Projekt okładki i stron tytułowych Lidia Michalak

Zdjęcie na okładce: berya113/123RF

Wydawca: Katarzyna Włodarczyk-Gil

Koordynator ds. redakcji: Renata Ziółkowska

Redakcja i korekta: Mieczysława Kompanowska

Produkcja: Mariola Grzywacka

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwa Naukowego PWN

Weronika Panecka / Woblink

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 2020

ISBN 978-83-01-20979-7

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2020 r., (wyd. I)

Warszawa 2020

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

1

Krótka historia mikrobiologii przemysłowej

1.1. Wprowadzenie

Początki mikrobiologii przemysłowej sięgają ponad 200 lat wstecz. W tym czasie następował rozwój tej dziedziny – od tajemniczych koncepcji po racjonalną naukę i technologię, z ogromnymi osiągnięciami społecznymi i medycznymi oraz wpływem komercyjnym. Mikrobiologia przemysłowa to komercyjna eksploatacja mikroorganizmów celem uzyskania różnych, ważnych dla człowieka produktów. Produkty mikrobiologiczne mają bezpośredni lub pośredni wpływ na wskaźniki ekonomiczne, środowiskowe oraz socjalne w społeczeństwach. Już od zarania cywilizacji mikroorganizmy wykorzystywano w produkcji przemysłowej wyrobów alkoholowych oraz przetworów mlecznych. Pierwsze badania dotyczące roli mikroorganizmów w procesach fermentacji prowadził Ludwik Pasteur w latach pięćdziesiątych XIX w. Badania te przyczyniły się do rozwoju metod pozyskiwania czystych szczepów i wykorzystywania ich do prowadzenia fermentacji.

W latach 30. ubiegłego wieku przypadkowe odkrycie penicyliny przez Alexandra Fleminga spowodowało wzrost znaczenia mikrobiologii przemysłowej w oczach ludzkości. Związek istotnych przemysłowo metabolitów z mikroorganizmami zrewolucjonizował przemysł do poszukiwania nowych mikroorganizmów, które produkują różnego rodzaju antybiotyki, enzymy, substancje antyrakowe itp. W związku z rozwojem biochemii, techniki ich izolacji i oczyszczania znacznie podniosły jakość pożądanych metabolitów. Lata 70. ubiegłego wieku to początek ery klonowania genów, które, jak się okazuje, jest bardzo ważne w pozyskiwaniu ulepszonych szczepów produkcyjnych. Techniki takie jak bezpośrednia mutageneza genomowego DNA, umożliwiają permanentne zmiany w genomach szczepów przemysłowych. Połączenie mikrobiologii, inżynierii biochemicznej i biologii molekularnej dało podstawy biotechnologii – nowej dyscyplinie naukowej, która kontynuuje zdobycze tych poprzednich. Dywersyfikacja powstała poprzez tworzenie subdyscyplin, takich jak genomika, transkryptomika, proteomika, analiza strumienia metabolicznego z analizą ilościową złożonych metabolitów, a inżynieria biochemiczna połączyła się w inżynierię biosystemów. W ostatniej dekadzie nastąpiło ponowne zrewolucjonizowanie mikrobiologii przemysłowej dzięki zastosowaniu systemu macierzy oraz bioinformatyki.

1.2. Ery rozwoju mikrobiologii przemysłowej

Częściowo kryterium podziału mikrobiologii przemysłowej na ery rozwoju są produkty, które pojawiały się w danym czasie, zwykle po raz pierwszy. Na ogół nowa fermentacja lub jej produkt nie pojawiały się od razu w doskonałej formie, lecz wymagały dalszych prac badawczych i rozwojowych. W zasadzie większość fermentacji przemysłowych jest wciąż udoskonalana, poszukuje się wciąż nowych szczepów, poddaje procesom ulepszania za pomocą różnych narzędzi biologii molekularnej, atrakcyjnych z biotechnologicznego punktu widzenia.

1.2.1. Era przedpasteurowska (przed 1865 r.)

Przed odkryciem Pasteura metodą fermentacji produkowano wyroby alkoholowe (piwo, wino), nabiał (sery, jogurt) oraz takie wyroby, jak ocet winny, nie znając ich mechanizmu. Produkcja wina, piwa i chleba była znana już u Sumerów 6000 lat temu, a w takich krajach jak Mezopotamia i Egipt stała się głównym źródłem dochodów podatkowych. Fermentację soi w Chinach prowadzono już 3500 lat przed naszą erą. Nawet obserwacje mikroskopowe „małych zwierzątek” prowadzone przez Leeuwenhoeka (lata 60. XIX w.) nie były kojarzone z faktem, że przyczyną fermentacji są mikroorganizmy. Dopiero w latach 1837–1848 Schwann i Latour niezależnie wykazali obecność drożdży w procesie fermentacji. Z ich obserwacji wynikało, że drożdże piwne są małymi kulistymi organizmami, zdolnymi do reprodukcji, ale nie stwierdzili, czy drożdże prowadzą proces fermentacji. Krążyły równolegle dwie teorie, że fermentacja wciąż jest konsekwencją „tajnej siły życiowej” albo procesem prowadzonym przez „siły chemiczne”.

1.2.2. Era Pasteura (lata 1850–1890)

Ludwik Pasteur ostatecznie odkrył tajemnicę fermentacji. W latach 50. XIX w. codziennie odwiedzał on fabrykę produkującą alkohol i pobierał próbki płynu fermentacyjnego do analizy w swoim laboratorium. W próbkach z produkcji alkoholu znajdował drożdże pączkujące, a w próbkach pobranych z fermentacji kwaśnej (zepsute wino) laseczki fermentujące, które produkowały kwas mlekowy, nadający nieprzyjemny smak wina. Pasteur szczegółowo zbadał fermentację kwasu mlekowego i opracował podstawy procesów fermentacyjnych oraz metody izolacji pojedynczych mikroorganizmów z hodowli w postaci czystych szczepów. W dyskusji wyników swoich badań Pasteur opisał:

1) biologiczną koncepcję fermentacji jako wynik aktywności żywych mikroorganizmów;

2) zasady szczepienia mikroorganizmami w celu rozpoczęcia niezawodnej fermentacji, która była również powszechną praktyką w fermentacji piwa;

3) pojęcie swoistości, zgodnie z którym każdą fermentację można przypisać do określonego mikroorganizmu;

4) niezbędne czynniki, które muszą być dostarczone mikroorganizmom w pożywce fermentacyjnej;

5) specyficzne cechy chemiczne charakteryzujące główne produkty fermentacji.

W ten sposób Pasteur położył podwaliny pod nową dyscyplinę naukową, mikrobiologię, zwaną wówczas bakteriologią. Od tego czasu (koniec XIX w.) przemysł fermentacyjny szybko się rozwijał. Obejmował produkcję piwa i wina, alkoholu przemysłowego, drożdży, kwasu octowego i mlekowego, sera, sosu sojowego i sake. Produkcja piwa stanowiła jedną z najważniejszych działalności gospodarczych. Od tej pory także produkcja wina nabrała dużego znaczenia ekonomicznego, gdyż było ono smaczne, wolne od nadmiaru kwasu octowego i mlekowego. Rozpoczęła się fala powstawania fundacji i instytutów badawczych, głównie rządowych, zajmujących się badaniami nad produkcją piwa, wina i żywności, wody, a także higieną i opieką medyczną, oraz laboratoriów w przemyśle piwowarskim i piekarniczym, w Europie (Monachium, Berlin, Hohenhein, Paryż, Birmingham, Kopenhaga) oraz w USA (Uniwersytety: MIT, Cornell i Wisconsin).

1.2.3. Era rozwoju biochemii i nowych produktów (lata 1890–1940)

W tym czasie opracowano nowe technologie fermentacji przemysłowej produkcji etanolu, butanolu, acetonu i glicerolu, a także kilku kwasów organicznych: octowego, cytrynowego oraz mlekowego. Miały też miejsce badania struktury przestrzennej związków chemicznych, takich jak białka, cukry i tłuszcze, oraz badania dotyczące enzymów. I tak stwierdzono, że ekstrakt drożdżowy powstały na skutek dezintegracji komórek drożdży prowadzi proces fermentacji alkoholowej, w wyniku którego powstaje alkohol i ditlenek węgla. A ściślej, że proces ten prowadzą enzymy uwolnione z komórek. Odkrycie fermentacji wolnej od komórek, w okresie do 1930 r., stymulowało molekularne podejście do badania procesu fermentacji alkoholowej, głównie badań nad kolejnymi półproduktami metabolizmu. Wynikiem tych badań były opracowane ścieżki przebiegu procesu glikolizy prowadzonej przez różne mikroorganizmy, w tym wykrycie produktów pośrednich, takich jak kwasy: pirogronowy, octowy, bursztynowy. W tym czasie również pracowano nad innymi rodzajami fermentacji z produkcją acetonu i wyższych alkoholi, w tym butanolu, który po przekształceniu w butadien i jego polimeryzacji tworzył kauczuk syntetyczny. W okresie I wojny światowej proces fermentacji „aceton-butanol” wykorzystano do produkcji materiałów wybuchowych przy użyciu mikroorganizmów oraz surowców naturalnych (kukurydzy) jako podłoża fermentacyjnego. W czasie I wojny światowej produkowano duże ilości acetonu (w Anglii oraz Kanadzie) oraz glicerolu (w Niemczech). Równolegle podjęto prace nad mikrobiologiczną produkcją kwasów szczawiowego i cytrynowego przez gatunki Penicillium sp. i Aspergillus niger. Kolejnymi produktami wytwarzanymi na drodze fermentacji były kwas glukonowy i kwas mlekowy. Innym ważnym przykładem przemysłowej działalności badawczej było opracowanie technologii utleniania sorbitolu przez szczep Acetobacter jako związku pośredniego do produkcji witaminy C. Z kolei w latach 30. XX w. rozpoczęto wytwarzanie środka farmaceutycznego – L-efedryny –metodą fermentacji cukru przez drożdże w obecności benzaldehydu. Etanol nadal stanowił główny produkt o wyjątkowym znaczeniu gospodarczym.

Równolegle rozwijała się technologia enzymatyczna. Wiele enzymów, w tym diastazę (enzym amylolityczny), proteazy i pektynazy, wyizolowano z różnych organizmów do zastosowań komercyjnych, głównie z Bacillus subtilis oraz Aspergillus oryzae i Aspergillus niger. Już w 1894 r. Takamine uzyskał patent na produkcję preparatu enzymatycznego takadiastazy stosowanego do produkcji amylazy używanej do hydrolizy skrobi w produkcji żywności.

Przypadkowe wydarzenie w londyńskim laboratorium w 1928 r. zmieniło bieg medycyny. Alexander Fleming, bakteriolog ze szpitala St. Mary’s, po powrocie z wakacji, podczas rozmowy z kolegą zauważył na płytce agarowej strefę wokół inwazji grzyba, w której bakterie nie rosły. Stwierdził on, że grzyb Penicillium notatum hamuje rozwój chorobotwórczej bakterii Staphylococcus aureus. Wykazał, że substancja antybakteryjna powstaje w hodowli Penicillium i nazwał ją penicyliną. Stwierdził, że penicylina ma działanie antybakteryjne wobec gronkowca i innych patogenów Gram-dodatnich. Fleming opublikował swoje odkrycia w 1929 r. Oczyszczenie niestabilnego związku z ekstraktu grzyba okazało się jednak poza jego możliwościami. Przez dekadę nie poczyniono postępów w wyodrębnianiu penicyliny jako związku leczniczego. W tym czasie Fleming wysyłał swoją pleśń Penicillium każdemu, kto o nią poprosił, w nadziei, że ktoś może wyizolować z hodowli penicylinę do użytku klinicznego.

1.2.4. Era antybiotyków (lata 1940–1960)

W tym okresie opracowano i wdrożono w skali przemysłowej produkcję antybiotyków, w tym penicyliny i streptomycyny, oraz opracowano warunki transformacji i prowadzono transformacje steroidów przy udziale mikroorganizmów (kortyzonu, testosteronu, estrogenu).

