© Copyright by PZWL Wydawnictwo Lekarskie, Warszawa 2020

Wszystkie prawa zastrzeżone.

Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci całości bądź części tej publikacji bez pisemnej zgody wydawcy są zabronione.

Autorzy i Wydawnictwo dołożyli wszelkich starań, aby wybór i dawkowanie leków w tym opracowaniu były zgodne z aktualnymi wskazaniami i praktyką kliniczną. Mimo to, ze względu na stan wiedzy, zmiany regulacji prawnych i nieprzerwany napływ nowych wyników badań dotyczących podstawowych i niepożądanych działań leków, Czytelnik musi brać pod uwagę informacje zawarte w ulotce dołączonej do każdego opakowania, aby nie przeoczyć ewentualnych zmian we wskazaniach i dawkowaniu. Dotyczy to także specjalnych ostrzeżeń i środków ostrożności. Należy o tym pamiętać, zwłaszcza w przypadku nowych lub rzadko stosowanych substancji.

Wydawca: Dorota Kobierzewska

Producent: Marta Kubica

Skład wersji elektronicznej na zlecenie PZWL Wydawnictwo Lekarskie: Michał Latusek

Projekt okładki, stron tytułowych i wnętrza: Lidia Michalak-Mirońska

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2020r. (wyd. I)

Warszawa 2020

ISBN 978-83-200-6234-2

PZWL Wydawnictwo Lekarskie Sp. z o.o.

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 695 43 21

www.pzwl.pl

Księgarnia wysyłkowa:

tel. 42 680 44 88; infolinia: 801 33 33 88

e-mail: wysylkowa@pzwl.pl

Informacje w sprawie współpracy reklamowej: reklama@pwn.pl

Wydawca nie ponosi odpowiedzialności za treść ogłoszeń zamieszczonych przez reklamodawców.

Autorzy

prof. dr hab. n. med. Paweł Krawczyk

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

dr hab. n. med. Kamila Wojas-Krawczyk

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

dr n. med. Izabela Chmielewska

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

dr hab. n. med. Robert Kieszko

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

dr n. med. Anna Grenda

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

dr n. med. Michał Szczyrek

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

dr n. med. Tomasz Jankowski

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

lek. med. Małgorzata Frąk

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

lek. med. Patryk Jasielski

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

dr n. med. Magdalena Wójcik-Superczyńska

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

dr n. med. Katarzyna Reszka

Instytut Genetyki i Immunologii GENIM w Lublinie

mgr Michał Gil

Instytut Genetyki i Immunologii GENIM w Lublinie

dr hab. n. med. Bożena Jarosz

Katedra i Klinika Neurochirurgii i Neurochirurgii Dziecięcej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

dr n. med. Tomasz Kucharczyk

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

prof. dr hab. n. med. Janusz Milanowski

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

Słowo wstępne

Szanowni Państwo,

Oddajemy w Państwa ręce kolejne wydanie „W gabinecie lekarza specjalisty” poświęcone onkologii. Tym razem poruszamy problemy związane ze stosowaniem terapii ukierunkowanych molekularnie u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca (NDRP). To wydanie jest w pewnym stopniu kontynuacją publikacji, która ukazała się w 2019 roku pod redakcją prof. Dariusza M. Kowalskiego. W tamtym zeszycie zostały omówione inhibitory osi EGFR (ang. epidermal growth factor receptor) w leczeniu niedrobnokomórkowego raka płuca. Tym razem opisujemy pozostałe terapie ukierunkowane na inne niż EGFR cele molekularne, w tym przede wszystkim na nieprawidłowe białka szlaków sygnałowych komórek nowotworowych: ALK (ang. anaplastic lymphoma kinase), ROS1, NTRK (ang. neurotrophic receptor tyrosine kinase) i BRAF. Przedstawiamy także metodologię badań molekularnych stosowanych w celu wykrycia nieprawidłowości w genach ALK, ROS1, NTRK, BRAF i innych oraz molekularne przyczyny oporności na terapie ukierunkowane molekularnie. Jak wynika z tego krótkiego opisu, dołożyliśmy wszelkich starań, aby to wydanie „W gabinecie lekarza specjalisty” mogło zainteresować jak najszersze grono specjalistów. Chociaż jest ono dedykowane przede wszystkim onkologom klinicznym, to poruszamy w nim szereg tematów, które mogą zainteresować także genetyków, patomorfologów i pulmonologów.

