Dane oryginału:

GENOMES, 5TH EDITION by Terry A. Brown

© 2023 by Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC

Authorised translation from the English language edition published by CRC Press, a member of the Taylor & Francis Group LLC

ZESPÓŁ TŁUMACZY

z Instytutu Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski

Aleksandra Dmochowska (rozdz. 7, 8, 9, 12, 14), Agnieszka Dzikowska (rozdz. 1, 10, 11, 13), Paweł Golik (wstęp, przedmowa, rozdz. 16, 17, 18), Anna Grzelak (rozdz. 4), Witold Jachymczyk (rozdz. 15), Michał Koper (rozdz. 4, 12, 15), Karolina Łabędzka-Dmoch (rozdz. 8), Katarzyna Tońska (rozdz. 2, 3, 5, 6), Monika Zakrzewska-Płaczek (rozdz. 7)

Projekt okładki i stron tytułowych Anna Kulikowska

Ilustracja na okładce freepik.com/peatcommen

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Redakcja Joanna Forysiak

Korekta Anna Marecka

Koordynator produkcji Adam Krajewski

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN S.A.:
Michał Latusek

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl.

Polska Izba Książki

Copyright © for a Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 2001, 2009, 2019, 2025

ISBN 978-83-01-24318-0

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2025 r. (Wydanie czwarte)

Warszawa 2025

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Fragment

Przedmowa do wydania polskiego

Przedmowa

CZĘŚĆ I. Jak bada się genomy

1. Genomy, transkryptomy i proteomy

1.1. DNA

Geny zbudowane są z DNA

DNA jest polimerem zbudowanym z nukleotydów

Odkrycie podwójnej helisy

Łączenie się zasad w pary i asocjacja warstwowa stabilizują podwójną helisę

Podwójna helisa jest strukturą elastyczną

1.2. RNA i transkryptom

RNA jest drugim rodzajem polinukleotydu

Rodzaje RNA w komórce

Wiele RNA jest syntetyzowanych jako cząsteczki prekursorowe

Różne definicje transkryptomu

1.3. Białka i proteom

Cztery hierarchiczne poziomy struktury białka

Różnorodność białek wynika z różnorodności aminokwasów

Powiązanie transkryptomu z proteomem

Kod genetyczny nie jest uniwersalny

Powiązanie proteomu z biochemią komórki

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

2. Analiza DNA

2.1. Enzymy służące do manipulacji DNA

Sposób działania polimerazy DNA zależnej od matrycy

Typy polimeraz DNA stosowane w badaniach naukowych

Endonukleazy restrykcyjne umożliwiają cięcie cząsteczek DNA w ściśle określonych pozycjach

Do analizy wyników trawienia restrykcyjnego wykorzystuje się elektroforezę w żelu

Fragmenty DNA można identyfikować metodą hybrydyzacji Southerna

Ligazy łączą ze sobą fragmenty DNA

Enzymy modyfikujące końce

2.2. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Przeprowadzanie PCR

Przyrost ilości produktu w reakcji PCR można śledzić

PCR ma wiele różnorodnych zastosowań

2.3. Klonowanie DNA

Dlaczego klonowanie jest ważne?

Najprostsze wektory do klonowania są oparte na plazmidach z E. coli

Jako wektorów do klonowania można także użyć bakteriofagów

Wektory dla dłuższych fragmentów DNA

DNA można klonować w organizmach innych niż E. coli

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

3. Mapowanie genomów

3.1. Dlaczego mapa genomu jest ważna

Mapy genomu są potrzebne do sekwencjonowania bardziej złożonych genomów

Mapy genomowe to nie tylko pomoc przy sekwencjonowniu

3.2. Markery do mapowania genetycznego

Pierwszymi stosowanymi markerami były geny

RFLP i SSLP są przykładami markerów DNA

Polimorfizmy punktowe są najbardziej użytecznymi markerami DNA

3.3. Podstawy mapowania genetycznego

Podstawy dziedziczenia i odkrycie sprzężenia

Częściowe sprzężenie można wyjaśnić zachowaniem chromosomów w czasie mejozy

Od częściowego sprzężenia do mapowania genetycznego

3.4. Przeprowadzanie analizy sprzężeń w różnych typach organizmów

Analiza sprzężeń, gdy możliwe są planowane eksperymenty hodowlane

Mapowanie genów przez analizę rodowodów u człowieka

Mapowanie genetyczne u bakterii

Ograniczenia analizy sprzężeń

3.5. Mapowanie fizyczne przez bezpośrednie badanie cząsteczek DNA

Konwencjonalne mapowanie restrykcyjne można stosować tylko do małych cząsteczek DNA

Mapowanie optyczne pozwala na lokalizację miejsc restrykcyjnych w dłuższych cząsteczkach DNA

Mapowanie optyczne z sondami fluorescencyjnymi

Dalsze innowacje poszerzają zakres mapowania optycznego

3.6. Mapowanie fizyczne przez przypisywanie markerów do fragmentów DNA

Każda unikalna sekwencja może być STS

Fragmenty DNA do mapowania STS można uzyskać jako hybrydy radiacyjne

Jako odczynnika do mapowania można także użyć biblioteki klonów

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

4. Sekwencjonowanie genomów

4.1. Metody sekwencjonowania DNA

Sekwencjonowanie metodą terminacji łańcucha produktów reakcji PCR

Sekwencjonowanie w technologii Illumina jest najbardziej powszechną metodą sekwencjonowania krótkich odczytów

Opracowano różne metody sekwencjonowania krótkich odczytów

Metoda sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym umożliwia otrzymanie odczytów o długości do 200 kb

Obecnie najdłuższe odczyty pozwala uzyskać metoda sekwencjonowania w technologii Nanopore

4.2. Jak zsekwencjonować genom

Możliwości strategii shotgun udowodniono, sekwencjonując genom Haemophilus influenzae

Strategię shotgun wykorzystano do zsekwencjonowania wielu genomów prokariotycznych

Sekwencjonowanie genomów eukariotycznych strategią shotgun wymaga zastosowania zaawansowanych programów do składania

Od kontigów do rusztowań

Czym jest sekwencja genomu i czy zawsze jej potrzebujemy?