Na Uniwersytecie w Oxfordzie, Ernst Chain znalazł artykuł Fleminga z 1929 r. na temat penicyliny i zaproponował swojemu przełożonemu, Howardowi Floreyowi, że spróbuje wyizolować penicylinę. Poprzednik Floreya, George Dreyer, napisał do Fleminga wcześniej list z prośbą o przesłanie próbki szczepu Penicillium, W 1939 r. Howard Florey zebrał zespół, w tym eksperta od grzybów, Normana Heatleya, który pracował nad hodowlą Penicillium spp. i Ernsta Chaina, który z powodzeniem oczyszczał penicylinę z ekstraktu. Florey nadzorował eksperymenty na zwierzętach. 25 maja 1939 r. grupa badaczy wstrzyknęła ośmiu myszom zjadliwy szczep Streptococcus pyogenes, a następnie czterem z nich penicylinę; pozostałe cztery myszy, którym nie wstrzyknięto penicyliny, trzymano jako kontrole. Wczesnym rankiem wszystkie myszy kontrolne były martwe, a wszystkie leczone – wciąż żyły. Chain nazwał wyniki „cudem”. Naukowcy opublikowali swoje odkrycia w „The Lancet” w sierpniu 1940 r., opisując wytwarzanie, oczyszczanie i eksperymentalne stosowanie penicyliny, która ma wystarczającą siłę działania, aby chronić zwierzęta zakażone przez Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus i Clostridium septique. Zespół z Oksfordu opublikował następnie wyniki swoich badań klinicznych w 1941 r. W tym czasie firmy farmaceutyczne w Wielkiej Brytanii nie były w stanie produkować masowo penicyliny ze względu na zobowiązania w II wojnie światowej. Florey w tej sytuacji zwrócił się do rządu Stanów Zjednoczonych o pomoc finansową. Władze Northern Regional Research Laboratory (NRRL) w Peoria, Illinois, USA wyraziły chęć finansowania przedsięwzięcia. Florey i Heatley dotarli do Peoria w stanie Illinois, aby spotkać się z Charlesem Thomem, głównym mikologiem amerykańskiego Departamentu Rolnictwa i Andrew Jacksonem Moyerem, dyrektorem północnego laboratorium badawczego Departamentu. Thom także rozpoznał rzadkość szczepu Penicilium notatum, ponieważ miał jeszcze tylko jeden inny szczep w swojej kolekcji 1000 szczepów Penicillium, który wytwarzał penicylinę. Od połowy 1941 r. wznowiono prace badawcze dotyczące penicyliny także w kilku innych ośrodkach naukowych, począwszy od poszukiwania szczepów, w tym zmutowanych, poprzez prowadzenie fermentacji i ekstrakcji produktu aż po suszenie i pakowanie preparatu. Wydajność syntezy penicyliny wzrosła z 3 (grupa Oksfordzka) do 24 j./ml. Wynikami tych prac zainteresował się Departament Rolnictwa USA oraz National Research Council i cztery firmy – Merck, Squibb, Pfizer i Lererle, a potem kilka następnych. Niesamowite właściwości lecznicze penicyliny stały się faktem, a zapotrzebowanie na nią było ogromne, ale głównym celem było wyprodukowanie takiej ilości jednostek penicyliny, aby możliwe było pokrycie zapotrzebowania na okres działań armii amerykańskiej w Europie wiosną 1944 r. Dalsze poszukiwania szczepów wysoko produktywnych przyniosły oczekiwane wyniki. Badanie przesiewowe i rozwój techniki w tym techniki mutacji, okazały się kluczowym czynnikiem sukcesu. Z wielu źródeł, w tym próbek gleby z całego świata, zebranych przez armię amerykańską, wyizolowano wiele setek szczepów producentów penicyliny. Najlepszym producentem penicyliny (oznaczonym jako NRRL 1951) było Penicillium chrysogenum izolowane ze spleśniałego melona kantalupa z rynku owoców Peoria, który po ulepszeniach produkował do 100 j./ml hodowli. Kolejny szczep z Wisconsin produkował już 1500 j./ml. Heatley pozostał w Peorii przez 6 miesięcy, aby pracować nad metodami hodowli szczepów Penicillium w skali przemysłowej. Florey udał się na wschód, by zainteresować rząd USA i firmy farmaceutyczne produkcją penicyliny. Bezprecedensowa współpraca Stanów Zjednoczonych i Wielkiej Brytanii w zakresie produkcji penicyliny była niezwykle udana. W 1941 r. Stany Zjednoczone nie miały wystarczającej ilości penicyliny do leczenia jednego pacjenta. Pod koniec 1942 r. dostępna była wystarczająca ilość penicyliny do leczenia mniej niż 100 pacjentów. Jednak do września 1943 r. zapasy były wystarczające, by zaspokoić potrzeby sił zbrojnych aliantów. Wszystkie te eksperymenty prowadzono w hodowlach powierzchniowych (na podłożu zestalonym agarem). Znacznie lepsze wydajności penicyliny (około 140 000 razy) uzyskano w hodowlach płynnych (zanurzeniowych/głębinowych) z zastosowaniem namoku kukurydzianego, co sprawiło że wydajność penicyliny rosła wykładniczo, a głównym problemem była ekstrakcja i oczyszczanie penicyliny w układach ciecz–ciecz, a następnie liofilizacja i krystalizacja. Penicylina stała się własnością publiczną oraz wielkim biznesem.

Bardzo pozytywne skutki leczenia zakażeń bakteryjnych z zastosowaniem penicyliny doprowadziły do przyznania Flemingowi, Chainowi i Floreyowi Nagrody Nobla w dziedzinie medycyny i fizjologii w 1945 r. Penicylinę izolowano także z innych mikroorganizmów, co doprowadziło do powstania nowego terminu, antybiotyków. W latach 1940 i 1950 wyodrębniono streptomycynę, chloramfenikol, erytromycynę, wankomycynę i wiele innych.

Na tym etapie rozwijała się szeroko zakrojona mikrobiologiczna produkcja nie tylko tradycyjnych towarów, np. piwa, alkoholu, sera, ale także nowych produktów, w tym kwasu cytrynowego i farmaceutyków o szczególnie dużym znaczeniu społecznym i ekonomicznym. Znaczenie ekonomiczne wzrosło w szczególności dzięki sukcesowi produkcji penicyliny. Kolejne antybiotyki, takie jak streptomycyna, stały się ogólnodostępne, a także pojawiła się nowa klasa produktów o wysokiej wartości, głównie metabolitów wtórnych, np. steroidów uzyskanych metodą biotransformacji.

1.2.5. Era postantybiotykowa (lata 1960–1975)

W tym okresie pojawiły się inne ważne produkty fermentacji mikroorganizmów, o rosnącym znaczeniu rynkowym – aminokwasy (L-glutamina, L-lizyna), węglowodany i ich pochodne (hydrolizaty, izomery), witaminy, rozpuszczalniki i enzymy do nowych zastosowań. Nowa generacja biokatalizatorów, opierająca się na technikach immobilizacji enzymów, doprowadziła do przełomu w przetwórstwie żywności i związków farmaceutycznych. Produkcja na wielką skalę została uruchomiona, dzięki użyciu biokatalizatorów do hydrolizy penicyliny (do syntezy półsyntetycznych antybiotyków β-laktamowych) i izomeryzacji glukozy.

Od połowy lat siedemdziesiątych, w związku z kryzysem naftowym oraz świadomością, że zasoby naturalne się kurczą, powstały w agendach rządowych krajów rozwiniętych (Niemcy, Wielka Brytania, Japonia, USA i inne) koncepcje innowacyjnego potencjału i wzrostu gospodarczego oraz większego znaczenia zasobów surowców odnawialnych w przyszłości. W 1974 r. niemiecka organizacja chemiczna Dechema opracowała entuzjastyczny raport dla Niemieckiego Ministerstwa Edukacji i Nauki (Bundesministerium für Bildung und Wissenschaft). Było to pierwsze systematyczne opracowanie finansowania strategii badawczo-rozwojowej, zachęcające do innowacji w przemyśle. Podobne strategie powstały także w Wielkiej Brytanii, Japonii i Francji. W prace badawczo-rozwojowe najbardziej zaangażowano mikrobiologię, biologię komórki, biochemię oraz – w ograniczonym zakresie – biologię molekularną, genetykę i inżynierię chemiczną. Pojawiły się także w tych latach podręczniki do mikrobiologii stosowanej (jeszcze nie w sensie biotechnologii), a także do inżynierii biochemicznej. Pierwsze encyklopedie i serie na temat biotechnologii pod redakcją Rehma and Reeda zostały wydane przez Wiley-VCH Verlag, a pod redakcją Flickingera i Drew’a przez John Wiley & Sons Inc.

Tak więc pojawiła się nowa dyscyplina naukowa – biotechnologia – integrująca badania gospodarki innowacyjnej. Pierwsze dyplomy magisterskie i inżynieryjne z zakresu inżynierii biochemicznej były przyznawane absolwentom University College London już w 1960 r., a kolejne w 1970 r. na Politechnice w Berlinie (Technical University of Berlin). Pojawiły się pierwsze czasopisma naukowe z tej dziedziny: „Journal of Microbiological & Biochemical Engineering” (1958), w następnych latach „Biotechnology & Bioengineering”, „Applied Microbiology” zmieniony na „Environmental & Applied Microbiology” oraz „Applied Microbiology & Biotechnology”.

1.2.6. Era nowej biotechnologii (po 1975 r.)

Po 1975 r. nastąpiła era technologii związanych z rekombinacjami DNA oraz pojawienie się pierwszych produktów marketowych (szczepionki, insulina). Wdrożenia aplikacyjne z zakresu biotechnologii przedstawiono w tabeli 1.1.

Pierwszym przełomem tej ery było ustanowienie modelu struktury molekularnej DNA przez Jima Watsona i Francisa Cricka na podstawie danych krystalograficznych Rosalindy Franklin, która w 1953 r. pracowała w laboratorium Morrisa Wilkinsa. Kolejne sukcesy − badania struktury molekularnej, złożonych struktur organicznych, w tym pierwszej struktury trójwymiarowej białka, mioglobiny, a następnie penicyliny, witaminy B₁₂ i insuliny.

Znaczenie struktury molekularnej DNA jako materiału, z którego powstają geny, doceniło wielu naukowców z chemii i biologii, głównie mikrobiologii: Gregor Mendel, Friedrich Miescher, Phoebus Levene, William Astbury, Erwin Chargaff, Oswald Avery, Francois Jacob, Jacques Monod, Ole Maaloe, Max Delbrück, Sydney Brenner i inni.

Tabela 1.1. Wdrożenia aplikacyjne z zakresu biotechnologii

Rok wdrożenia

Rodzaj aplikacji

1971

Farley, Cape, Glaser: powołanie pierwszej spółki biotechnologicznej Cetus

1972

przemysłowa produkcja kwasu 6-aminopenicylinowego

1974

przemysłowa produkcja syropu glukozowo-fruktozowego

1976

Swanson, Boyer: fundacja drugiej spółki biotechnologicznej Genentec

1977

dalsze nowe firmy biotechnologiczne

1978

rekombinowana ludzka insulina (Genentec)

1980

prace nad rekombinowaną α-amylazą (Novo)

1982

zatwierdzenie ludzkiej insuliny przez FDA (Eli Lilly)

1982

techniczna produkcja rekombinowanej α-galaktozydazy (Bochringer Mannhein, Germany)

1984

zmechanizowane sekwencjonowanie DNA

1988

Leder, Steward: patent na produkcję transgenicznych myszy

1996

masowa hodowla zrekombinowanych nasion kukurydzy

1999

CELERA – przemysłowe sekwencjonowanie genomu

1999

mikrobiologiczna produkcja witaminy C

Źródło: na podstawie Buchholz K. i Collins J. 2013. The roots – a short history of industrial microbiology and biotechnology. Appl. Microbiol. Biotechnol., 97: 3747–3762, zmienione.

Opisanie przez Watsona i Cricka w 1953 r. struktury DNA spowodowało w następstwie istotny przełom naukowy oraz postęp w rozwoju licznych technik, które przyniosły sukcesy biotechnologii.