„W gabinecie lekarza specjalisty” jest wydawnictwem adresowanym do konkretnych lekarzy, którzy mają bardzo szeroką i ugruntowaną wiedzę w swojej dziedzinie. Omówienie problemów dotyczących skuteczności i bezpieczeństwa stosowania inhibitorów ALK i ROS1 wydaje się mieć największą wartość praktyczną dla Czytelników, gdyż terapie te są zarejestrowane i dostępne w Polsce. Specjalistów biorących do ręki to wydanie „W gabinecie lekarza specjalisty” mogą zdziwić rozdziały o terapiach w Polsce nierefundowanych oraz o trudno dostępnych, kosztownych i skomplikowanych metodach diagnostycznych, takich jak sekwencjonowanie nowej generacji (ang. next generation sequencing – NGS). Wydaje się, że te informacje nie mają większej wartości praktycznej. W mojej opinii nie jest to jednak prawda. Po pierwsze niektóre z omówionych terapii są zarejestrowane w krajach Unii Europejskiej, ale nie zostały refundowane w Polsce (np. inhibitory BRAF, MEK i NTRK). W przypadku wykrycia takich nieprawidłowości genetycznych polscy chorzy na NDRP mogą liczyć na dostęp do tych nowoczesnych metod leczenia dzięki programom ratunkowego dostępu do technologii medycznych (RDTL). Po drugie większość dobrych ośrodków onkologicznych i pulmonologicznych prowadzi badania kliniczne z nowymi cząsteczkami (np. inhibitory KRAS, NTRK, MET i inne). Udział w takich badaniach daje predysponowanym genetycznie chorym na NDRP szansę na długotrwałą remisję. Po trzecie technologia NGS wcale nie jest tak niedostępna, jak mogłoby się wydawać. Kilka polskich laboratoriów zaczyna już rutynowo wykonywać badania NGS u wybranych chorych, co umożliwia równoczesne wykrycie u nich różnych nieprawidłowości genetycznych w komórkach nowotworowych i kwalifikację do terapii w ramach programów lekowych, RDTL lub badań klinicznych. Wielu polskich chorych decyduje się na komercyjne wykonanie badania NGS, najczęściej w zagranicznych laboratoriach genetycznych. Polscy specjaliści onkologii, pulmonologii czy genetyki klinicznej stają przed problemem interpretacji wyników NGS i konsultacji chorych pod kątem dostępności terapii w Polsce, ale także w krajach sąsiednich.

To krótkie wprowadzenie uzmysławia, jak ważny i interdyscyplinarny jest problem onkologicznych terapii ukierunkowanych molekularnie, opisanych w tym wydaniu „W gabinecie lekarza specjalisty”. Mam nadzieję, że Czytelnicy znajdą dla siebie, wśród tej różnorodności artykułów, informacje przydatne w rutynowej praktyce lekarskiej. Miłej lektury.

Prof. dr hab. n. med. Paweł Krawczyk

Sekwencjonowania nowej generacji (NGS) w kwalifikacji do terapii ukierunkowanych molekularnie i immunoterapii u chorych na nowotwory
Dr n. med. Anna Grenda

Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

WPROWADZENIE

Sekwencjonowanie nowej generacji (ang. next generation sequencing – NGS) jest zaawansowaną techniką badawczo-diagnostyczną. Jej rozwój przyczynił się do sytuacji klinicznej, w której możemy uzyskać bardzo dużą ilość informacji na temat zmian genetycznych w komórkach nowotworowych, których obecność może umożliwić zastosowanie terapii spersonalizowanych u chorych onkologicznych. Sekwencjonowanie Sangera (inaczej sekwencjonowanie bezpośrednie), nazywane obecnie sekwencjonowaniem pierwszej generacji, umożliwia odczyt sekwencji nukleotydowej pojedynczego fragmentu genu, co przed erą NGS było zaawansowaną techniką o dość dużej rozdzielczości. Jednak do przeprowadzenia wiarygodnego badania sekwencjonowania bezpośredniego wymagany jest wysoki odsetek komórek nowotworowych (≥ 50%), aby wykrytą zmianę genetyczną można było zakwalifikować jako prawdziwie pozytywną. Ponadto analiza w sekwencjonowaniu metodą Sangera ogranicza się do wybranych odcinków genów, co może być niewystarczające w diagnostyce chorób nowotworowych z udowodnionym występowaniem wielu różnych zmian genetycznych w różnych odcinkach całego genomu. Między innymi z tego względu opracowywano technologię umożliwiającą jednoczasowe (w jednym badaniu, „w jednej probówce”) poszukiwanie wszystkich zmian genetycznych w szerokich obszarach genomu, których obecność uprawnia do wdrożenia nowoczesnych terapii personalizowanych u chorych onkologicznych.

Terapie ukierunkowane molekularnie (ang. molecularly targeted therapies) mają udowodnioną skuteczność w przedłużaniu życia chorych na nowotwory, poprawy jego jakości, przy jednoczesnym minimalizowaniu drastycznych efektów ubocznych, jakie są związane ze stosowaniem chemioterapii. Terapie ukierunkowane molekularnie są skuteczne tylko u chorych, u których w komórkach nowotworowych doszło do istotnych zaburzeń genetycznych, najczęściej mutacji (ang. driver mutations) lub rearanżacji genowych. Te nieprawidłowości powodują powstanie nadmiernie aktywnych receptorów komórek nowotworowych lub wewnątrzkomórkowych białek sygnałowych. Najczęściej dochodzi do spontanicznej nadaktywności enzymu kinazy tyrozynowej w wewnątrzkomórkowej części receptorów powierzchniowych. Zastosowanie inhibitorów kinaz tyrozynowych (IKT) u chorych z mutacjami lub rearanżacjami w genach kodujących receptory powierzchniowe (domenę kinazy tyrozynowej) zrewolucjonizowało możliwości terapeutyczne u chorych na nowotwory, zwłaszcza u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca (NDRP).

Na bazie pojęcia „targeted treatment” pojawił się termin „targeted sequencing”, określający badanie zmian genetycznych techniką NGS, ukierunkowane na wybrane geny czy ich fragmenty, których sekwencję można odczytać jednoczasowo z dużą czułością i specyficznością przy minimalnej ilości dostępnego materiału do badania. Przy zastosowaniu techniki NGS możemy sekwencjonować cały genom (ang. whole genome sequencing – WGS), tylko sekwencje kodujące, czyli eksom (ang. whole exome sequencing – WES) lub, jak już wspomniano wcześniej, tylko wybrane geny lub ich fragmenty (NGS typu Hot Spot, targeted sequencing) (tab. 1). Niemniej jednak przeprowadzenie tego badania oparte jest na pewnych, niezmiennych etapach (ryc. 1). Ważne jest też, jaką technologią sekwencjonowania dysponuje laboratorium. Obecnie dwie najważniejsze platformy mają zastosowanie w onkologii klinicznej: Illumina oraz Ion Torrent. Systemy Illumina są oparte na fluorescencyjnym systemie detekcji pojedynczych nukleotydów, natomiast technologia Ion Torrent – na pomiarze pH, które zmienia się przy włączaniu kolejnych nukleotydów do nici DNA podczas sekwencjonowania.