4.3. Sekwencjonowanie genomu człowieka

Projekt Poznania Genomu Człowieka – sekwencjonowanie genomu w czasach heroicznych

Genom człowieka – sekwencjonowanie genomów współcześnie

Genom neandertalczyka: poznanie genomu wymarłego gatunku z wykorzystaniem genomu człowieka jako sekwencji odniesienia

Genom człowieka – nowe wyzwania

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

5. Anotacja genomu

5.1. Lokalizowanie genów w sekwencjach DNA przez komputerową analizę sekwencji

Obszary kodujące genów są otwartymi ramkami odczytu

Proste skanowania ORF są mniej wydajne dla większych DNA eukariotycznych

Szukanie genów niekodujących RNA

Poszukiwanie homologii i genomika porównawcza nadają śledzeniu sekwencji nowy wymiar

5.2. Anotacja genomu przez analizę transkryptów genów

Test hybrydyzacyjny pozwala ustalić, czy fragment zawiera sekwencję ulegającą ekspresji

Istnieją metody dokładnego mapowania końców transkryptów

Granice ekson–intron można dokładnie zlokalizować

5.3. Anotacja przez całogenomowe mapowanie RNA

Mikromacierze dachówkowe umożliwiają mapowanie transkryptów na chromosomach lub całych genomach

Sekwencje transkryptów można zmapować bezpośrednio w genomie

Uzyskiwanie sekwencji transkryptu metodami SAGE i CAGE

5.4. Przeglądarki genomów

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Zadania problemowe

Literatura uzupełniająca

6. Ustalanie funkcji genu

6.1. Komputerowa analiza funkcji genu

Homologia odzwierciedla związki ewolucyjne

Analiza homologii może dostarczyć informacji o funkcji całego genu lub jego segmentów

Identyfikacja domen białkowych może pomóc przypisać funkcję nieznanemu genowi

Przypisywanie funkcji genom wymaga jednolitej terminologii

6.2. Przypisywanie funkcji przez inaktywację i nadekspresję genu

Analiza funkcjonalna przez inaktywację genu

Inaktywacja genów poprzez edycję genomu

Geny można inaktywować przez rekombinację homologiczną

Inaktywacja genu poprzez znakowanie transpozonem i interferencję RNA

Do określania funkcji można także wykorzystać nadekspresję genu

Fenotypowy efekt inaktywacji jest czasem trudny do zaobserwowania

6.3. Zrozumienie funkcji genu przez badania wzoru ekspresji i produktu białkowego

Do wprowadzania określonych zmian w genie i kodowanym przez niego białku można wykorzystać CRISPR

Inne metody ukierunkowanej mutagenezy

6.4. Wykorzystanie konwencjonalnej analizy genetycznej do identyfikacji funkcji genu

Identyfikacja ludzkich genów związanych z chorobami dziedzicznymi

Całogenomowe badania asocjacyjne także pozwalają na identyfikację genów związanych z chorobami i innymi cechami

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Zadania problemowe

Literatura uzupełniająca

CZĘŚĆ II. Anatomia genomów

7. Eukariotyczne genomy jądrowe

7.1. Genomy jądrowe znajdują się w chromosomach

Chromosomy są zbudowane z DNA i białek

Specyficzne właściwości chromosomów metafazowych

Centromery i telomery zawierają charakterystyczne sekwencje DNA

7.2. Cechy genetyczne genomów jądrowych

Liczby genów mogą być mylące

Geny nie są rozmieszczone równomiernie w obrębie genomu

Odcinek genomu człowieka

Genom drożdży jest bardzo zwarty

Organizacja genów u innych eukariontów

Rodziny genów

Pseudogeny i inne relikty ewolucyjne

7.3. Zawartość powtarzającego się DNA w eukariotycznych genomach jądrowych

DNA powtórzony tandemowo znajduje się w centromerach i innych miejscach w chromosomach eukariotycznych

Minisatelity i mikrosatelity

Powtórzenia rozproszone

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

8. Genomy prokariontów i organelli eukariotycznych

8.1. Właściwości fizyczne genomów prokariotycznych

Tradycyjny obraz chromosomu prokariotycznego

Niektóre bakterie mają genomy liniowe lub wieloczęściowe

8.2. Właściwości genetyczne genomów prokariotycznych

Organizacja genów w genomie E. coli K12

Operony są cechą charakterystyczną genomów prokariotycznych

Rozmiary genomów i liczba genów u prokariontów różnią się w zależności od złożoności biologicznej

Rozmiary genomów i liczba genów różnią się w obrębie poszczególnych gatunków

Rozróżnienie między gatunkami prokariotycznymi rozmywa się jeszcze bardziej za sprawą poziomego transferu genów

Metagenomy opisują członków społeczności

8.3. Eukariotyczne genomy organellarne

Teoria endosymbiozy wyjaśnia pochodzenie genomów organellarnych

Fizyczne i genetyczne cechy genomów organellarnych

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

9. Genomy wirusów i ruchome elementy genetyczne

9.1. Genomy bakteriofagów i wirusów eukariotycznych

Genomy bakteriofagów mają zróżnicowane struktury i organizację

Strategie replikacji genomów bakteriofagowych

Struktury i strategie replikacji eukariotycznych genomów wirusowych

Niektóre retrowirusy powodują nowotwory

Genomy na granicy życia

9.2. Ruchome elementy genetyczne

Transpozony RNA z długimi końcowymi powtórzeniami są spokrewnione z retroelementami wirusowymi

Niektóre transpozony RNA nie mają LTR

Transpozony DNA występują powszechnie w genomach prokariotycznych

Transpozony DNA są mniej powszechne w genomach eukariotycznych

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

CZĘŚĆ III. Jak działają genomy?