Berg, Cohen i Boyer w 1972 r. wprowadzili technologię rekombinowanego DNA (rDNA), konstruując pierwsze rekombinowane plazmidy i wirusy, które zostały wprowadzone odpowiednio do bakterii lub komórek zwierzęcych, gdzie autonomicznie się namnażały. Patent udzielony Cohenowi i Boyerowi oraz Uniwersytetowi Kalifornijskiemu został krytycznie skomentowany przez Berga.

W latach 80. i 90. XX w. wprowadzono techniki genetyczne w metodach pozyskiwania nowych szczepów przemysłowych. Nowe metody i narzędzia badawcze odegrały kluczową rolę w szybkiej ekspansji technologii rekombinacji. Obejmują one: techniki elektroforezy żelowej, wirowanie, trawienie DNA z zastosowaniem endonukleaz restrykcyjnych, sekwencjonowanie DNA, metody ekstrakcji genów, szereg metod klonowania mniejszych fragmentów DNA z wykorzystaniem plazmidów, kosmidów oraz fosmidów, klonowanie większych fragmentów DNA z zastosowaniem sztucznych chromosomów bakteryjnych BAC i drożdżowych YAC, metagenomika i ostatnio biologia syntetyczna. Projektowanie białek stało się racjonalnym narzędziem do produkcji biofarmaceutyków i rozwoju badań nad enzymami. Dzięki dostępności powyższych technik molekularnych klonowania genów u Gram-ujemnych pałeczek E. coli zaistniała dogodna sytuacja do łatwego opracowania wektorów do klonowania genów, które można przenieść do innych gatunków nie tylko bakterii. Dotyczy to identyfikacji plazmidów replikujących się w innych organizmach, które można eksprymować i wykorzystywać do selekcji w nowym gospodarzu, w tym w bakteriach, drożdżach, liniach komórek owadzich i komórkach roślinnych.

Połączenie technik inżynierii genetycznej i technologii rDNA umożliwiło szybkie komercyjne wykorzystanie wyników naukowych w świecie biznesu. Przełomem przemysłowym była rekombinowana ludzka insulina opracowana przez Genentech we współpracy z Ely Lilly w 1978 r. i zatwierdzona przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków w 1982 r. Warto podkreślić udział polskich badaczy i biotechnologów w dziele tworzenia insuliny ludzkiej (Gensulin). Prowadzone w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w latach 1992–1995 badania nad opracowaniem technologii otrzymywania insuliny ludzkiej zaowocowały w 2000 r. uruchomieniem jej produkcji na skalę przemysłową. Polska stała się czwartym na świecie po USA, Danii i Niemczech producentem insuliny ludzkiej uzyskiwanej metodą inżynierii genetycznej. W ten sposób uzyskano możliwość nieograniczonej produkcji insuliny, bowiem do tej pory wszystkie preparaty insuliny były mniej lub bardziej oczyszczonymi preparatami insuliny wieprzowej lub wołowej. Kolejny przełomowy moment w historii badań nad insuliną nastąpił w 1996 r., w którym uzyskano analog insuliny ludzkiej – insulinę lispro – o niezwykle wartościowych cechach farmakodynamicznych, zmieniając jedynie kolejność dwóch końcowych aminokwasów (lizyny i proliny) w łańcuchu B.

Inne uzyskane produkty rekombinowane to głównie leki, których nie dało się wytworzyć innymi metodami, a które są bardzo interesujące z medycznego punktu widzenia: ludzki hormon wzrostu w 1983 r., β-interferon i szczepionka przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B w 1986 r., tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) w 1987 r. i erytropoetyna w 1989 r. W ostatnich dekadach tą metodą produkuje się rekombinowane białka, w tym hormony i czynniki wzrostu, czynniki krzepnięcia krwi, cytokiny, przeciwciała monoklonalne i szczepionki jako najważniejsze biofarmaceutyki. Także produkcja antybiotyków stanowi ważny sektor biofarmaceutyków o wielu różnych właściwościach.

Transfer nauki do sfery gospodarczej zaowocował powstaniem nowych firm biotechnologicznych. Pierwszy powstał Cetus (1971 r.), następnie twórca „reakcji łańcuchowej polimerazy” PCR Kary’ego Mullisa, który wykreował diagnostykę genetyczną. W 1976 r. Herbert Boyer i Robert Swanson założyli firmę Genentech. Spośród innych ważniejszych założonych w tych latach firm można wymienić Biogen (1978 r.), Amgen (1980 r.) i Chiron (1981 r.).

W ciągu ostatnich 20 lat wdrożono nowe lub bardziej wydajne przemysłowe procesy związane z wykorzystaniem mikroorganizmów, dające czystsze, tańsze produkty lub substancje niedostępne przy użyciu klasycznych metod chemicznych. Ogólnie mówiąc, teraz można:

– przekształcać reakcje wtórne w główne szlaki metaboliczne;

– optymalizować produkcję i wydajności procesów;

– zmienić pierwotne szlaki metaboliczne, aby umożliwić stosowanie tańszych surowców lub uzyskanie wcześniej nieznanych cząsteczek;

– wykorzystać właściwości enzymów w celu otrzymania nowych cząsteczek chiralnych.

Lista produktów uzyskanych tymi metodami zwiększa się co roku. W ich produkcję jest zaangażowanych wiele obszarów przemysłowych.

Do produktów najczęściej uzyskiwanych w mikrobiologii przemysłowej należą:

1) białka farmaceutyczne (ludzki interferon, naskórkowy czynnik wzrostu i hemoglobina, antygeny wirusowego zapalenia wątroby typu B, stabilizatory erytropoetyny i ludzkiej kosmówki, gonadotropina) otrzymywane z wykorzystaniem mikroorganizmów, takich jak Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha lub Agrobacterium tumefaciens;

2) rekombinowane enzymy do procesów przemysłowych z zastosowaniem mikroorganizmów; obejmują przemysłowy rynek enzymów stosowanych w produkcji żywności, detergentów, tekstyliów, przemysłu skórzanego, celulozowego i papierniczego; szczególnie interesujące są lipazy mikrobiologiczne, np. Lipolase™ (wyprodukowany po raz pierwszy w 1994 r. przez duńską firmę Novozymes) jest pierwszym rekombinantem lipazy; została uzyskana przez klonowanie Thermomyces lanuginosus genu lipazy do genomu Aspergillus oryzae;

3) antybiotyki biosyntetyczne (w tym penicylina V) i naturalne (penicylina G); z 12 000 antybiotyków opisanych w 1995 r. ponad 20% może być wytwarzane przez grzyby nitkowate (biosyntetyczna i półsyntetyczna penicylina i cefalosporyna);

4) czynniki immunosupresyjne, w tym cyklosporyna A z Tolypocladium nivenum oraz mykofenolan mofetylu z kilku gatunków Penicillium;

5) czynniki hipocholesterolemiczne, w tym lowastatyna z Aspergillus terreus i prawastatyna z Penicillium citrium;

6) czynniki przeciwnowotworowe, takie jak taksol po raz pierwszy wykryty w roślinie, ale później produkowany przez Taxomyces andreanae;

7) mikotoksyny, w tym inhibitory adrenaliny, estrogeny i środki anaboliczne stosowane u bydła i owiec lub gibereliny w branżach piwowarskich i słodowniczych;

8) pigmenty, w tym astaksantyna karotenoidowa z Phaffia rhodozyma i β-karotenoid z Blakeslea trispora, stosowane w przemyśle spożywczym i tekstylnym;

9) wielokrotnie nienasycone kwasy tłuszczowe, w tym kwas γ-linolowy z Mucor circinelloides i kwas arachidowy z Mortierella isabellina.

Równolegle rozwijała się produkcja klasycznych wyrobów, innych niż farmaceutyki, zarówno tradycyjnymi metodami mikrobiologicznymi, jak i rekombinacyjnymi. Najważniejsze produkty masowe to etanol, aminokwasy i kwasy organiczne, witaminy oraz biopolimery. Inżynieria metaboliczna została z powodzeniem zastosowana do optymalizacji wydajności, np. w produkcji aminokwasów. Natomiast wytwarzanie na bardzo dużą skalę etanolu, tradycyjnie produkowanego z surowców takich jak skrobia i cukier, jako dodatku do benzyny, wywołało ostrą krytykę ze względu na wykorzystywanie do tego upraw rolnych. Ostatnio pojawił się pomysł wykorzystywania biomasy celulozowej jako źródła biopaliw. Kolejne tematy to produkcja biogazu i energii elektrycznej wytwarzanej przez mikrobiologiczne ogniwa paliwowe. Metody rekombinacji DNA również znacząco wpłynęły na technologię enzymów od późnych lat siedemdziesiątych. Nadmierna ekspresja w szybko rosnących organizmach gospodarza o wysokiej produktywności białek umożliwiła tańszą produkcję na skalę przemysłową wielu enzymów, które wcześniej nie były łatwo dostępne, a są stosowane obecnie do produkcji żywności, detergentów oraz farmaceutyków.

Udało się także pozyskać rośliny transgeniczne celem zwiększenia plonów, dzięki nabytym cechom odporności na choroby i herbicydy. Transgeniczne rośliny są uprawiane na bardzo dużą skalę w USA, Argentynie, Brazylii, Kanadzie, a także w innych krajach.

Wielkim osiągnięciem w 2000 r. było zsekwencjonowanie ludzkiego genomu dzięki międzynarodowej współpracy i całkowitym wydatkom rzędu 3 mld dolarów. Zadanie to zostało zrealizowane przez duże międzynarodowe konsorcjum i w dużej mierze niezależnie od grupy Craiga Ventera. Wyniki sekwencjonowania Human Genome Project mogą umożliwić odkrycie i wyprodukowanie setek nowych farmaceutyków, z których wiele to naturalne ludzkie produkty genowe wcześniej niedostępne w znaczących ilościach, lub preparatów wolnych od wirusów, znacznie poprawiających diagnostykę i rewolucjonizujących medycynę.

Wreszcie obiecujące badania i eksperymenty z komórkami macierzystymi, śledzenie różnicowania się komórek i embriogenezy, otwierające nową dziedzinę badań medycznych, produkcję modeli chorób genetycznych, nowe podejście do rozumienia raka. Na przykład niemiecka biolog Christiane Nüsslein--Volhard otrzymała wraz z Erikiem Wieschausem i Edwardem B. Lewisem w 1995 r. Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny za badania nad genetyczną kontrolą rozwoju zarodka z wykorzystaniem muszki owocowej (Drosophila melanogaster).

Kolejnym wielkim wydarzeniem była chemiczna synteza całego genomu Mycoplasma genitalium przez Craiga Ventera, a następnie przeniesienie tego DNA do innego gatunku Mycoplasma, co spowodowało zastąpienie rezydującego genomu genomem całkowicie syntetycznym i utworzenie nowego szczepu zdolnego do ciągłej autoreplikacji (First Self-Replicating, Synthetic Bacterial Cell Constructed by J. Craig Venter Institute Researchers). Osiągnięcie to można uważać za dalszy krok w dziedzinie zapoczątkowanej przez Pasteura wykorzystującego żywe organizmy do tworzenia nowych komórek o nowym potencjale syntetycznym.

Bardzo duże pole do zastosowania biotechnologii stanowi technologia środowiskowa, która stała się ważnym przemysłem. Obejmuje ona oczyszczanie ścieków, zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych, stosowane w wielu małych i bardzo dużych instalacjach.

1.3. Główne procesy w mikrobiologii przemysłowej

1.3.1. Upstream processes

W uprzednich latach liczne i różne produkty pozyskiwano z naturalnych źródeł lub syntetyzowano w procesach chemicznych – niektóre w procesach fermentacji prowadzonych przez mikroorganizmy, inne zaś – w procesach konwersji biologicznej. Zalety wykorzystania mikroorganizmów w tego typu procesach są takie, że dodatkowo uzyskuje się w nich biomasę, mają szybkie tempo wzrostu oraz można stosować stosunkowo tanie substraty, w wielu przypadkach odpady z różnych gałęzi bioprzemysłu. Generalnie produkty mikrobiologii przemysłowej i biotechnologii mikroorganizmów są wykorzystywane w procesach opisywanych jako upstream, procesach fermentacji oraz procesach downstream.