MATERIAŁ DO BADANIA NGS

Podstawowym materiałem do badania w technice NGS są tkanki nowotworowe lub komórki zatopione i utrwalone w parafinie (ang. formalin-fixed, paraffin-embedded – FFPE). Wykorzystanie materiałów FFPE niesie ze sobą pewne wyzwania dotyczące jakości wyizolowanych kwasów nukleinowych (DNA i RNA). Od ich jakości uzależnione jest pomyślne sekwencjonowanie i uzyskanie wiarygodnych wyników. Pobrany materiał z guza nowotworowego w rutynowej praktyce patomorfologicznej jest prawie zawsze utrwalany w formalinie w celu wykonania barwienia H & E (hematoksylina i eozyna) oraz testów immunohistochemicznych. Materiały FFPE nie są zatem wykonywane z ukierunkowaniem na wykorzystanie ich do NGS, czego osoby wykonujące to badanie oraz przeprowadzające analizę danych uzyskanych z sekwencjonowania muszą być świadome. Tradycyjne utrwalanie tkanek w formalinie indukuje wewnątrz- i międzycząsteczkowe połączenia w kwasach nukleinowych poprzez tworzenie zasad Schiffa oraz poprzez grupy metylowe reagujące z pierwszorzędowymi grupami aminowymi lub tiolowymi [1]. Ten nieco skomplikowany opis chemiczny oznacza, że przez tradycyjne utrwalanie tkanek w formalinie pojawiają się trudności w wydajnej izolacji i skutecznym sekwencjonowaniu ekstrahowanego DNA. Formalina, szczególnie gdy jest kwaśna i niebuforowana, indukuje również fragmentację DNA, co obniża jakość sekwencjonowania. Proces utrwalania w formalinie może prowadzić do chemicznego i mechanicznego uszkodzenia kwasów nukleinowych, co leży u źródła obserwowanych artefaktów w analizowanych sekwencjach. Oznacza to, że w materiałach takich można zaobserwować wzrost liczby substytucji cytozyny na tyminę i guaniny na adeninę (m.in. poprzez deaminację cytozyny do uracylu), które najczęściej obserwowane są przy niskich poziomach częstotliwości alleli < 10% [1]. Utrwalanie w formalinie może być również przyczyną powstawania luk w DNA, czyli miejsc pozbawionych zasad [2]. Kofanova i wsp. wskazują, że faza preanalityczna, czyli utrwalanie materiałów tkankowych, jest kluczowa dla otrzymania wiarygodnych wyników sekwencjonowania. Porównali oni metodę utrwalania w formalinie oraz w perfluoropolieterze (PFPE) i okazało się, że liczba odczytów sekwencji była większa w przypadku utrwalacza PFPE [1].

tc-DNA (ang. tumor, circulating DNA) – wolnokrążące, nowotworowe DNA; cDNA (ang. complementary DNA) – DNA przepisane z sekwencji RNA; FASTQ, UBAM, BAM – bioinformatyczny zapis sekwencji nukleotydowej, odczytanej podczas sekwencjonowania; Alignment – bioinformatyczne wyrównywanie sekwencji odczytanych podczas sekwencjonowania; SNV (ang. single nucleotide variant) – zmiana pojedynczego nukleotydu; INDEL – zmiany genetyczne typu insercja/delecja; CNV (ang. copy number variation) – zmiana liczby kopii genu; VCF (ang. variant caller file) – pliki ze zidentyfikowanymi wariantami genetycznymi

RYCINA 1.

NGS – od próbki materiału z guza lub krwi obwodowej do leczenia personalizowanego

Na jakość sekwencjonowania oprócz utrwalacza mają wpływ warunki i czas przechowywania oraz metoda ekstrakcji kwasów nukleinowych. Wybór ostatniej z wymienionych jest elementem walidacji laboratoryjnej. Izolacja może być oparta na metodzie kolumienkowej lub metodzie wykorzystującej kulki magnetyczne, jednak niezależnie od jej wyboru, musi ona zapewniać jak największy odzysk kwasów nukleinowych z materiału oraz uniknięcie ich fragmentacji [3].

