początku pomiarów ustawia się tzw. zero polarymetru, czyli chodzi o takie położenie obu nikoli,

Rycina 3.7. Schemat budowy polarymetru kołowego.

przy którym następuje maksymalne zaciemnienie pola widzenia. Umieszczenie substancji optycznie czynnej pomiędzy skrzyżowanymi nikolami spowoduje rozjaśnienie pola widzenia w lunetce, a więc światło spolaryzowane po przejściu przez badaną próbkę zmieni kierunek drgań. Aby ponownie otrzymać całkowite zaciemnienie obrazu, wystarczy obrócić analizator o kąt będący kątem skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła przez substancję optycznie czynną.

Rycina 3.8. Schemat polarymetru półcieniowego dwupolowego.

W celu dokładnego ustawienia położenia analizatora względem polaryzatora umieszcza się w polarymetrach dodatkowo jeden (ryc. 3.8) lub dwa (ryc. 3.9) małe nikole, tzw. półpryzmaty lub półcieniowe polaryzatory Lippicha (P₁, P₂), pozwalające na bardziej precyzyjne określenie momentu największego lub najmniejszego zaciemnienia pola widzenia. Wiadomo bowiem, że oko ludzkie niezbyt precyzyjnie określa maksimum lub minimum oświetlenia, a dosyć dobrze pozwala zaobserwować, czy jasności obu sąsiednich pól są jednakowe.

Rycina 3.9. Schemat polarymetru półcieniowego trójpolowego.

Źródłem światła monochromatycznego w polarymetrze jest zwykle lampa sodowa.

Dokładność pomiarów polarymetrycznych zależy od przezroczystości badanego roztworu oraz czystości elementów optycznych w polarymetrze. Należy o tym szczególnie pamiętać podczas oznaczania stężenia cukru metodą polarymetryczną, stosując polarymetry zwane sacharymetrami. Należy także uważać, aby podczas zakręcania rurki polarymetrycznej, zawierającej badany roztwór nie dopuścić do przedostania się bańki powietrza do środka.

3.3. Zastosowanie polarymetrii

Jak wcześniej wspomniano, podstawą oznaczeń metodą polarymetryczną jest proporcjonalność kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji do stężenia substancji wywołującej to skręcenie.

W analityce lekarskiej metoda ta stosowana jest do wyznaczania stężenia glukozy w moczu osób chorych na cukrzycę. W przemyśle cukrowniczym bada się zawartość procentową sacharozy np. w syropach, soku buraczanym itp.

Polarymetria znajduje ponadto zastosowanie w identyfikacji i oznaczaniu wielu środków leczniczych, syntetycznych i naturalnych związków organicznych (alkaloidów, tłuszczów, węglowodanów itd.).

Pomiary polarymetryczne stosuje się także do badania równowag i mechanizmów reakcji, zwłaszcza wśród optycznie czynnych związków organicznych, a także w stereochemii, gdzie zależność skręcalności właściwej od długości fali światła spolaryzowanego (tzw. dyspersja skręcalności optycznej) jest pomocna przy określaniu budowy przestrzennej złożonych związków chemicznych, np. terpenów, białek, sterydów itp.

4 Nefelometria i turbidymetria Anna Błażewicz

4.1. Podstawy teoretyczne

Metoda nefelometryczna (tyndalometryczna) oparta jest na zjawisku rozpraszania światła na cząstkach roztworów mętnych (zjawisko Tyndalla) i pomiarach natężenia światła rozproszonego pod kątem różnym od 180° w stosunku do wiązki padającej (najczęściej pod kątem 45° lub 90°).

Rycina 4.1. Schematyczne porównanie zasady pomiaru nefelometrycznego i turbidymetrycznego; I₀ – natężenie światła padającego, In – natężenie światła rozproszonego, It – natężenie światła przechodzącego.

Ponieważ natężenie światła rozproszonego zależy proporcjonalnie od stężenia cząstek substancji rozpraszającej oraz od wielkości tych cząstek, dlatego pomiary natężenia światła rozproszonego można wykorzystać do oznaczania stężenia roztworu badanej substancji, jak również do określania stopnia dyspersji koloidów.

Jak wiadomo, układy koloidalne są to układy co najmniej dwuskładnikowe o odpowiednim stopniu rozdrobnienia substancji rozpuszczonej (tzw. rozproszenie koloidalne). W układach koloidalnych średnice cząstek fazy rozproszonej są pośrednie między cząsteczkami roztworów rzeczywistych (ok. 10–8–10–7 cm) a zawiesinami (średnice cząsteczek powyżej 10–4 cm) i wahają się w granicach 10–7–10–4 cm. Podstawową cechą układów koloidalnych jest właśnie rozproszenie koloidalne mające charakter pośredni pomiędzy rozproszeniem cząsteczkowym a makroskopowym. Ponadto koloidy odróżnia niejednorodność (heterogeniczność), gdyż każdy koloidalny układ składa się z fazy rozproszonej i rozpraszającej.