Do procesów poprzedzających należą izolacja i selekcja mikroorganizmów, szczepów przydatnych do taniej produkcji dużych ilości oczekiwanego produktu, przechowywanie szczepów przemysłowych, namnażanie szczepionki (inoculum), selekcja substratu, optymalizacja i produkcja podłoża hodowlanego oraz przemysłowa sterylizacja podłoża produkcyjnego. Mikroorganizmy jako czynniki produkujące oraz surowy materiał jako substrat fermentacyjny są najistotniejsze w upstream processes. Szczepy stosowane w produkcji są istotne we wszystkich fermentacjach przemysłowych, ponieważ wzrost efektywności produkcji redukuje koszty produkcji. W wielu przypadkach szczepy przemysłowe są poddawane mutagenezie lub rekombinacji DNA – przechodzą procesy via mutacje i rekombinacje. Dobór podłoża zależy od skali fermentacji. W skali laboratoryjnej do sporządzania podłoża często stosuje się substraty czyste chemicznie. Stosowanie ich na skalę przemysłową jest nieopłacalne z powodu wysokich kosztów. Dlatego stosuje się tanie substraty, często odpadowe z różnych gałęzi bioprzemysłu, tj. roślinne lub zwierzęce odpady przemysłowe, które mają różny i zmienny skład. Są one także sprawdzane pod kątem przydatności w skali laboratoryjnej.

1.3.2. Procesy fermentacji

Z przemysłowego punktu widzenia fermentacja to wytwarzanie produktu przez biomasę mikroorganizmu w warunkach tlenowych lub beztlenowych. Fermentację zwykle prowadzi się w fermentorach lub bioreaktorach, które są optymalne do produkcji biomasy oraz syntezy produktu fermentacji. Przyrost biomasy oraz synteza produktu zależą od wielu czynników, takich jak temperatura, pH, zawartość tlenu, mieszania hodowli i poziom piany oraz właściwości szczepu przemysłowego. W zależności od potrzeb stosuje się proste bioreaktory lub fermentory wyposażone w różne systemy kontroli procesu fermentacji podłączone do komputera. Fermentację przemysłową można prowadzić w hodowlach stacjonarnych, hodowlach półciągłych lub z ciągłym przepływem – w zależności od typu końcowego produktu.

1.3.3. Downstream processes

Downstream processes to wszystkie czynności wykonywane po zakończeniu procesu fermentacji, głównie związane z odzyskaniem produktu fermentacji, jego oczyszczaniem i krystalizacją oraz konfekcjonowaniem. Należą do nich również procesy związane z wydzieleniem biomasy i jej rozbiciem w celu pozyskania dodatkowych ilości produktu oraz usunięcie biomasy z płynu fermentacyjnego. W celu oddzielenia biomasy mieszaninę hodowlaną filtruje się lub odwirowuje, a biomasę rozbija chemicznie, fizycznie lub biologicznie – w zależności od trwałości produktu fermentacji. Ponieważ uzyskiwane ilości produktu są zwykle niewielkie, prowadzi się proces jego zagęszczania. Do oczyszczania produktu można stosować różne metody, jak np. chromatografię, dializę, odwróconą osmozę, destylację lub ekstrakcję rozpuszczalnikami – w zależności od typu i poziomu czystości finalnego produktu. Wodę lub rozpuszczalnik usuwa się przez odparowywanie lub suszenie produktu albo jego krystalizację. Generalnie są to procesy: oddzielenia i rozbijania komórek biomasy celem wyekstrahowania wewnątrzkomórkowego metabolitu, zagęszczanie, oczyszczanie, jakościowa i ilościowa kontrola produktu, pakowanie i przechowywanie produktu, sterylizacja oraz oczyszczanie ścieków powstałych w czasie produkcji i odzyskiwania produktu.

1.3.4. Skale hodowli mikroorganizmów

Słownik Cambridge definiuje zwiększanie skali produkcji mikrobiologicznej jako zwiększanie wielkości bioreaktora (fermentora), objętości hodowli i syntezy produktu (zwiększenie produkcji w jednostce czasu trwania fermentacji). W procesie hodowli mikroorganizmów w bioreaktorach zachodzi synteza produktu, w następnym etapie jego odzyskiwanie i oczyszczanie oraz usuwanie powiązanych z produkcją odpadów. Typowanie szczepów produkcyjnych jest zwykle testowane w laboratorium w fermentorach objętości 0,5–10 l (skala laboratoryjna), co musi zostać przełożone na produkcję w skali przemysłowej (pełna skalę produkcji) w bioreaktorach objętości 20 000–2 000 000 l. Jeżeli w procesie występuje wiele nowych czynników, skalowanie dużych procesów przemysłowych najlepiej wykonać w dwóch etapach. Pierwszym etapem jest skala pilotażowa w fermentorach objętości 100−10 000 l z dopasowanym odpowiednio sprzętem. Celem skali pilotażowej jest przeniesienie skali laboratoryjnej na proces w realistycznie zmniejszonej wersji produkcji przemysłowej. W większości przypadków nie jest on w pełni zintegrowany i wymaga pewnych korekt. Na tym etapie sprawdza się wszystkie możliwe parametry kinetyczne fermentacji, poddaje korekcie oraz szacuje poniesione koszty. Drugi etap to skala demonstracyjna (skala demo) z fermentorami wielkości 10 000–100 000 l, która służy minimalizacji ryzyka kapitałowego podejmowanego do realizacji w pełnowymiarowej skali produkcyjnej (walidacja procesu). Jeśli stopień nowości jest stosunkowo niski, skala demonstracyjna może być pominięta.

1.3.5. Skala produkcji przemysłowej zależna od parametrów fermentacji

Na proces fermentacji wpływają następujące czynniki:

1) stopień czystości dodawanych składników podłoża fermentacyjnego (naturalne lub o wysokiej czystości, zmienność między seriami surowców); może nastąpić nagromadzenie inhibitorów i niesfermentowanych składników podłoża, które mają wpływ nie tylko na przebieg fermentacji, ale także na bilans wodny i dynamikę przebiegu procesu, zwłaszcza w fermentacjach prowadzonych w hodowlach półciągłych;

2) degradacja surowców oraz tworzenie inhibitorów mających wpływ na dynamikę fermentacji, procesy downstream oraz oczyszczanie ścieków i utylizację odpadównastępujące podczas sterylizacji podłoża fermentacyjnego lub dodawanego surowca zależnie od temperatury oraz czasu trwania sterylizacji;

3) czas mieszania w procesie fermentacji wzrasta wraz z gradientami pewnych parametrów kontrolujących proces fermentacji i może być zależny od temperatury, wartości pH oraz stężenia substancji odżywczych, które mogą mieć negatywny wpływ na proces fermentacji;

4) współczynnik przenikalności gazu (kLa) przez ciecz i biomasę mający negatywny wpływ na wydajność fermentacji;

5) podwyższenie ciśnienia cząstkowego gazów pO₂ i pCO₂ wraz ze zwiększeniem brutto ciśnienia hydrostatycznego podłoża hodowlanego, które wpływa na wydajność procesu fermentacji;

6) większe naprężenia ścinające (siły ścinające) w zależności od skali mogą spowodować uszkodzenie komórek, wpływając na proces fermentacji i/lub wydajność procesów downstream;

7) wydłużony czas przetrzymywania podłoża w trakcie fermentacji oraz czas odzyskiwania produktu może wpływać na skład chemiczny podłoża, lizę komórek szczepów produkcyjnych oraz procesy downstream i utylizację odpadów i ścieków;

8) dezaktywacja hodowli zależna od temperatury oraz czasu zatrzymania podłoża w procesie fermentacji także wpływa na lizę komórek, skład podłoża, co ma wpływ na procesy downstream i oczyszczanie ścieków.

Powiedzenie: ‘the early bird may get the worm, but the second mouse gets the cheese’ „najszybszy ptak dostaje robaka, a druga mysz dostaje ser” mówi, że należy uczyć się od innych, którzy byli wcześniej. Niektórzy z najmądrzejszych, jakich znamy, to najszybsze ptaki. Są genialni i szybcy, przekonani, że mogą zrobić wszystko sami znacznie szybciej, taniej i lepiej niż ktokolwiek inny, chociaż nigdy tego wcześniej nie robili. Nie doceniają wyzwań związanych z powiększaniem skali, a czasem nawet je ignorują. Nadrabiają to potem, zmuszając się nierozważnie do pójścia na skróty i dokonywania skoków w dobrej wierze. Zamiast ich naśladować, lepiej być „drugą myszą” – zgromadzić wokół siebie wykwalifikowane zespoły inżynierów (aby ocenili nowe możliwości), pozyskać wskazówki co do bieżących prac badawczo-rozwojowych, aby określić realistyczne oczekiwania i z powodzeniem skalować proces bez niespodzianek.

1.4. Bioaktywne związki pozyskiwane z organizmów

Produkty naturalne w najszerszym znaczeniu to związki chemiczne izolowane z różnych żywych organizmów. Podstawowe metabolity (polisacharydy, proteiny, kwasy nukleinowe i kwasy tłuszczowe) są powszechne we wszystkich systemach biologicznych. Metabolity wtórne, nazywane także metabolitami wyspecjalizowanymi, to małocząsteczkowe (MW ~3000), niezwykle różnorodne chemicznie, często pełniące niejasne funkcje, charakterystyczne głównie dla pewnych organizmów. Aktywność biologiczna lub bioaktywność metabolitów może pojawiać się na poziomie molekularnym in vitro lub in vivo. Definicja metabolitów obejmuje wszystkie metabolity, które regulują procesy wzrostu, replikacje i/lub wykazują pewien rodzaj reakcji (regulujących, hamujących, stymulujących) na komórki na poziomie biochemicznym, w minimalnym stężeniu. Wyróżnia się dwa rodzaje związków bioaktywnych: nieantybiotykowe związki bioaktywne (metabolity „inne bioaktywne”) oraz antybiotyki. Metabolity wyizolowane z mikroorganizmów wykazujące działanie antybakteryjne, antygrzybiczne, antypierwotniacze, antynowotworowe i/lub antywirusowe to antybiotyki. Wszystkie inne metabolity bioaktywne można nazwać naturalnymi bioregulatorami lub modulatorami biochemicznymi. Bez wątpienia „klasyczne” antybiotyki stanowią tylko część (być może mniejszą) możliwych bioaktywnych metabolitów mikroorganizmów. Praktyczne znaczenie antybiotyków i innych metabolitów jest ogromne. Są szeroko stosowane w leczeniu ludzi i zwierząt, a także w rolnictwie i badaniach naukowych. Produkty naturalne, w tym metabolity drobnoustrojów, można praktycznie wykorzystać na trzy różne sposoby:

1) bezpośrednio w medycynie, w rolnictwie lub w jakichkolwiek innych dziedzinach;

2) jako materiał wyjściowy do późniejszej modyfikacji chemicznych lub mikrobiologicznych;

3) jako związki wiodące do syntezy chemicznej nowych analogów lub jako szablony projektowanych leków.

W tabeli 1.2 przedstawiono przybliżone liczby aktywnych metabolitów produkowanych przez Bacteria i Eukarya.

Tabela 1.2. Liczebności metabolitów produkowanych przez organizmy żywe

Źródło

Wszystkie znane związki

Inne bioaktywne

Antybiotyki

Produkty naturalne

> 1 000 000

200 000–250 000

25 000–30 000

Królestwo roślin

ogółem

550 000–650 000

128 000–177 000

~ 13 000

glony i porosty

3000–5000

1500–2000

~ 1000

rośliny wyższe

500 000–600 000

~ 100 000

10 000–12 000

Bakterie

> 50 000

22 000–23 000

~ 17 000

Królestwo zwierząt

ogółem

300 000–400 000

50 000–100 000

~ 5000

pierwotniaki

kilkaset tysięcy

100–200

~ 50

zwierzęta morskie

20 000–25 000

7000–8000

3000–4000

owady/robaki itp.

8000–10 000

800–1000

150–200

kręgowce

200 000–250 000

50 000–70 000

~ 1000

Źródło: na podstawie Bérdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites, J. Antibiot 58: 1–26, zmienione.