Materiałem do sekwencjonowania może być również wolnokrążące nowotworowe DNA (ang. tumor, circulating-DNA – tc-DNA). Uzyskuje się je metodą płynnej biopsji (ang. liquid biopsy) z surowicy lub z osocza krwi obwodowej chorego. Jest go stosunkowo mało w porównaniu do DNA „zdrowego”, jednak metodą NGS możemy wychwycić mutacje nawet w tak ograniczonej ilości materiału, jakim jest tc-DNA. tc-DNA w surowicy lub osoczu jest łatwo dostępne oraz nieprzetworzone chemicznie, tak jak w przypadku materiałów FFPE. Lai i wsp. przeprowadzili ocenę przydatności tc-DNA do badania NGS w celu wykrycia różnych nieprawidłowości genetycznych u chorych na raka płuca [4]. Do badania włączono 101 chorych. Pobrali oni próbki krwi obwodowej i wyizolowali tc-DNA. Stwierdzili 31 przypadków z 40 różnymi nieprawidłowościami genetycznymi, a EGFR (ang. epidermal growth factor receptor) był najczęściej zmutowanym genem (27,72%). Ponadto u 7 chorych wykryto 2, a u 1 chorego 3 współistniejące mutacje w genie EGFR, przy czym przeważnie z częstymi mutacjami tego genu współistniała mutacja p.Thr790Met [4]. Badanie tc-DNA jest cennym narzędziem z punktu widzenia klinicysty, który może zdecydować o wdrożeniu lub zmianie leczenia ukierunkowanego molekularnie bez konieczności przeprowadzania inwazyjnych zabiegów pobrania tkanki nowotworowej, a sekwencjonowanie umożliwia jednoczesne zbadanie wielu genów.

W analizie tc-DNA metodą NGS istotne jest, czy mutacje somatyczne wykryte w tym materiale odzwierciedlają te występujące w guzie. Maron i wsp. przeprowadzili badanie tc-DNA u chorych na gruczolakoraka połączenia żołądkowo-przełykowego [5]. Wykonali oni 2140 testów u 1630 chorych. Porównanie wykrytych mutacji w tc-DNA oraz odpowiadających im tkanek nowotworowych wykazało podobny, ale nieidentyczny ich rozkład. Zauważono większą liczbę wykrytych mutacji w tc-DNA w porównaniu z guzem nowotworowym. Analiza tc-DNA potwierdziła także występowanie u niektórych chorych niestabilności mikrosatelitarnej (ang. microsatellite instability – MSI), co pozwoliło na ich kwalifikację do immunoterapii [5–7]. tc-DNA wywodzi się z DNA rozpadających się komórek nowotworowych, dlatego reprezentuje materiał genetyczny ze wszystkich fragmentów guza, a nie tylko z jego wycinków analizowanych w materiałach FFPE. W przypadku heterogennych guzów nowotworowych tc-DNA odzwierciedla zatem całe molekularne tło rozwoju nowotworu. Rodzi to jednak problem wykrywania unikalnych zmian genetycznych w rzadkich klonach komórek nowotworowych.

Techniką NGS mamy możliwość oceny statusu mutacyjnego w guzie i w wolnokrążącym DNA, a do przeprowadzenia badania wymagana jest niewielka ilość materiału (jednak dobrej jakości i niezdegradowanego). Jest to niewątpliwa zaleta tej metody w porównaniu ze „standardowymi” testami molekularnymi. Większość testów NGS wymaga zaledwie 10 ng DNA oraz obecności 1% komórek nowotworowych, podczas gdy inne testy wykorzystywane w diagnostyce onkologicznej (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, immunohistochemia) wymagają materiału FFPE, ściętego na specjalne szkiełka w wielu powtórzeniach [8, 9]. Należy jednak podkreślić, że metoda IHC (ang. immunohistochemistry) nie jest testem genetycznym, a techniką pozwalającą na ocenę ekspresji białek, m.in. nieprawidłowych białek ALK (ang. anaplastic lymphoma kinase) czy ROS1 na komórkach nowotworowych.