10. Dostępność genomu

10.1. Wewnątrz jądra

Jądro ma uporządkowaną strukturę wewnętrzną

Chromosomowy DNA wykazuje różne stopnie upakowania

Macierz jądrowa jest strukturą dynamiczną

Każdy chromosom zajmuje w jądrze swoje własne terytorium

Każdy chromosom zawiera grupy domen powiązanych topologicznie

Izolatory zapobiegają przekazywaniu informacji pomiędzy segmentami chromosomowego DNA

10.2. Modyfikacje nukleosomów a ekspresja genomu

Acetylacja histonów wpływa na wiele funkcji jądrowych, łącznie z ekspresją genomu

Deacetylacja histonów prowadzi do zablokowania aktywnych rejonów genomu

Acetylacja nie jest jedynym rodzajem modyfikacji histonów

Remodelowanie nukleosomów również wpływa na ekspresję genomu

10.3. Modyfikacje DNA a ekspresja genomu

Wyciszanie genomu przez metylację DNA

Metylacja wiąże się z piętnowaniem genomowym i inaktywacją chromosomu X

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

11. Rola białek wiążących DNA w ekspresji genomu

11.1. Metody badania białek wiążących DNA i ich miejsc wiązania

Krystalografia rentgenowska dostarcza danych dotyczących struktury dla każdego białka, które uda się skrystalizować

Spektroskopia NMR jest wykorzystywana do badania struktury małych białek

Badanie spowolnienia migracji w żelu pozwala zidentyfikować fragmenty DNA wiążące białka

Testy ochrony przed modyfikacją precyzyjniej określają położenie miejsc wiążących białko

Nukleotydy bezpośrednio oddziałujące z białkiem można zidentyfikować, stosując test zakłócania modyfikacji

Wyszukiwanie w całym genomie miejsc wiążących białka

11.2. Specyficzne cechy białek wiążących DNA

Domena typu helisa–skręt–helisa występuje w białkach prokariotycznych i eukariotycznych

W białkach eukariotycznych często występują palce cynkowe

Inne rodzaje domen wiążących kwasy nukleinowe

11.3. Oddziaływanie między DNA a wiążącymi je białkami

Oddziaływania między DNA a białkami

Bezpośredni odczyt informacji zawartej w sekwencji nukleotydów

Konformacja helisy wpływa na oddziaływania z białkami

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

12. Transkryptomy

12.1. Składniki transkryptomu

mRNA jest mało liczną, ale za to złożoną częścią transkryptomu

Krótkie niekodujące RNA mają różne funkcje

Długie niekodujące RNA są zagadkowymi transkryptami

12.2. Transkryptomika – czyli katalogowanie transkryptomów komórek i tkanek

Do badania zawartości transkryptomów wykorzystuje się analizy na mikromacierzach i sekwencjonowanie RNA

Analiza pojedynczych komórek rozszerza możliwości transkryptomiki

Transkryptomika przestrzenna umożliwia mapowanie transkryptów bezpośrednio w tkankach i komórkach

12.3. Synteza składników transkryptomu

Polimerazy RNA są maszynami molekularnymi do wytwarzania RNA

Miejsca rozpoczęcia transkrypcji są wskazywane przez sekwencje promotorowe

Synteza RNA bakteryjnych jest regulowana przez białka represorowe i aktywatorowe

Synteza bakteryjnego RNA jest również regulowana przez kontrolowanie terminacji transkrypcji

Synteza eukariotycznego RNA jest regulowana głównie przez białka aktywatorowe

12.4. Wpływ składania RNA na zawartość transkryptomu

Szlak wycinania intronów z eukariotycznych pre-mRNA

Proces składania RNA musi mieć wysoki stopień precyzji

Elementy wzmacniaczy i wyciszaczy determinują szlaki alternatywnego składania RNA

Kolisty RNA powstaje w wyniku wstecznego składania RNA

12.5. Wpływ modyfikacji chemicznych na skład transkryptomu

Redagowanie RNA zmienia właściwości kodujące niektórych transkryptów

Modyfikacje chemiczne, które nie zmieniają sekwencji mRNA

12.6. Degradacja składników transkryptomu

Znanych jest kilka procesów nieswoistego rozkładu RNA

Wyciszanie RNA zidentyfikowano po raz pierwszy jako sposób niszczenia inwazyjnego wirusowego RNA

MikroRNA regulują ekspresję genomu, powodując degradację konkretnych docelowych mRNA

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

13. Proteomy

13.1. Badanie składu proteomu

Etap rozdziału białek w analizie profili białkowych

Etap identyfikacji białek w analizie profili białkowych

Porównywanie składu dwóch proteomów

Analityczne mikromacierze białkowe są alternatywną metodą w analizie profili białkowych

13.2. Identyfikacja białek, które oddziałują ze sobą

Identyfikacja par oddziałujących ze sobą białek

Identyfikacja składników kompleksów zbudowanych z wielu białek

Identyfikacja interakcji funkcjonalnych

Mapy interakcji białko–białko pokazują oddziaływania w proteomie

13.3. Synteza i degradacja składników proteomu

Rybosomy są molekularnymi maszynami do produkcji białek

Bakterie w czasie stresu inaktywują rybosomy, by zredukować swój proteom

Czynniki inicjacyjne pośredniczą w przebudowie proteomu eukariotycznego na dużą skalę

Translacja poszczególnych mRNA może być również regulowana specyficznie

Degradacja składników proteomu

13.4. Wpływ procesów dojrzewania białek na skład proteomu

Sekwencja aminokwasowa białka zawiera instrukcję jego fałdowania

Niektóre białka podlegają cięciu proteolitycznemu

Istotne zmiany w aktywności białka mogą wynikać z modyfikacji chemicznych

13.5. Wyjść poza proteom

Metabolom jest kompletnym zbiorem metabolitów występujących w komórce

Biologia systemów umożliwia opisanie aktywności komórki w sposób zintegrowany

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

14. Ekspresja genomu w kontekście komórek i organizmów

14.1. Odpowiedź genomu na sygnały zewnętrzne

Przesyłanie sygnału przez import zewnątrzkomórkowego związku sygnalizującego

Białka receptorowe przenoszą sygnały przez błony komórkowe

Niektóre szlaki przekazywania sygnału mają tylko kilka etapów między receptorem a genomem