Związki bioaktywne są produkowane przez rośliny, takie jak glony, porosty, wątrobowce, paprocie i mchy, rośliny naczyniowe o działaniu antydrobnoustrojowym/antywirusowym. Często występujące metabolity roślinne (alkaloidy, flawonoidy, terpenoidy itp.) wykazują również różne działania toksyczne i farmakologiczne, a także niektóre działania antybakteryjne i antynowotworowe/antywirusowe. W najszerszym znaczeniu wszystkie powyższe związki można również uznać za antybiotyki. W królestwie zwierząt producentami metabolitów są Porifera, Mollusca, Cnidaria, Anthozoa, Echinodermata oraz Bryozoa. W grupie produktów morskich, w tym wodorostów morskich związki inne bioaktywne nieantybiotyczne stanowią około połowę wszystkich obecnie znanych bioaktywnych produktów morskich.

Z praktycznego punktu widzenia większość obecnie znanych biologicznych aktywności związków nieantybiotycznych można sklasyfikować jako:

– środki farmakologiczno-biochemiczne lub medyczne,

– środki wykorzystywane w rolnictwie,

– środki regulacyjne, biofizyczne i inne.

Pierwszy rodzaj związków innych bioaktywnych o możliwej aktywności medycznej w największej liczbie obejmuje potencjalnie bardzo ważne metabolity hamujące działanie enzymów. Obecnie ponad 3000 związków, o których wiadomo, wykazuje aktywność hamującą wobec około 300 do 350 różnych układów enzymatycznych. Istnieje około 800 związków immunoaktywnych (immunosupresyjnych, immunostymulujących) oraz setki związków o najróżniejszych regulacjach: hamujących, agonistycznych i antagonistycznych, w tym przeciwzapalnych/przeciwutleniających, hipocholesterolemicznych, antymetabolitowych, a także o różnym działaniu toksycznym (mikotoksycznych). W tej grupie występują także związki o działaniu biochemicznym, takim jak hamowanie zestawu tubuliny (mikrotubuli), związki indukujące interferon, antymitotyczne/antymitogenne, uszkadzające DNA, działające antymutagennie, wykazujące aktywności indukujące apoptozę, hamujące angiogenezę. Testy wykrywające te aktywności wykazują bardzo duże różnice, a zakres ostatecznych efektów fizjologicznych, biologicznych, biochemicznych, fitochemicznych i mikrobiologicznych obejmuje blisko tysiąc kategorii bioaktywności. Związki odkryte za pomocą tych specyficznych metod można nazwać (odróżniając je od antybiotyków) mikrobiologicznymi produktami leczniczymi lub biofarmaceutykami. Warto tu wspomnieć o cyklosporynie, lowastatynie lub takrolimusie, mających duże znaczenie praktyczne.

Większość dopuszczalnych środowiskowo związków rolnych to produkty naturalne lub powstające w wyniku modyfikacji produktów naturalnych. Związki aktywne w rolnictwie mogą również zawierać związki hamujące enzymy. Tak zwane działania rolnicze obejmują głównie pestycydy (insektycydy, środki roztoczobójcze, larwicydy, repelenty, środki odstraszające, środki przeciwdziałające plewom, środki antypasożytnicze, przeciw robakom, cystycydy, akarycydy, nematocydy, związki przeciwwymiotne, algicydy i inne środki zwalczania biologicznego) oraz herbicydy (substancje fitoaktywne: fitotoksyny, regulatory wzrostu roślin, inhibitory kiełkowania, allelozwiązki, fitohormony, induktory chlorozy). Dodatki paszowe, środki konserwujące, permytanty/promotory wzrostu są stosowane w hodowli i weterynarii. Awermektyna, monensyna i bialafos są najbardziej użytecznymi związkami drobnoustrojowymi w tej grupie.

Istnieje też grupa związków wytwarzanych przez mikroorganizmy. Są to specyficzne inhibitory metaboliczne, czynniki wzrostu, czynniki morfogenne i sporogenne, związki sygnałowe, induktory powstawania grzybni, stymulatory produkcji, autoregulatory, feromony bakteryjne, induktory różnicowania; siderofory są włączone do tej grupy. Związki te odgrywają istotną rolę w cyklu życia drobnoustrojów i mogą być stosowane w testach biologicznych lub jako odczynniki biochemiczne. Związki o właściwościach biofizycznych to biosurfaktanty, bioflokulanty, czynniki chelatujące i jonowe, zmiatacze minerałów, jonofory, związki fotoaktywne, radioprotektanty i inne.

Antybiotyki i inne produkty naturalne będące metabolitami mogą być produkowane przez organizmy prokariotyczne (bakterie) oraz eukariotyczne (rośliny i zwierzęta). Zdolność wytwarzania metabolitów przez organizmy jest jednak bardzo nierównomierna. Wśród bakterii i roślin pewne grupy, jak Actinobacteria (promieniowce) i Mycota (grzyby), są najczęstszymi i najbardziej wszechstronnymi producentami. W grupie bakterii różne metabolity są produkowane przez gatunki Bacillus, Pseudomonas oraz Myxobacteria i Cyanobacteria. Wśród bakterii dominują gatunki należące do rodzaju Streptomyces. które wytwarzają około połowę wszystkich metabolitów. Liczebności naturalnych związków bioaktywnych przedstawiono w tabeli 1.3. Wśród grzybów dominują grzyby strzępkowe oraz pewne grupy grzybów wyższych (Ascomycota i Basidiomycota).

Tabela 1.3. Prawdopodobne liczebności odkrytych antybiotyków produkowanych przez mikroorganizmy w latach 1940–2010

Okres

Lata

1940–1974

Lata

1975–2000

Lata

2001–2010

Ogółem

Bakterie

ogółem

7635

17 130

5760

30 525

Myxobacteria

25

400

210

635

Cyanobacteria

10

30

1250

1290

Actinobacteria

3900

9300

3800

17 000

Streptomyces spp.

2900

5100

2400

10 400

pozostałe bakterie

800

2300

1100

4200

Grzyby

ogółem

1270

7400

6560

15 230

grzyby strzępkowe

950

5400

4900

11 250

Basidiomycota

300

1800

1500

3600

inne grzyby

20

200

160

380

Źródło: na podstawie Bérdy J. 2012. Thoughts and facts about antibiotics: Where we are now and where we are heading. J. Antibiot. 65: 441, zmienione.

Promieniowce są producentami wielu antybiotyków. Wytwarzają związki antybakteryjne należące do β-laktamów, aminoglikozydów, tetracyklin, makrolidów, glikopeptydów, lipopeptydów, streptogramidów i innych. Pod względem budowy chemicznej związki wytwarzane przez promieniowce należą m.in. do poliketydów, peptydów, butenolidów, chinonów, makrolidów, alkaloidów, laktonów, laktamów, terpenów i terpenoidów.

Od kilku lat obiektem badań są peptydy o działaniu przeciwbakteryjnym. Szczególne nadzieje wiąże się z bakteriocynami – peptydami antydrobnoustrojowymi syntetyzowanymi przez bakterie mlekowe, głównie z rodzaju Lactobacillus. Są one wykorzystywane w przemyśle spożywczym jako naturalne konserwanty. Oczyszczone preparaty bakteriocyn, takie jak: dostępne komercyjnie nizyna A czy pediocyna PA-1, z powodzeniem są stosowane do konserwowania żywności. Bakteriocyny są oporne na wysoką temperaturę i tolerują szerszy zakres pH w porównaniu do klasycznych antybiotyków. Bakteriocyny są zwykle syntetyzowane rybosomalnie, w czasie fazy G1 i nie są metabolitami wtórnymi, dzięki czemu są coraz częstszym przedmiotem zainteresowania bioinżynierii. Masa cząsteczkowa bakteriocyn rzadko przekracza 10 kDa, ulegają trawieniu przez proteazy w przewodzie pokarmowym człowieka, dzięki czemu są bezpieczne jako konserwanty żywności.

Istnieje ogromna populacja prostych pochodnych aminokwasów, cyklicznych dipeptydów (CDP) występujących w wielu żywych organizmach: mikroorganizmach, roślinach i zwierzętach. Wytwarzane są dwoma głównymi szlakami: jako produkty syntetaz NRP lub, co ciekawsze, w unikalnym procesie enzymatycznym wykorzystującym syntazy cyklopeptydowe (CDPS), które wykorzystują aminoacylo-tRNA jako substrat. Analiza genomów wskazuje na obecność genów CDPS w więcej niż 50 różnych bakteriach, także grzybach i pierwotniakach. Są to najstarsze peptydy, mogące zawierać niebiałkowe aminokwasy. Stanowią rdzenień strukturalny wielu złożonych produktów naturalnych (diketopiperazyn), które obejmują aranotyny, bicyklomycynę, chetocynę, cyklomarazyny, gliotoksyny i wertycylinę. Niektóre bakterie wytwarzają nawet sześć odmian CDP. Sugeruje się, że wiele CDP wzmacnia funkcje bakteryjne, takie jak wzrost, różnicowanie i sygnalizację komórkową, niektóre zaś odgrywają niewyjaśnioną rolę. Stwierdzono, że CDP w warunkach laboratoryjnych są antynowotworowe, antywirusowe, antybakteryjne, antygrzybicze, immunosupresyjne, neurologiczne, jako cząsteczki sygnałowe, endokrynologiczne lub mogą być czynnikami wirulencji.

Literatura rekomendowana

Buchholz K. i Collins J. 2013. The roots – a short history of industrial microbiology and biotechnology, Appl. Microbiol. Biotechnol., 97:3747–3762.

Demain A.L., Vandamme E.J., Collins J., Buchholtz K. 2017. History of Industrial Biotechnology, [w:] Industrial Biotechnology: Microorganisms, red. Wittmann C., Liao J.C., Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.

Demain A.L. 2000. Microbial biotechnology. Trends Biotechnol, 18: 26–31.

Sanchez S. i Demain A. 2009. Microbial Primary Metabolites: Biosynthesis and Perspectives, [w:] Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology, 10.1002/9780470054581.eib167.

Thirumurugan D., Cholarajan A., Raja S.S.S., Vijayakumar R. 2016. An Introductory Chapter: Secondary Metabolites, http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.79766 [dostęp: 7.10.2019].

2

Ulepszanie mikroorganizmów przemysłowych

2.1.Wprowadzenie

Mikroorganizmy przemysłowe stosuje się do produkcji w procesie fermentacji szerokiej gamy produktów wykorzystywanych w życiu codziennym człowieka oraz w wielu gałęziach gospodarki. Są one szczególnie przydatne ze względu na łatwość masowej hodowli na podłożach konstruowanych na bazie odpadów przemysłu rolno-spożywczego i szybki wzrost (przyrost biomasy) oraz ze względu na różnorodność produktów powstających przy ich udziale. Łatwo poddają się różnym manipulacjami genetycznym stosowanym w celu wytworzenia w skali masowej produktów o dużej czystości.

Tradycyjne fermentacje, jak np. warzenie piwa czy fermentacja alkoholowa, były początkowo wykonywane (i nadal są w wielu przypadkach) przez mieszaninę dzikich mikroorganizmów pochodzących z surowców lub środowiska lokalnego. Pierwsze próby ulepszania mikroorganizmów były czynione w końcu XIX w., kiedy po raz pierwszy izolowano je z tych procesów jako czyste szczepy, z których następnie wybrano szczepy najbardziej użyteczne (czasy Ludwika Pasteura). Konkretnie stosowane mikroorganizmy na skalę przemysłową były często izolowane ze środowiska naturalnego, głównie z gleby, która wykazuje największą różnorodność biologiczną. Wiązało się to z losowym przesiewaniem dużej liczby izolatów. Alternatywnie, pewne mikroorganizmy uzyskano z kolekcji szczepów. W celu poprawy ich właściwości do zastosowań przemysłowych większość z nich, niezależnie od pochodzenia, zmodyfikowano za pomocą konwencjonalnych strategii ulepszania szczepów z wykorzystaniem mutagenezy lub hodowli. W ostatnich dekadach opracowano kilka sposobów rekombinacji mikroorganizmów, a do poprawy właściwości szczepów przemysłowych coraz częściej stosuje się technologie inżynierii genetycznej.