Koloidem nie jest sama substancja, ale układ substancji o określonej postaci w odpowiednich warunkach (np. NaCl można przeprowadzić w stan koloidalny w benzenie). Układy koloidalne w naturalnych warunkach przyjmują postać zolu, czyli takiego układu, w którym fazę rozproszoną tworzą cząsteczki ciała stałego, a fazę rozpraszającą stanowi ciecz.

Natężenie promieniowania rozproszonego w warunkach pomiaru nefelometrycznego opisane jest następującym wzorem:

(4.1)

gdzie:

In – natężenie promieniowania rozproszonego,

I₀ – natężenie promieniowania padającego,

N – ogólna liczba cząstek rozpraszających,

v – objętość cząstki,

r – odległość detektora,

F – współczynnik proporcjonalności (zależy od współczynnika załamania światła przez fazę rozproszoną i przez ośrodek rozpraszający),

λ – długość fali promieniowania padającego,

β – kąt między wiązką promieniowania padającego i rozproszonego.

Jeżeli wartość kąta β = 90°, wtedy wzór 4.1 można podać w formie skróconej:

(4.2)

Jeżeli pomiary wykonuje się w tych samych warunkach, można przyjąć wielkości F, v, λ, r i β za stałe i oznaczyć je wspólnym współczynnikiem K. Uwzględniając, że liczba cząsteczek N jest proporcjonalna do szukanego stężenia substancji c, powyższe dwa wzory (4.1 i 4.2) przyjmują postać:

(4.3)

Pomiaru dokonuje się na zasadzie porównania natężenia światła rozproszonego In z natężeniem światła padającego I₀ lub też z natężeniem światła rozproszonego po przejściu przez odpowiedni wzorzec (In, w).

Na wartość natężenia promieniowania rozproszonego mają wpływ warunki otrzymywania zawiesin, m.in. temperatura, pH, skład roztworu, sposób i kolejność dodawania odczynników, czas, jaki upłynął od ich wprowadzenia, stężenie substancji tworzącej koloidalny osad oraz obecność substancji zanieczyszczających.

Przyjmując, że warunki przygotowania badanych roztworów są identyczne, a zależność jest prostoliniowa dla małych zakresów stężeń, można obliczyć stężenie substancji badanej ze wzoru:

(4.4)

gdzie:

In, x – natężenie światła rozproszonego po przejściu przez badaną substancję,

In, w – natężenie światła rozproszonego po przejściu przez substancję wzorcową,

cx – stężenie badanej substancji,

cw – stężenie substancji wzorcowej.

Aby zwiększyć odporność zoli koloidów hydrofobowych (czyli takich układów, w których cząsteczki rozproszone odpychają fazę rozpraszającą – wodę) na działanie elektrolitów, dodaje się najczęściej organiczne koloidy hydrofilowe (cząsteczki fazy rozproszonej mają powinowactwo do fazy rozpraszającej), np. żelatyny lub skrobi, które mają działanie ochronne, przeciwdziałające koagulacji, czyli tworzeniu większych skupisk cząsteczek.

Metoda turbidymetryczna (ryc. 4.1) polega na pomiarze stosunku natężenia promieniowania padającego (I₀) do natężenia promieniowania, które przeszło przez mętny ośrodek (It). Wykorzystane jest tu zjawisko zarówno absorpcji, jak i rozproszenia światła przez ośrodki o wymiarach cząstek powyżej 1 nm.

W turbidymetrii stosowane jest pojęcie turbidancji S (wartość rozproszenia) analogicznie do pojęcia absorbancji w spektrofotometrii absorpcyjnej (rozdz. 5). Turbidancję można wyrazić następującym wzorem:

(4.5)

gdzie:

I₀ – natężenie światła padającego,

It – natężenie światła, które przeszło przez mętny roztwór,

l – grubość warstwy,

c – stężenie roztworu zawiesiny,

d – średnia wartość przekroju cząstek,

λ – długość fali światła padającego,

k – współczynnik zależny od rodzaju zawiesiny i metody pomiaru,

β – współczynnik zależny od metody pomiaru.

W przypadku wykonywania pomiarów w tych samych warunkach, wielkości k, d, l, β są stałe. Przy takim założeniu wzór 4.5 przyjmuje postać:

(4.6)

gdzie:

K – nowy współczynnik zawierający w sobie wartości poprzedniego wzoru.