Niektóre szlaki przekazywania sygnału mają wiele etapów między receptorem a genomem

Niektóre szlaki przekazywania sygnału działają za pośrednictwem przekaźników wtórnych

14.2. Zmiany w aktywności genomu prowadzące do różnicowania komórkowego

Niektóre procesy różnicowania obejmują zmiany w strukturze chromatyny

Typy płciowe drożdży są determinowane przez konwersję genu

Rearanżacje genomu są odpowiedzialne za różnorodność immunoglobulin i receptorów komórek T

14.3. Zmiany w aktywności genomu leżące u podstaw rozwoju

Bakteriofag λ: przełącznik genetyczny umożliwia dokonanie wyboru między alternatywnymi szlakami rozwojowymi

Sporulacja u Bacillus: koordynacja aktywności dwóch odrębnych typów komórek

Caenorhabditis elegans: podstawa genetyczna informacji pozycyjnej i określania losu komórek

Muszka owocowa: przekształcenie informacji pozycyjnej w plan segmentacji ciała

Udział genów homeotycznych jest uniwersalną cechą rozwoju wyższych eukariontów

Geny homeotyczne leżą również u podstaw rozwoju u roślin

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

CZĘŚĆ IV. Replikacja i ewolucja genomów

15. Replikacja genomu

15.1. Topologia replikacji genomu

Struktura podwójnej helisy utrudnia proces replikacji

Doświadczenie Meselsona–Stahla dowiodło semikonserwatywności replikacji

Odkrycie topoizomeraz DNA pozwoliło na rozwiązanie problemu topologicznego

Wariacje na temat replikacji semikonserwatywnej

15.2. Faza inicjacji replikacji genomu

Inicjacja replikacji DNA w komórkach E. coli

Obszary inicjacji replikacji DNA w komórkach drożdży są równie dobrze poznane

Identyfikacja miejsc inicjacji replikacji DNA w komórkach wyższych eukariontów okazała się znacznie trudniejsza

15.3. Zjawiska zachodzące w obrębie widełek replikacyjnych

Polimerazy DNA to maszyny molekularne produkujące (i degradujące) DNA

Ograniczenia polimeraz DNA utrudniające replikacje genomu

Do ukończenia replikacji nici opóźnionej konieczne jest połączenie fragmentów Okazaki

15.4. Terminacja replikacji genomu

Terminacja replikacji genomu E. coli zachodzi w ściśle określonym obszarze

Zakończenie procesu replikacji genomu

W niektórych komórkach to telomeraza kończy replikację cząsteczek chromosomowego DNA

Wpływ długości telomerów na procesy starzenia komórkowego i nowotworzenia

Unikalne rozwiązanie problemu skracania telomerów w komórkach Drosophila

15.5. Regulacja replikacji genomu eukariotycznego

Replikacja genomu wymaga synchronizacji z cyklem komórkowym

Warunkiem przejścia punktu kontrolnego G1-S jest udzielenie miejscom inicjacji „licencji na replikację”

Nie wszystkie miejsca inicjacji replikacji są wykorzystywane jednocześnie

Komórka ma różne opcje na wypadek uszkodzenia genomu

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

16. Rekombinacja i transpozycja

16.1. Rekombinacja homologiczna

Modele rekombinacji homologicznej Hollidaya i Meselsona–Raddinga

Model pęknięć dwuniciowych w rekombinacji homologicznej

RecBCD jest najważniejszym szlakiem rekombinacji homologicznej u bakterii

E. coli może także przeprowadzać rekombinację homologiczną za pomocą alternatywnych szlaków

Szlaki rekombinacji homologicznej u eukariontów

16.2. Rekombinacja umiejscowiona

Bakteriofag λ wykorzystuje rekombinację umiejscowioną podczas cyklu lizogennego infekcji

Rekombinacja umiejscowiona jest pomocnym narzędziem w konstruowaniu roślin modyfikowanych genetycznie

16.3. Transpozycja

Transpozycja replikatywna i konserwatywna transpozonów DNA

Retroelementy podlegają transpozycji replikatywnej za pośrednictwem kopii RNA

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

17. Mutacje i naprawa DNA

17.1. Przyczyny mutacji

Błędy w replikacji są źródłem mutacji punktowych

Błędy w replikacji mogą też doprowadzić do mutacji typu insercji i delecji

Mutacje są również wywoływane przez mutageny chemiczne i fizyczne

17.2. Naprawa mutacji i innych typów uszkodzeń DNA

Systemy naprawy bezpośredniej wypełniają pęknięcia i korygują niektóre rodzaje modyfikacji nukleotydów

Wycinanie zasad naprawia wiele rodzajów uszkodzonych nukleotydów

Naprawa przez wycinanie nukleotydów koryguje bardziej rozległe uszkodzenia

Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów poprawia błędy replikacji

Pęknięcia jedno- i dwuniciowe mogą być naprawiane

Niektóre uszkodzenia DNA mogą być naprawiane przez rekombinację homologiczną

Uszkodzenia DNA mogą być pomijane podczas replikacji genomu

Defekty w naprawie DNA stanowią podłoże chorób człowieka, w tym nowotworów

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

18. Drogi ewolucji genomów

18.1. Genomy: pierwszych 10 miliardów lat

Pierwsze systemy biochemiczne opierały się na RNA

Pierwsze genomy zbudowane z DNA

W jakim stopniu życie jest niepowtarzalne?