W większości przypadków przy doborze mikroorganizmów do zastosowań przemysłowych mają ogromne znaczenie regulacje prawne. Przemysł fermentacyjny woli stosować ustanowione mikroorganizmy GRAS (ogólnie uważane za bezpieczne), w szczególności do wytwarzania produktów i składników spożywczych. Wynika to z faktu, że zatwierdzenie technologii i produktu przy użyciu „nowego” mikroorganizmu jest bardzo rygorystyczne i kosztowne. Ponadto, jeżeli patogeny i niektóre GMO wykorzystuje się jako organizmy producenta, należy podjąć dodatkowe środki bezpieczeństwa. Trzeba zastosować specjalne urządzenia zabezpieczające i używać zmodyfikowanych („okaleczonych”) szczepów, które nie mogą istnieć poza środowiskiem bioreaktora.

2.2.Metabolity produkowane przez mikroorganizmy

2.2.1. Metabolity pierwotne

Według firmy Business Communication Company (BCC), całkowity światowy rynek produktów wytworzonych z zastosowaniem mikroorganizmów szacuje się na 306 mld USD (Microbial Products 2019). Zalety produkcji różnych związków z zastosowaniem mikroorganizmów w porównaniu do ich izolacji z organizmów roślin i zwierząt lub otrzymywania ich na drodze syntez chemicznych są następujące:

1) szybkie pobieranie składników odżywczych wspierających wysokie tempo metabolizmu i biosyntezy;

2) zdolność prowadzenia szerokiej gamy reakcji;

3) łatwość przystosowania się do wielu różnych środowisk;

4) łatwość manipulacji genetycznej, zarówno in vivo, jak i in vitro, w celu zwiększenia produkcji, modyfikacji struktur i procesów oraz tworzenia zupełnie nowych produktów;

5) prostota procedur przesiewowych;

6) duża różnorodność.

Produkty drobnoustrojów są bardzo zróżnicowane, począwszy od bardzo dużych cząsteczek, takich jak białka, kwasy nukleinowe, polimery węglowodanowe, a nawet komórki, do małych cząsteczek – metabolitów pierwotnych niezbędnych do ich wzrostu i metabolitów wtórnych, nieistotnych dla wzrostu.

Metabolity pierwotne to związki syntetyzowane przez mikroorganizmy, które są im potrzebne do wzrostu i przyrostu biomasy. Są one produkowane przez komórki mikroorganizmów zwykle jedynie w ilościach ściśle koniecznych do ich metabolizmu i genetycznie regulowanych procesów. Funkcjonalne geny, które determinują syntezę tych związków, wykazują aktywności tak długo, jak to konieczne, w zależności od cyklu życiowego oraz czynników środowiskowych. Poprzez zastosowanie mutacji, inżynierii genetycznej lub warunków hodowlanych, które spowodują zakłócenie procesów metabolicznych, można uzyskać większe ilości metabolitów pierwotnych. Większość z metabolitów pierwotnych uzyskuje się w procesach biotechnologicznych, np. kwasy organiczne, aminokwasy, nukleotydy, witaminy i prowitaminy, alkohole i rozpuszczalniki, polisacharydy, lipidy i enzymy.

Kwasy organiczne, takie jak octowy, propionowy, masłowy, szczawiowy, fumarowy, itakonowy, kwas cytrynowy, mlekowy, winowy, α-ketoglutarowy, glukonowy, 2-okso-D-glukonowy, 5-okso-D-glukonowy, 2,5-diokso-D-glukonowy, 2-okso-L-gulonowy, epoksy-bursztynowy, izoaskorbinowy i kojowy, są produkowane przez mikroorganizmy. Produkcja poszczególnych kwasów organicznych jest indywidualna dla każdego kwasu oraz mikroorganizmu stosowanego do jego produkcji. Celem pozyskania odpowiednich kwasów organicznych stosuje się odpowiednie gatunki należące do rodzaju Acetobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Aspergillus, Brevibacterium, Bacillus, Candida, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Gluconobacter, Hansenula, Kluyvera, Lactobacillus, Microbacterium, Pseudomonas, Paracolobacterium, Penicillium, Pichia, Propionibacterium, Proteus, Rhizopus, Serratia.

Aminokwasy: L-alanina, L-arginina, kwas L-asparaginowy, L-cytrulina, L-DOPA, kwas L-glutaminowy, L-histydyna, L-homoseryna, L-izoleucyna, L-leucyna, L-lizyna, L-ornityna, L-fenyloalanina, L- prolina, L-seryna, L-treonina, L-tryptofan, L-tyrozyna i L-walina produkuje się z wykorzystaniem organizmów należących do rodzaju Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Nocardia, Serratia, Arthrobacter, Streptomyces, Hansenula, Candida, Proteus i Aerobacter. Najczęściej aminokwasy otrzymuje się w hodowlach tlenowych zanurzonych, indywidualnych dla każdego organizmu i produkowanego aminokwasu. W wielu przypadkach szczepy należące do jednego gatunku produkują różne aminokwasy. Aminokwasy produkowane przez mikroorganizmy mają jedną formę izomeryczną. Mutanty bakterii Corynebacterium glutamicum i Brevibacterium flavum produkują ogromne ilości lizyny, wykorzystując do syntezy tego aminokwasu około jedną trzecią ilości węgla obecnego w podłożu.

Nukleotydy produkowane przemysłowo z zastosowaniem szczepów z rodzaju Micrococcus, Brevibacterium i Bacillus to głównie inozyno-5--monofosforan, guanozyno-5-monofosforan i ksantozyno-5-monofosforan. Nukleotydy te są stosowane w farmaceutyce oraz dodawane jako suplementy do żywności. Z kwasem glutaminowym dają efekt synergistyczny.

Witaminy i prowitaminy potrzebne mikroorganizmom mogą być przez nie syntetyzowane. Niektóre z nich są produkowane pozakomórkowo. Szczególne znaczenie mają mikroorganizmy produkujące witaminy B₁₂ (cyjanokobalamina), B₂ (ryboflawina, laktoflawina), ergosterol (prowitamina D₂) i β-karoten (prowitamina A), gdyż są jedynym ich źródłem w skali przemysłowej. Innym źródłem witamin są wątroba (B₁₂) oraz marchew (β-karoten). Komercyjne zastosowanie mają witaminy produkowane przez mikroorganizmy jak kwas pantotenowy, tiamina, kwas foliowy, kwas limonowy, witamina C i witamina K. Producentami witamin są szczepy z rodzaju Propionibacterium, Pseudomonas, Clostridium, Debaromyces, Candida, Ashby, Eromothecium, Streptomyces, Sporobolomyces, Bacillus i Chlorella. Prowitamina A (β-karoten) jest produkowana przez Choanephora, Blakeslea, Rhodotorula, Mycobacterium i Nocardia. Mutant Pseudomonas denitrificans może syntetyzować 50 000 razy więcej witaminy niż jego typ dziki. Ergosterol jest odzyskiwany z komórek drożdży.

Alkohole i rozpuszczalniki są produkowane w procesie fermentacji w warunkach beztlenowych. Ich produkcja na skalę przemysłową była stosowana jako pierwsza od XIX w. Pierwszym związkiem produkowanym przez mikroorganizmy na skalę przemysłową, wykorzystywanym następnie do produkcji syntetycznej skóry, był prawdopodobnie butanol. Obecnie na skalę przemysłową produkuje się butanol, aceton, butane-2,3-diol, glicerol, D-mannitol, D-arabitol, ksylitol, erytritol i dihydroksyaceton. Do ich produkcji wykorzystuje się szczepy z rodzaju Clostridium, Aerobacter, Serratia, Bacillus, Candida, Pichia, Monilia, Hansenula, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Acetobacter, Trigonopsis, Bacterium i Brevibacterium.

Polisacharydy są naturalnymi materiałami zapasowymi i składnikami roślin. Od 20 lat produkuje się je przemysłowo przy wykorzystaniu mikroorganizmów. Generalnie polisacharydy powodują wzrost lepkości w podłożach hodowlanych. Dziś na skalę przemysłową produkuje się pullulan, kurdlan, skleroglukan, dekstran, ksantan, bursztynyloglukan i alginian. Wykorzystuje się do tego szczepy należące do rodzaju Leuconostoc, Streptobacterium, Streptococcus, Xanthomonas, Aureobasidium, Dematium, Sclerotium, Plectania, Helotium, Alcaligenes, Pseudomonas, Azotobacter i Erwinia. Polisacharydy są szeroko stosowane w przemyśle spożywczym, w farmacji i medycynie, immunochemii, przemyśle tekstylnym, papierniczym, kosmetycznym i pasz dla zwierząt.

Lipidy produkowane przez mikroorganizmy są dodawane jako suplementy do karmy dla zwierząt. Mikroorganizmami produkującymi lipidy są grzyby pleśniowe i drożdże. Do produkcji lipidów zdolne są następujące gatunki drożdży: Candida curvata, Cryptococcus albidus, Cryptococcus curvatus, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Yarrowia lipolytica, grzyby strzępkowe: Aspergillus oryzae, Cunninghamella echinulata, Mucor mucedo, Rhizopus arrhizus, Mortierella isabellina, Mucor circinelloides, Pythium ultimum oraz bakterie: Arthrobacter sp., Acinetobacter calcoaceticus, Rhodococcus opacus i Bacillus alcalophilus.

Enzymy to klasa białek pozyskiwanych metodami biotechnologicznymi. Wykorzystuje się je w różnych gałęziach przemysłu. Są to amylazy, celulazy, pektynazy, lipazy, proteazy, inwertazy, oksydaza glukozowa, izomeraza glukozowa, dekstrancukraza, penicylinaza, katalaza, peroksydazy, monooksygenazy. W przemysłowej produkcji enzymów wykorzystuje się szczepy należące do rodzaju Trichoderma, Byssochlamys, Aspergillus, Penicillium, Botrytis, Bacillus, Rhizopus, Candida, Mucor, Nortierrella, Clostridium, Saccharomyces, Streptomyces, Leuconostoc i Actinomyces.

2.2.2. Metabolity wtórne

Metabolity wtórne są produkowane przez żywe komórki, lecz nie są absolutnie konieczne do ich wzrostu i przyrostu biomasy. Mają małą masę cząsteczkową. Należą do nich antybiotyki, roślinne hormony wzrostu, alkaloidy, toksyny oraz pewne niezwykłe aminokwasy. Znanych jest więcej niż 6000 metabolitów produkowanych przez mikroorganizmy, ale marketingowe znaczenie ma jedynie około 100 z nich. Ich chemiczna struktura oraz trudne do zidentyfikowania funkcje odbiegają od metabolitów pierwotnych. Produkcja oraz szybkość pozyskiwania metabolitów wtórnych zależą od cyklu rozwojowego mikroorganizmu (od kilkudziesięciu minut do kilku dni w warunkach laboratoryjnych). Wytwarza się je nie tylko w bardzo małych ilościach. W tabeli 2.1 przedstawiono przykładowe grupy metabolitów wtórnych biologicznie aktywnych produkowane przez mikroorganizmy.

Antybiotyki są wykorzystywane głównie jako dodatki do pasz dla zwierząt oraz w medycynie do zabijania mikroorganizmów patogenicznych. Ponad połowa antybiotyków jest produkowana przez promieniowce, szczególnie przez Streptomyces, niektóre grzyby, jak Penicillium, Aspergillus, Trichoderma i Fusarium, oraz pewne Basidiomycota.

Ze względu na strukturę cząsteczki wyróżnia się następujące typy antybiotyków:

1) β-laktamowe (penicyliny i cefalosporyny);

2) polipeptydy (gramicydyny A, B, C i S, tyrocidyna, polimyksyna, bacytracyna itp.);

3) aminoglikozydy (streptomycyna, neomycyna, gentamycyna, kanamycyna, streptydyna);

4) makrolidowe (erytromycyna [I generacji], klarytromycyna, azytromycyna, josamycyna, spiromycyna i roksatromycyna [II generacji] itp.);

5) związki chinonowe (tetracyklina, emodyna, islandycyna itp.);

6) z aromatycznymi pierścieniami (chloramfenikol, gryzeofulwina, nowobiocyna);

7) o różnej strukturze niezaliczane do ww. grup (mitomycyna, aktynocycyna, puromycyna itp.).