Powyższy wzór jest analogiczny do wzoru wynikającego z prawa Bauquera–Lamberta–Beera (patrz spektrofotometria absorpcyjna). Podobne są także metody pomiaru, tzn. analogicznie jak w spektrofotometrii absorpcyjnej stosuje się metodę krzywej kalibracyjnej – ustalając zależność między mierzoną turbidancją a stężeniem roztworów mętnych dla serii roztworów wzorcowych (w wąskim zakresie stężeń turbidancja jest proporcjonalna do stężenia roztworów mętnych).

Dla identycznych warunków pomiaru i tak samo przygotowanej zawiesiny i wzorca (jednakowe wartości d, k, λ, l) można zapisać:

(4.7)

gdzie:

Sx – turbidancja badanej próbki,

Sw – turbidancja wzorca,

cx – stężenie próbki,

cw – stężenie wzorca.

4.2. Aparatura w pomiarach nefelometrycznych i turbidymetrycznych

W nefelometrii stosuje się następujące metody pomiarowe:

1. Metodę porównania z serią wzorców.

2. Metodę pomiaru na podstawie zmiany grubości warstwy roztworu.

3. Metodę pomiaru fotometrycznego.

Wszystkie te metody polegają na porównywaniu natężenia światła rozproszonego przez badany ośrodek mętny z natężeniem światła rozproszonego przez ośrodek mętny przyjęty za wzorzec.

Rycina 4.2. Urządzenie (komparator) do nefelometrii wizualnej.

W metodzie porównania z serią wzorców używa się odpowiednich komparatorów, do których wstawia się probówki z roztworami wzorcowymi i roztworem badanym (ryc. 4.2).

Na podstawie jednakowego zmętnienia roztworu wzorcowego i badanego (przygotowanych w odpowiednich warunkach i przy zachowaniu tych samych objętości) stwierdza się, że stężenia tych substancji są jednakowe.

W metodzie uwzględniającej zmiany grubości warstwy roztworu porównuje się natężenie światła rozproszonego dwóch roztworów (wzorcowego i badanego) oglądanych z góry, oświetlonych z tego samego źródła światła pod kątem 90o w stosunku do kierunku obserwacji. Do jednego naczynia wlewa się badany roztwór, a do drugiego, identycznego naczynia dodaje się roztwór wzorcowy do chwili, gdy natężenia światła rozproszonego obu roztworów będą identyczne.

Stężenie roztworu badanego cx oblicza się z zależności:

(4.8)

gdzie:

vx – objętość roztworu badanego,

vw – objętość roztworu wzorcowego.

W metodzie fotometrycznej używa się nefelometru fotoelektrycznego (ryc. 4.3). Wiązka promieniowania wychodząca ze źródła 1 przechodzi przez kondensor 2, filtr 3, przesłonę 4 oraz kuwetę z zawiesiną 5. Rozproszone w kuwecie promieniowanie pada na fotoogniwa 6, a natężenie mierzy się galwanometrem 7.

Pomiary ilościowe metodą turbidymetryczną wykonywane są na wszelkiego rodzaju spektrofotometrach i fotokolorymetrach.

Rycina 4.3. Schemat nefelometru fotoelektrycznego; 1 – źródło promieniowania, 2 – kondensor, 3 – filtr, 4 – przesłona, 5 – kuweta z zawiesiną, 6 – fotoogniwa, 7 – galwanometr.

4.3. Zastosowanie nefelometrii i turbidymetrii

Trudność otrzymania identycznych zawiesin powoduje, że metod nefelometrycznych i turbidymetrycznych nie da się uznać za precyzyjne i są obarczone pewnym błędem. Błąd oznaczenia stężeń na podstawie pomiaru zmętnienia waha się w granicach od 2 do 5%.

Metody turbidymetryczne nadają się do oznaczania zawiesin o dużym stężeniu, podczas gdy nefelometryczne są dokładniejsze przy większym rozcieńczeniu, ponieważ tylko w takich warunkach przyrosty natężenia światła rozproszonego będą proporcjonalne do przyrostów stężenia.

Zastosowanie nefelometrii i turbidymetrii jest znacznie mniejsze w porównaniu ze spektrofotometrią absorpcyjną.

Przykładami zastosowania omówionych metod mogą być: oznaczanie jonów SO₄2– w postaci BaSO₄, oznaczanie chlorków lub jonów srebra w postaci AgCl, oznaczanie siarki w benzynie, wody w rozpuszczalnikach organicznych, jonów Hg²⁺ z użyciem jonów PO₄3–.

Zarówno turbidymetrycznie, jak i nefelometrycznie oznacza się m.in. insulinę, cholesterol, hemoglobinę, kwasy nukleinowe, a także wiele innych związków organicznych (w tym antybiotyki, emulsje, mydła itd.). Metody te znajdują zastosowanie do badania układów naturalnie mętnych, np. wody morskiej, a także w dziedzinie biochemii, farmacji, bakteriologii i enzymologii.