18.2. Ewolucja coraz bardziej złożonych genomów

Sekwencje genomów kryją wiele śladów dawnych duplikacji genów

Duplikacja genu może zajść na skutek wielu różnych procesów

Możliwa jest też duplikacja całego genomu

W różnych genomach, w tym w genomie człowieka, można odnaleźć też ślady mniejszych duplikacji

Prokarionty i eukarionty mogą nabywać geny od innych gatunków

W ewolucji genomu następują również rearanżacje sekwencji istniejących genów

Konkurencyjne hipotezy wyjaśniają pochodzenie intronów

Ewolucja epigenomu

18.3. Genomy: ostatnich 6 milionów lat

Genomy człowieka i szympansa są bardzo do siebie podobne

Paleogenomika pomaga zrozumieć niedawną ewolucję genomu człowieka

18.4. Genomy dziś: zróżnicowanie populacji

Pochodzenie HIV i AIDS

Pierwsze migracje ludzi z Afryki

Różnorodność genomów ułatwia uprawę roślin

Podsumowanie

Krótkie pytania otwarte

Pytania problemowe

Literatura uzupełniająca

Słowniczek

Przypisy

Pozostałe rozdziały dostępne w pełnej wersji e-booka.

Przedmowa do wydania polskiego

Poprzednie wydanie Genomów T.A. Browna ukazało się na polskim rynku w roku 2019. Obecna edycja jest kontynuacją pracy nad tłumaczeniem tego podręcznika zapoczątkowanej przez prof. Piotra Węgleńskiego. W tak dynamicznie rozwijającej się dziedzinie wiedzy, jaką jest genomika, wiele się przez ten czas wydarzyło i obecne, piąte już wydanie podręcznika zmiany te uwzględnia. Szczególnie istotne jest, jak w kolejnych wydaniach nacisk przesuwany jest z opisu pojedynczych genów czy białek na funkcjonowanie genomu jako całego złożonego systemu, zgodnie z kierunkiem, w jakim podąża współczesna nauka.

Ciągłe postępy technik sekwencjonowania i analizowania DNA przyczyniły się do tego, że badanie genów i genomów odciska swe piętno na coraz większej liczbie różnych dziedzin nauki i życia codziennego. O ile w roku 2015 szeroko dyskutowanym sukcesem była publikacja sekwencji 1000 genomów ludzkich reprezentujących różne regiony całego świata, o tyle obecnie dla samej Polski dysponujemy tysiącami poznanych kompletnych sekwencji DNA. Analiza genomu coraz śmielej wkracza do medycyny, zwłaszcza w onkologii staje się istotnym elementem w diagnozowaniu choroby i planowaniu leczenia, przybliżając nas do idei medycyny spersonalizowanej – dostosowanej do organizmu konkretnego pacjenta. Pozostając przy medycynie – pod koniec 2023 r. zatwierdzone zostały pierwsze, już nie eksperymentalne terapie chorób genetycznych (anemii sierpowatokrwinkowej i talasemii) wykorzystujące opracowane w ostatniej dekadzie techniki redagowania genomu za pomocą opisanego w obecnym wydaniu Genomów systemu CRISPR/Cas9. Poznanie reguł ewolucji genomów, a także mechanizmów ekspresji genów okazało się kluczowe podczas pandemii COVID-19, przyczyniając się do błyskawicznego opracowania opartych na mRNA szczepionek, które uratowały życie i zdrowie milionów osób. Do genomiki sięgamy także w badaniach historycznych i archeologicznych, gdzie analiza kopalnego DNA rozwiązuje kolejne zagadki dawnych dziejów. Pojawia się też wiele prywatnych firm, które oferują za coraz bardziej przystępną cenę każdej chętnej osobie badania genomu w celu poznania dziedzictwa genetycznego i podejmowania decyzji związanych ze zdrowiem i stylem życia, nie zawsze jednak uczciwie wyjaśniając, co można na podstawie analizy genomu poznać, a czego z niego nie wyczytamy.

Wiedza o badaniu i działaniu genomów stała się zatem kluczowa, nie tylko dla osób zgłębiających nauki o życiu podczas studiów czy pracy naukowej, ale także dla wszystkich, którzy pragną lepiej zrozumieć otaczający nas świat. Najnowsze wydanie Genomów może być świetnym wprowadzeniem do nowoczesnej genetyki i genomiki dla każdej zainteresowanej osoby mającej podstawy wyniesione z liceum i stanowić podstawę kursu akademickiego, sięga jednak przy tym na tyle głęboko, że będzie też przydatnym źródłem wiedzy dla osób zawodowo zajmujących się naukami biologicznymi, rolniczymi i medycznymi, a także dziennikarstwem naukowym.

Przedmowa

Szybki postęp wiedzy, który dokonuje się w badaniach genomów, zawdzięczamy w znacznej mierze rozwojowi coraz skuteczniejszych i wydajniejszych metod sekwencjonowania. Metody oparte na krótkich odczytach są obecnie tak łatwe i niedrogie, że możliwe stało się wielokrotne sekwencjonowanie różnych wariantów tego samego genomu, czego przykładem jest projekt mający na celu zsekwencjonowanie miliona ludzkich genomów, który ma zakończyć się w 2028 r. Udoskonalenie metod opartych na długich odczytach doprowadziło do uzyskania po raz pierwszy naprawdę kompletnej sekwencji genomu człowieka i stoi u podstaw ambitnych planów uzyskania wysokiej jakości sekwencji wszystkich gatunków eukariontów zamieszkujących naszą planetę. Równie znaczne postępy dokonały się w przypadku metod badania transkryptomów i proteomów, pozwalając nam lepiej zrozumieć mechanizmy wykorzystywania informacji zapisanej w sekwencji DNA podczas ekspresji genomu, w tym zwłaszcza kluczową rolę składania i modyfikacji chemicznych RNA w zwiększeniu potencjału funkcji biologicznych zawartych w genomie.

Genomy 5 zachowują układ podobny do stosowanych w poprzednich wydaniach, książka jest podzielona na cztery części: sekwencjonowanie genów wraz z przypisaniem im określonych białek, anatomia genomu, funkcjonowanie genomu oraz replikacja i ewolucja genomów. Kolejność rozdziałów pozostaje niezmieniona, z jednym wyjątkiem: rozdział poświęcony rekombinacji znajduje się teraz przed opisem procesów mutagenezy i naprawy, co pozwala na lepsze omówienie kluczowej roli rekombinacji w naprawie DNA. Co ważne, postępy wiedzy umożliwiły opisanie procesów transkrypcji i translacji zachodzących w całych genomach, a nie na podstawie procesów ekspresji pojedynczych genów.