Pewne związki produkowane przez mikroorganizmy uważane za mikotoksyny jak patulina lub zearaleon są podobne do takich antybiotyków jak emodyna i islandycyna.

Hormony steroidowe są produkowane przez niektóre grzyby strzępkowe, a hormony roślinne jak gibereliny – przez Gibberella fujikuroi. Powstają one na drodze konwersji substancji znajdujących się w środowisku.

Tabela 2.1. Aktywność biologiczna pewnych metabolitów wtórnych produkowanych przez mikroorganizmy przemysłowo istotne

Substancje aktywne

Przykłady

Mikroorganizm

antybakteryjne

cefalosporyna

cefamycyna

chloramfenikol

erytromycyna

kenamycyna

penicylina

ryfamycyna

spektynomycyna

streptomycyna

tetracyklina

Acremonium chrysogenum

Saccharopolyspora erythraea

Streptomyces kanamyceticus

Streptomyces aureofaciens

Streptomyces clavuligerus

Penicillium chrysogenum

Amycolatopsis mediterranei

Streptomyces spectabilis

Streptomyces griseus

Streptomyces venezuelae

antygrzybicze

amfoterycyna

aureofacyna

griseofulwina

kandycidyna

kwas aspergilowy

nystatyna

oligomycyna

Streptomyces nodosus

Streptomyces aureofaciens

Penicillium griseofulvum

Streptomyces griseus

Aspergillus flavus

Streptomyces nourse

Streptomyces diastachromogenes

inhibitory enzymów

kwas klawulanowy

Streptomyces clavuligerus

immunosupresory

cyklosporyna A 

rapamycyna

takrolimus (FK-506)

Tolypocladium inflatum

Streptomyces hygroscopicus

Streptomyces spp.

antyrakowe

aktynomycyna D

bleomycyna

doksarubicyna

mitomycyna

taksol

Streptomyces antibioticus

Streptomyces verticillus

Streptomyces peucetius

Streptomyces lavendulae

Taxomyces andreanae

antycholesterolowe

lowastatyna

monakolina

prawastatyna

Aspergillus terreus

Monascus ruber

Penicillium citrinum

promotory wzrostu

monensyna

tylozyna

Streptomyces cinnamonensis

Streptomyces fradiae

hormony wzrostu roślin

giberelina

Gibberella fujikuroi

herbicydy

bialafos

Streptomyces hygroscopicus

insektycydy

awermektyna

milbemycyna

Streptomyces avermitilis

Streptomyces hygroscopicus

Toksyny są wydzielane przez niektóre mikroorganizmy jako substancje szkodliwe, w szczególności skierowane przeciwko organizmom stałocieplnym, ale pewne z nich mogą być wykorzystywane w farmacji i medycynie w małych ilościach jako antygeny, szczepionki albo antytoksyny. Na przykład alkaloidy wytwarzane przez Claviceps purpurea są produkowane i wykorzystywane w medycynie, natomiast aflatoksyn produkowanych przez Aspergillus flavus należy unikać. Niektóre toksyny wykorzystuje się jako bioinsektycydy. Toksyny są produkowane przez bakterie: Corynebacterium diphtheriae, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Vibrio cholerae, Salmonella, Bacillus thuringiensis oraz grzyby: Aspergillus i Claviceps.

Niezwykłe aminokwasy w żywym organizmie to takie, które (oprócz β-alaniny) mają inną strukturę niż α-aminokwasy lub mają dodatkową grupę funkcyjną. Aminokwasy te mogą znajdować się w komórkach mikroorganizmów zarówno w postaci wolnej, jak i być zawarte w peptydzie. Do tej pory zidentyfikowano ponad 100 aminokwasów. Są to izomeryczne formy D-aminokwasów. Tworząc polipeptydy, często występują one w strukturach polisacharydowych produkowanych przez mikroorganizmy. Niektóre z nich występują w postaci wolnych aminokwasów, di- lub tripeptydów, różnych związków toksycznych lub pełnią rolę antybiotyku, jak azaseryna, azaleucyna, alanozyna, kwas diaminobursztynowy, DON (6-diazo-5-okso-L-norleucyna) i tabtoksyna.

2.3.Mikroorganizmy stosowane w mikrobiologii przemysłowej

2.3.1. Bakterie

W mikrobiologii przemysłowej są powszechnie stosowane trzy grupy organizmów: bakterie, drożdże i grzyby strzępkowe.

Bakterie są wykorzystywane do produkcji metabolitów pierwotnych i wtórnych. Są również stosowane jako komórkowe fabryki do wytwarzania somatostatyny, insuliny, bydlęcego hormonu wzrostu wykorzystywanych w weterynarii, α-1 antytrypsyny, interleukiny-2, czynnika martwicy nowotworów, β-interferonu i γ-interferonu. Escherichia coli jest jednym z najwcześniej i najczęściej stosowanych bakterii do produkcji białek heterologicznych. Już w 1993 r. zrekombinowane procesy Escherichia coli dostarczyły produktów metabolicznych o wartości prawie 5 mld dolarów, tj. insuliny, ludzkiego hormonu wzrostu, interferonów i G-CSF. Do zalet Escherichia coli należą szybki wzrost, szybka ekspresja, łatwość hodowli i modyfikacji genomu, niski koszt i wysoka wydajność produktu. Służy on do masowej produkcji wielu skomercjalizowanych białek, jest doskonały do funkcjonalnej ekspresji białek nieglikozylowanych.

Genetyka Escherichia coli jest znacznie lepiej poznana niż innych mikroorganizmów. Ostatnie postępy w fundamentalnym rozumieniu transkrypcji, translacji i zwijania białek w Escherichia coli, wraz z dostępnością ulepszonych narzędzi genetycznych, czynią tę bakterię bardziej wartościową niż kiedykolwiek w ekspresji złożonych białek eukariotycznych. Jej genom można szybko i precyzyjnie z łatwością modyfikować, kontrola promotora nie jest trudna, a liczba kopii plazmidu może być łatwo zmieniona. System ten charakteryzuje się również zmianą metabolicznego przepływu węgla w zależności od potrzeb, unikaniem wbudowywania analogów aminokwasów, tworzeniem wewnątrzkomórkowych wiązań disiarczkowych i odtwarzalną wydajnością przy kontroli komputerowej. Escherichia coli może gromadzić białka rekombinowane do 80% suchej masy i przetrwać różne warunki środowiskowe. Produkcja rekombinowanego białka w Escherichia coli może być zwiększona przez mutacje, które eliminują wytwarzanie octanu.

Bakterie z rodzaju Bacillus (zazwyczaj Bacillus megaterium, Bacillus subtilis i Bacillus brevis) osiągają wydajność produkcji białek ssaków sięgającą 3 g/l. Staphylococcus carnosus może wytwarzać 2 g/l wydzielanego białka ssaków. Ulepszony producent z bakterii Gram-ujemnych do produkcji białka rekombinowanego został skonstruowany przy użyciu szczepu Ralstonia eutropha. Pod względem tworzenia inkluzji układ ten okazał się lepszy od Escherichia coli. Organofosfohydrolaza, białko podatne na tworzenie inkluzji produkowane w ilości mniejszej niż 100 mg/l przez Escherichia coli, zostało wytworzone w ilości 10 g/l przez Ralstonia eutropha. Inną użyteczną bakterią jest Pseudomonas fluorescens MB101. Ten system wytworzył 4 g/l TNF-α (czynnika martwicy nowotworów).

2.3.2. Drożdże

Drożdże to jednokomórkowe organizmy grzybów eukariotycznych. Często stosuje się je do wytwarzania białek rekombinowanych, których nie wytwarzają dostatecznie dobrze komórki Escherichia coli z powodu problemów z ich składaniem lub potrzebą glikozylacji. Główne zalety układów ekspresyjnych drożdży to:

1) stabilność genetyczna szczepów produkcyjnych;

2) prowadzenie procesu glikozylacji białek;

3) składanie białek;

4) produkcja białek bogatych w S–S;

5) obfity wzrost komórek (wydajność g/l oraz plon komórkowy g/g substratu);

6) szybki wzrost na zdefiniowanych podłożach;

7) obróbka produktu podobna do takiej jak w komórkach ssaków.

Szczepy drożdży są dobrze scharakteryzowane genetycznie. Wiadomo, że dokonują wielu potranslacyjnych modyfikacji syntetyzowanych białek. Są łatwiejsze i tańsze w badaniach i ich zastosowaniu przemysłowym niż komórki owadów lub ssaków i łatwo przystosowują się do warunków fermentacji.

Dwa najczęściej wykorzystywane szczepy drożdży to Saccharomyces cerevisiae i drożdże metylotroficzne Pichia pastoris. Oksydaza glukozowa z Aspergillus niger jest produkowana przez Saccharomyces cerevisiae z wydajnością 9 g/l. Rekombinowane produkty dostępne na rynku wytwarzane przez Saccharomyces cerevisiae to insulina, antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, oksydaza moczanowa, glukagony, czynnik stymulujący kolonizację makrofagów granulocytów (GM-CSF), hirudyna i płytkowy czynnik wzrostu.

Pichia pastoris wykazują silny wzrost oraz indukowaną metanolem ekspresję i sekrecję rekombinowanych białek. Są stosowane do komercyjnej produkcji nieglikozylowanej albuminy surowicy ludzkiej i glikozylowanych szczepionek. Skonstruowano szczepy zdolne do N-glikozylacji typu ludzkiego, a produkty są już w fazie testów klinicznych. Wysokie wydajności białka rekombinowanego można uzyskać za pomocą Pichia pastoris (10 g/l czynnika powodującego martwicę nowotworu, 14,8 g/l żelatyny, 15 g/l mysiego kolagenu, fitazy Escherichia coli i 6 g/l lipazy/acetylotransferazy oraz 6 g/l genu Candida parapsilosis). Białka bakteryjne, takie jak wewnątrzkomórkowy fragment tężcowy C, można wytwarzać z wydajnością 12g/l. Albumina surowicy była produkowana przez Saccharomyces cerevisiae z wydajnością 0,15 g/l, a Pichia pastoris produkuje ją w ilości 10 g/l. Mówi się, że Pichia pastoris może wytworzyć 20–30 g/l rekombinowanych białek. Heterologiczna ekspresja genu u innego gatunku metylotroficznych drożdży Hansenula polymorpha spowodowała produkcję 13,5 g/l fitazy, a innych białek – powyżej 10 g/l. Do zalet drożdży metylotroficznych w porównaniu z Saccharomyces cerevisiae jako gospodarzem klonującym należą:

1) wyższa produktywność białka;

2) unikanie hiperglikozylacji;

3) wzrost przy takich stężeniach metanolu, które zabijają większość innych mikroorganizmów;

4) tania eksploatacja systemu;

5) integracja wielokopii obcego DNA do chromosomalnego DNA, dającego stabilne transformanty.

2.3.3. Grzyby strzępkowe

Grzyby strzępkowe są atrakcyjnymi gospodarzami technologii rekombinacji DNA ze względu na zdolność do wydzielania dużych ilości bioaktywnych białek z przetwarzaniem posttranslacyjnym, takim jak glikozylacja. Aspergillus niger produkuje 25 g/l natywnej glukoamylazy. Obce geny można włączyć przez plazmidy do chromosomów grzybów strzępkowych, gdzie stabilnie integrują się z chromosomem jako powtórzenia tandemowe zapewniające doskonałą długoterminową stabilność genetyczną. Podobnie jak komórki ssaków, grzyby posiadają system komórkowy do translacji białek, fałdowania białek i modyfikacji posttranslacyjnej. Podobnie jak bakterie, grzyby strzępkowe są łatwe w hodowli na podłożach zdefiniowanych. Rozwój genetyczny Aspergillus obejmuje:

1) układy transformacyjne;

2) konstrukty ekspresyjne;

3) ukierunkowaną integrację i manipulację liczbą kopii;

4) promotory;

5) ulepszone projektowanie genów;

6) inżynierię proteaz, wydzielanie i glikozylację;

7) narzędzia do znakowania i wyciszania genów.

1000-krotny wzrost produkcji fitazy osiągnięto w hodowlach Aspergillus niger dzięki zastosowaniu technologii rekombinacji. Rekombinowany Aspergillus oryzae może wytworzyć 2 g/l ludzkiej laktoferyny, a Mucor – 3,3 g/l reniny. Produkcja ludzkiej laktoferyny przez Aspergillus awamori za pośrednictwem technologii rDNA wzrosła do 2 g/l białka zewnątrzkomórkowego. Glukoamylaza Aspergillus niger wklonowana do Aspergillus awamori była produkowana z wydajnością 4,6 g/l. Grzyb Chrysosporium lucknowense został genetycznie przekształcony w niestrzępkowy, mniej lepki szczep wytwarzający małe ilości proteazy, który jest zdolny do wytwarzania bardzo dużych ilości białek heterologicznych. Dyadic International, Inc., firma zajmująca się rozwojem systemu Chrysosporium lucknowense uzyskuje produkcję natywnego białka zewnątrzkomórkowego do 100 g/l.

2.4.Izolacja mikroorganizmów przemysłowych

Mikroorganizmy przemysłowe są z wielu powodów bardzo wygodne do stosowania, zwłaszcza dla inżynierii genetycznej i metabolicznej. Wyekstrahowane z komórek mikroorganizmów przemysłowych łańcuchy DNA mogą być łatwo pocięte przez enzymy restrykcyjne produkowane przez różne inne mikroorganizmy, tworząc odpowiednie fragmenty DNA. Z kolei małe fragmenty DNA można połączyć w cząsteczki DNA wektora za pomocą ligazy DNA, tworząc sztuczne cząsteczki DNA. Wektory można łatwo wprowadzić do gospodarza, którym mogą być wirusy lub bakterie. Są one replikonami, które mogą istnieć w stanie pozachromosomalnym, mogą być przenoszone drogą transdukcji i transformacji. Łatwa jest także ostateczna charakterystyka rekombinowanego klonu.

Strategie przyjęte do izolacji odpowiedniego mikroorganizmu przemysłowego ze środowiska naturalnego można podzielić na dwa typy shotgun i racjonalne (obiektywne). Strategie typu shotgun polegają na tym, że próbki żywych mikroorganizmów zbiera się z biofilmów, materiału zwierzęcego i roślinnego, gleby, ścieków, wody i strumieni odpadów, a także ze środowisk skrajnych oraz niezwykłych siedlisk stworzonych przez człowieka. Następnie bada się je pod kątem pożądanych cech. Bardziej racjonalne (obiektywne) jest pobieranie próbek z określonych miejsc, w których składnikami naturalnej mikroflory są prawdopodobnie organizmy o pożądanych właściwościach. Na przykład mikroorganizm, który degraduje lub transformuje jakiś związek chemiczny, przez co czyni go nieszkodliwym dla środowiska, będzie prawdopodobnie obecny w miejscach zanieczyszczonych tym związkiem. Zatem należy go tam właśnie szukać, a następnie pobrać i wyizolować.

Po pobraniu próbek poważnym problemem jest wybranie właściwego podłoża hodowlanego i warunków hodowli, które należy zastosować do wyizolowania docelowego mikroorganizmu czy mikroorganizmów. W tym celu najczęściej zabija się lub hamuje wzrost organizmów powszechnie występujących w środowisku, a promuje do wzrostu mikroorganizmy rzadkie, niepoznane, o szczególnych cechach. Można także stosować hodowle okresowe namnażające, wzbogacające w populacje bardzo rzadkie lub prowadzić hodowle ciągłe sprzyjające namnażaniu się różnych mikroorganizmów. Sprzyjające warunki zachęcają do wzrostu organizmy docelowe o pożądanych cechach i zwiększają ich ilość przed izolacją i badaniem przesiewowym. Jednakże ten sposób selekcji jest odpowiedni tylko wówczas, gdy pożądana cecha zapewnia przewagę konkurencyjną organizmom. Stosuje się wiele rodzajów podłoży, ale nie ma takiego, które byłoby odpowiednie dla wszystkich mikroorganizmów. Na przykład, jeśli bakterie z próby gleby zostaną wysiane na agar odżywczy (pH 7,0) i inkubowane w temp. 37°C przez 24−48 godz. wyrośnie jedna frakcja tlenowych mezofilnych bakterii. Zgubione zostaną beztlenowce, termofile, alkalifile i acydofile. Powolny wzrost mezofili jak Actinomycetes, a także patogennych mezofili nie jest możliwy na agarze odżywczym. Jeśli wyrośnie mikroorganizm wydzielający substancje antybakteryjne, uniemożliwi wzrost pewnych bakterii mezofilnych. W celu zahamowania wzrostu grzybów do podłoża dodaje się antygrzybowy czynnik (cykloheksamid i nystatynę w stężeniu 50−100 µg/ml). Do izolacji bakterii Gram-ujemnych stosuje się agar MacConkeya zawierający sole kwasów żółciowych, które hamują wzrost bakterii Gram-dodatnich. Do izolacji bakterii sporujących próby przed wysiewem podgrzewa się do temp. 70°C przez 10−15 min w celu zabicia form wegetatywnych i wysiewa je na podłoże M-9 z różnymi źródłami węgla. Bakterie tworzące strzępki rosną na podłożach powoli. Najliczniej występują w glebach rolniczych. Ich liczebność jest największa w sezonie suchym, a znacznie mniejsza w deszczowym. Gleba powietrznie wysuszona przez kilka dni jest idealna do selekcji Actinomycetes. Ta grupa bakterii rozwija się najlepiej na podłożu zawierającym argininę i glicerol. Ponadto dodaje się do niego chloramfenikol (50 µg/ml), nystatynę (50 µg/ml), polimyksynę (50 µg/ml) i penicylinę (100 µg/ml) w celu zahamowania wzrostu grzybów i innych bakterii.

Grzyby są bardzo różnorodne i mają różne wymagania pokarmowe. Podłoże zawierające substancje odżywcze powinno być wzbogacone w związki antybakteryjne, jak penicylinę, streptomycynę, chloramfenikol, kanamycynę i tetracyklinę, w celu zahamowania wzrostu bakterii. Do izolacji grzybów najczęściej stosuje się podłoże PDA (Potato Dextrose Agar) oraz podłoże z różem bengalskim.

Izolacja następcza na odpowiednich podłożach selekcyjnych i w określonych warunkach wzrostu prowadzi do pozyskiwania czystych szczepów rosnących na zestalonym podłożu wzrostowym. Po wyizolowaniu czystych szczepów, każdy z nich musi być poddany badaniom przesiewowym pod kątem pożądanej właściwości, produkcji specyficznych enzymów czy produkcji związków inhibitorowych. Jednak na tym etapie poziom aktywności lub stężenia produktu nie ma większego znaczenia, ponieważ rozwój szczepu można ulepszać różnymi technikami, aby doprowadzić do znacznej poprawy jego wydajności. Wybrane izolaty muszą być również badane pod kątem takich ważnych cech, jak stabilność szczepu oraz, w razie potrzeby, nietoksyczność.

Procedury izolacji i badań przesiewowych są łatwiejsze do zastosowania w poszukiwaniu pojedynczego mikroorganizmu. Znacznie trudniej jest wyodrębnić konsorcja, które razem wykazują poszukiwaną zdolność/charakterystykę i których skład może się zmieniać w czasie. Takie grupy mogą być bardziej wydajne, zwłaszcza tam, gdzie chodzi o zdolność do degradacji złożonego związku, opornego na ataki pojedynczych organizmów.

2.5.Ważniejsze kolekcje szczepów

Na całym świecie istnieje prawie 500 kolekcji mikroorganizmów, w większości niewielkich lub sprofilowanych, które dostarczają odpłatnie pożądanych szczepów lub świadczą inne powiązane usługi objęte porozumieniem. I tak w Wielkiej Brytanii istnieje UKNCC składająca się z kilku kolekcji trzymanych w różnych instytucjach specjalizujących się w kolekcjach bakterii, drożdży, grzybów strzępkowych lub glonów o znaczeniu przemysłowym lub medycznym. W USA istnieje kolekcja scentralizowana American Type Culture Collection (ATCC), która przechowuje wszystkie rodzaje mikroorganizmów. Warto nadmienić, że na długiej liście różnych kolekcji nie ma kolekcji polskich. Szczepy stosowane w badaniach znajdują się w laboratoriach Zakładów Naukowych: Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Wydziału Chemii i Technologii Żywności Politechniki Łódzkiej, Akademii Techniczno-Ekonomicznej we Wrocławiu, Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Instytutu Przemysłu Mleczarskiego w Warszawie, Uniwersytetu Adama Mickiewicza, Uniwersytetu Jagiellońskiego. Listę największych kolekcji mikroorganizmów przedstawiono w tabeli 2.2.

W sumie we wszystkich kolekcjach Global Catalogue of Microorganisms w 2019 r. znajdowały się 232 gatunki (580 szczepów) Cyanobacteria, 20 797 gatunków (145 963 szczepy) Bacteria, 1422 gatunki (3442 szczepy) Archaea, 29 290 gatunków (226 152 szczepy) grzybów, 4435 gatunków (15 144 szczepy) glonów, 33 gatunki (296 szczepów) wirusów, 299 gatunków (456 szczepów) fagów, 2030 plazmidów, 238 gatunków (755 szczepów) Protozoa oraz 1833 gatunki (7428 szczepów) innych organizmów. Łącznie w GCM znajduje się 54 736 gatunków (447 512 szczepów) mikroorganizmów.

Najliczniejsze są szczepy związane z człowiekiem, roślinami oraz występujące w próbkach gleby (tab. 2.3).

Tabela 2.2. Lista największych kolekcji mikroorganizmów

Lp.

Akronim

Nazwa instytucji

Kraj

Adres internetowy

1

ATCC

American Type Culture Collection

USA

www.atcc.org/

2

BCRC

Bioresource Collection and Research Center/Food Industry Research and Development Institute

Chiny Taipei

www.bcrc.firdi.org.tw

3

CAIM

Collection of Aquatic Important Microorganisms/CIAD/Mazatlán Unit for Aquaculture and Environmental Management

Meksyk

www.ciad.mx/caim

4

CCM

Czech Collection of Microorganisms/Masaryk University Czech

Czechy

http://sci.muni.cz/ccm/index.html

5

CCUG

Culture Collection University of Gothenburg

Szwecja

www.ccug.se

6

CECT

Spanish Type Culture Collection/University of Valencia

Hiszpania

www.cect.org

7

CGMCC

China General Microbiological Culture Collection Center

Chiny

www.cgmcc.net

8

CICC

China Center of Industrial Culture Collection

Chiny

www.china-cicc.org

9

CIP

Collection de l’Institut Pasteur

Francja

https://catalogue-crbip.pasteur.fr

10

ICMP

International Collection of Microorganisms from Plants

Nowa Zelandia

www.landcareresearch.co.nz/icmp

11

JCM

Japan Collection of Microorganisms/RIKEN BioResource Research Center

Japonia

http://icm.brc.rike.jp/

12

KCTC

Korean Collection for Type Cultures, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

Korea

http://kctc.kribb.re.kr

13

KMM

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far-Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Rosja

niedostępny

14

NBRC

Biological Resource Center/National Institute of Technology and Evaluation

Japonia

www.nite.go.jp/en/nbrc/index.html

15

NCAIM

National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms

Węgry

http://ncaim.uni-corvinus.hu/

16

NCTC

National Collection of Type Cultures

Anglia

www.pheculturecollections.org.uk/

17

PCU

Pharmaceutical Sciences Chulalongkorn University Culture Collection/Chulalongkorn University

Tajlandia

niedostępny

18

TBRC

Thailand Bioresource Research Center/National Center for Genetic Engineering and Biotechnology

Tajlandia

www.tbrcnetwork.org

19

TISTR

TISTR Culture Collection/Bangkok MIRCEN

Tajlandia

www.tistr.or.th/tistr_culture

20

VKM

All-Russian Collection of Microorganisms

Rosja

http://www.vkm.ru/