Chciałbym podziękować Chuckowi Crumly’emu i Jordanowi Wearingowi z Garland Science za ich nieustający entuzjazm dla Genomów i pomoc podczas pisania i planowania książki oraz Matthew McClementsowi za jego znakomite ilustracje. Podobnie jak poprzednie wydania Genomy 5 nie byłyby nigdy ukończone, gdyby nie pomoc mojej żony Keri. Podziękowania zamieszczone w pierwszym wydaniu: „jeżeli znalazłeś tę książkę użyteczną, to powinieneś podziękować Keri, ponieważ to jej zawdzięczamy, że książka została napisana”, są aktualne również dla tego wydania.

Uwagi dla czytelników

Starałem się uczynić piąte wydanie Genomów tak przyjaznym, jak to tylko możliwe. Książka zawiera wiele rozwiązań mających pomóc Czytelnikowi i sprawić, by była skuteczną pomocą w nauce i uczeniu.

Organizacja książki

Genomy 5 są podzielone na cztery części.

Część 1 – Badanie genomów. Pierwszy rozdział tej części zapoznaje Czytelnika z genomami, transkryptomami i proteomami, podczas gdy rozdział drugi jest poświęcony metodom, takim jak PCR i klonowanie, które były używane w pregenomowej erze do badania pojedynczych genów. W rozdziale trzecim opisane są techniki służące do sporządzania map genetycznych i fizycznych, co jest ciągle istotne w wielu projektach poświęconych badaniu genomów. W rozdziale 4 omówiono metody pozyskiwania sekwencji DNA i ich składania w celu otrzymania wstępnych i ostatecznych sekwencji genomów. Dwa następne rozdziały są poświęcone metodom analizy sekwencji genomów: rozdział 5 identyfikowaniu genów i innych właściwości genomów, a rozdział 6 funkcjonalnej analizie genów, które zostały zidentyfikowane.

Część 2 – Anatomia genomów zawiera przegląd rozmaitych typów genomów, które występują na naszej planecie. W rozdziale 7 przedstawione są eukariotyczne genomy jądrowe z uwypukleniem genomu ludzkiego, co jest podyktowane znaczeniem jego poznania dla tak wielu obszarów badań, a także tym, że wśród wszystkich zsekwencjonowanych genomów jest on najlepiej poznany. Rozdział 8 zajmuje się sekwencjami genomów organizmów prokariotycznych oraz genomów organellarnych, które zostały tu włączone ze względu na prokariotyczne pochodzenie. W rozdziale 9 opisano genomy wirusów i ruchomych elementów genetycznych, które włączono w to miejsce, jako że niektóre ich rodzaje są spokrewnione z genomami wirusowymi.

Część 3 – Ekspresja genomów. W części tej opisano proces wykorzystywania przez komórki informacji zapisanej w jej genomie. W rozdziale 10 przedstawiono niezwykle ważny problem wpływu upakowania DNA w chromatynie na ekspresję różnych części genomu, a w rozdziale 11 opisano kluczowę rolę białek wiążących się z DNA w procesie ekspresji określonych części genomu, które są aktywne w określonym czasie. W rozdziale 12 przenosimy się do transkryptomów, przedstawiamy, jak są badane, jaki mają skład i w jaki sposób są syntetyzowane i utrzymywane. W rozdziale 13 znajduje się opis proteomów i proteomiki, a rozdział 14 zawiera podsumowanie tej części książki, czyli opis funkcjonowania genomów w komórkach i organizmach oraz ich odpowiedzi na sygnały dochodzące spoza komórki, a także ich rolę w kierowaniu reakcjami biochemicznym leżącymi u podstaw procesów różnicowania i rozwoju organizmów.

Część 4 – Pytanie, jak genomy się replikują i ewoluują łączy zagadnienia replikacji DNA, rekombinacji i mutacji ze stopniową ewolucją genomów na przestrzeni czasu. W rozdziałach 15–17 opisane są molekularne procesy odpowiedzialne za replikację, rekombinację, mutacje i naprawę DNA, podczas gdy w rozdziale 18 przedstawiono sposoby, w jakie te procesy ukształtowały strukturę i genetyczny skład genomów w całym okresie ewolucji. Rozdział 18 kończy się kilkoma przykładami pokazującymi, jak filogenomika molekularna i genomika populacyjna są wykorzystywane w badaniach naukowych i biotechnologii.

Pomoce w nauczaniu

Każdy rozdział zawiera zestaw krótkich pytań i pogłębionych zagadnień, jak również dołączoną listę dalszych lektur. Na końcu książki znajduje się obszerny słownik terminów.

Krótkie pytania wymagają odpowiedzi złożonych z 50–500 słów. Pytania te pokrywają zawartość każdego rozdziału i są sformułowane w prosty sposób. Odpowiedzi na nie można znaleźć, sprawdzając odpowiednia partie tekstu. Można wykorzystać te pytania w celu systematycznego zapoznania się z treścią rozdziału lub wybrać niektóre z nich, aby sprawdzić możliwości udzielenia odpowiedzi na określone zagadnienia. Krótkie pytania mogą być też wykorzystywane do przygotowania testów sprawdzających.

Problemy pogłębione wymagają bardziej szczegółowych odpowiedzi. Różnią się charakterem i stopniem trudności. Aby odpowiedzieć na najprostsze z nich, konieczne jest niewiele więcej niż przeglądnięcie literatury. Celem tych pytań jest to, by student rozszerzył wiedzę, nie poprzestając na tym, co pozostaje po zapoznaniu się z Genomami 5. Niektóre pytania wymagają oceny jakiegoś twierdzenia lub hipotezy na podstawie materiałów przedstawionych w tej książce, uzupełnionych ewentualnie o dodatkowe informacje dotyczące danego tematu. Mam nadzieję, że te pytania skłonią do przemyśleń i krytycznych osądów. Niektóre są trudne, a w wielu przypadkach sensowna odpowiedź na nie jest niemożliwa. Zostały postawione po to, aby stymulować dyskusje i rozważania, które powinny rozszerzyć wiedzę każdego studenta i zmusić go do przemyślenia proponowanych twierdzeń. Rozwiązywanie pogłębionych problemów może być podejmowane indywidualnie lub stać się przedmiotem dyskusji w grupach.

Dalsze lektury. Ich lista jest zamieszczona na końcu każdego rozdziału i zawiera te artykuły naukowe, przeglądowe i książki, które uznałem za najlepsze źródło dodatkowych materiałów. Moją intencją przy pisaniu Genomów 5 było, by studenci mogli posłużyć się listą lektur w celu uzyskania dalszych informacji przy pisaniu rozszerzonych esejów lub dysertacji na poszczególne tematy. Zamieszczono tylko te artykuły naukowe, które uznałem za zrozumiałe dla przeciętnego Czytelnika tej książki. Położono również nacisk na zamieszczenie artykułów przeglądowych, których kontekst i znaczenie są istotne dla poszczególnych części książki. Lista lektur została podzielona na sekcje odpowiadające zorganizowaniu informacji zawartych w danym rozdziale, a w niektórych przypadkach uzupełniłem ją o kilka słów podsumowujących szczególną wartość każdej z nich, tak aby pomóc Czytelnikowi w podjęciu decyzji, z którą lekturą należy się zapoznać. W niektórych przypadkach lista zawiera URL (ang. Uniform Resource Locator) dostarczający informacji o bazach danych i innych źródłach internetowych istotnych dla materiału przedstawionego w danym rozdziale.

Słowniczek określa znaczenie każdego terminu, który w tekście jest zaznaczony pogrubionym drukiem, a także wielu terminów, które Czytelnik może spotkać w książkach i artykułach wymienionych w liście lektur. Słowniczek pozwala zatem szybko i wygodnie przypomnieć sobie znaczenia terminów stosowanych przy badaniu genomów. Może także pomóc osobom oczekującym na egzamin w upewnieniu się, czy dobrze rozumieją dany termin.

Pomoce dla wykładowców

Przedstawione w książce ilustracje są dostępne dla zarejestrowanych wykładowców w dwóch wygodnych formatach: PowerPoint i PDF.

Udostępniono także przewodnik po pogłębionych problemach dla wykładowców, który można pobrać w formacie PDF.

Aby pobrać te materiały, trzeba zarejestrować się na stronie „Instructor Resources Download Hub”, którą można odnaleźć na stronie oryginalnego wydania tej książki w sekcji „Instructor Resources” pod adresem https://www.routledge.com/Genomes-5/Brown/p/book/9780367674076.

ROZDZIAŁ 1

Genomy, transkryptomy i proteomy

1.1. DNA

1.2. RNA i transkryptom

1.3. Białka i proteom

Znane nam życie jest definiowane przez genomy niezliczonych organizmów, z którymi dzielimy naszą planetę. Każdy organizm ma genom zawierający informację biologiczną potrzebną do powstania tego organizmu i utrzymania go przy życiu. Większość genomów, w tym genom człowieka i wszystkich innych komórkowych form życia, jest zbudowana z DNA (kwasu deoksyrybonukleinowego), choć niektóre wirusy mają genom zbudowany z RNA (kwasu rybonukleinowego). DNA i RNA są polimerami składającymi się z łańcuchów monomerycznych podjednostek, zwanych nukleotydami. Każda cząsteczka DNA składa się z dwóch owiniętych wokół siebie polinukleotydów tworzących podwójną helisę – dwie nici utrzymywane razem dzięki wiązaniom chemicznym łączącym dwa sąsiadujące nukleotydy w strukturę zwaną parą zasad.

Genom człowieka, który jest typowym genomem zwierząt wielokomórkowych, składa się z dwóch odrębnych części (rys. 1.1):

• genomu jądrowego, składającego się z 3 100 000 000 par zasad DNA, podzielonego na 24 cząsteczki; długość najkrótszej z nich wynosi 47 000 000, a najdłuższej 249 000 000 par zasad, każda z nich tworzy oddzielny chromosom; te 24 chromosomy to 22 autosomy i dwa chromosomy płci, X i Y – w sumie, ludzki genom jądrowy zawiera mniej więcej 44 500 genów;

• genomu mitochondrialnego, kolistej cząsteczki DNA o długości 16 569 nukleotydów, która w ilości do dziesięciu kopii znajduje się w organellach wytwarzających energię, zwanych mitochondriami – ludzki genom mitochondrialny zawiera tylko 37 genów.

Każda z ok. 3 × 10¹³ komórek ciała dorosłego człowieka ma swoją własną kopię lub kopie genomu jądrowego. Jedynymi wyjątkami są niektóre rodzaje komórek, jak czerwone krwinki, które w stanie pełnego zróżnicowania nie mają jądra. Większość komórek jest diploidalna, czyli ma po dwie kopie każdego autosomu plus dwa chromosomy płci: XX u kobiet, a XY u mężczyzn – łącznie 46 chromosomów. Tak jest w przypadku komórek somatycznych, w przeciwieństwie do komórek płciowych, czyli gamet, które są haploidalne i mają tylko 23 chromosomy – po jednym z każdej pary autosomów i jeden chromosom płci. Każda komórka ma również wiele kopii genomu mitochondrialnego: 2 000–7 000 kopii w komórkach somatycznych, takich jak komórki serca i wątroby, oraz ponad 100 000 kopii w każdym oocycie.

Rys. 1.1. Jądrowe i mitochondrialne składniki genomu człowieka

Genom jest magazynem informacji biologicznej, jednak sam nie może przekazać tej informacji komórce. Wykorzystanie informacji biologicznej zawartej w genomie wymaga skoordynowanej aktywności enzymów i innych białek, które biorą udział w złożonych reakcjach biochemicznych prowadzących do ekspresji genomu (rys. 1.2). Początkowym produktem ekspresji genomu jest transkryptom, zbiór cząsteczek RNA pochodzących od genów aktywnych w komórce w danym momencie. Transkryptom powstaje w procesie transkrypcji – kopiowania (dosłownie: przepisywania) pojedynczych genów na cząsteczki RNA. Następnym produktem ekspresji genomu jest proteom – repertuar białek komórki, określający rodzaj reakcji biochemicznych, które dana komórka może przeprowadzać. Białka tworzące proteom są syntetyzowane w procesie translacji (dosłownie: tłumaczenia, przekładu z) niektórych pojedynczych cząsteczek RNA obecnych w transkryptomie.

Niniejsza książka opisuje genomy i ekspresję genomów. Wyjaśnia, w jaki sposób bada się genomy (część 1), jak są one zorganizowane (część 2), jak funkcjonują (część 3) oraz jak się replikują i ewoluują (część 4). Jeszcze do niedawna nie było możliwości napisania takiej książki. Od lat 50. XX w. biolodzy molekularni badali pojedyncze geny lub małe grupy genów. Dzięki tym badaniom powstała bogata wiedza dotycząca działania genów. Dopiero przez ostatnie kilka lat dostępne są techniki umożliwiające badanie całych genomów. Pojedyncze geny są nadal intensywnie badane, jednak dane dotyczące poszczególnych genów są teraz interpretowane w kontekście genomu jako całości. Ten nowy, szerszy aspekt odnosi się nie tylko do genomów, ale również do całej biochemii i biologii komórki. Nie wystarcza już zrozumienie pojedynczego szlaku biochemicznego czy procesu wewnątrzkomórkowego. Obecnie wyzwaniem jest biologia systemów, która stara się powiązać te szlaki i procesy w sieć opisującą całościowe funkcjonowanie żyjącej komórki i żyjącego organizmu.

Niniejsza książka prowadzi przez naszą wiedzę o genomach i pokazuje, że ta ekscytująca dziedzina badań leży u podstaw pogłębiającego się zrozumienia działania układów biologicznych. Na początek musimy zwrócić uwagę na podstawowe prawa biologii molekularnej, omawiając główne cechy trzech typów cząsteczek biologicznych związanych z genomem i jego ekspresją: DNA, RNA i białek.

1.1. DNA

Rys. 1.2. Ekspresja genomu. Genom określa transkryptom, a transkryptom określa proteom

DNA odkrył w 1869 r. Johann Friedrich Miescher, szwajcarski biochemik pracujący w Tybindze w Niemczech. Pierwsze ekstrakty otrzymane przez Mieschera z ludzkich białych krwinek były nieoczyszczoną mieszaniną DNA i białek chromosomowych. W następnych latach Miescher przeniósł się do Bazylei w Szwajcarii, gdzie obecnie znajduje się instytut badawczy jego imienia. Otrzymał tam czyste próbki kwasu nukleinowego ze spermy łososia. Testy chemiczne przeprowadzone przez Mieschera wykazały, że DNA jest kwasem bogatym w fosfor, oraz sugerowały, że pojedyncze cząsteczki są bardzo duże. Jednak dopiero w latach 30. XX w., gdy do badania DNA zastosowano metody biofizyczne, w pełni oszacowano olbrzymią długość polimerycznych łańcuchów.

Geny zbudowane są z DNA

Fakt, że geny zbudowane są z DNA, jest dzisiaj tak dobrze znany, iż trudno uzmysłowić sobie, że przez 75 lat od jego odkrycia nie podejrzewano, jaka jest jego prawdziwa rola. Dopiero W.S. Sutton w 1903 r. zdał sobie sprawę, że wzory dziedziczenia genów odpowiadają zachowaniu się chromosomów w czasie podziałów komórki. Obserwacja ta doprowadziła do zaproponowania teorii chromosomowej, mówiącej, że geny znajdują się w chromosomach. Badania komórek metodami cytochemicznymi, wykorzystującymi barwniki specyficznie wiążące się tylko z jednym typem cząsteczek, wykazały, że chromosomy zawierają mniej więcej równe ilości DNA i białek. W tym czasie biolodzy uświadomili sobie, że muszą istnieć miliony różnych genów i dlatego materiał genetyczny musi występować w wielu różnych formach. Wydawało się, że tego wymagania nie spełnia DNA, ponieważ na początku XX w. sądzono, iż wszystkie cząsteczki DNA są takie same. Z drugiej strony wiedziano, że białka są bardzo zmiennymi, polimerycznymi cząsteczkami, z których każda składa się z różnej kombinacji dwudziestu chemicznie różnych aminokwasowych monomerów (sekcja 1.3). Dlatego uważano, że geny są zbudowane z białek, a nie z DNA.

Błędy w rozumieniu struktury DNA pokutowały do późnych lat 30., kiedy to ustalono, że DNA, podobnie jak białka, cechuje ogromna zmienność. Przypuszczenie, że białka są materiałem genetycznym, pozostawało początkowo silne, ale ostatecznie wykluczono je na podstawie dwóch ważnych doświadczeń.

• Oswald Avery, Colin MacLeod i Maclyn McCarty wykazali, że DNA jest aktywnym składnikiem czynnika transformującego – ekstraktu z komórek bakteryjnych, który po zmieszaniu z niezjadliwym szczepem Streptococcus pneumoniae przekształcał te bakterie w szczep wirulentny, wywołujący zapalenie płuc po wszczepieniu myszom (rys. 1.3A). W 1944 r., kiedy opublikowano wyniki tego doświadczenia, tylko kilku mikrobiologów zdało sobie sprawę, że transformacja obejmuje przeniesienie genów z ekstraktu komórkowego do żywych bakterii. Jednak gdy zaakceptowano ten fakt, prawdziwe znaczenie „eksperymentu Avery’ego” stało się jasne: geny bakteryjne muszą być zbudowane z DNA.

• Alfred Hershey i Martha Chase zastosowali znakowanie izotopami, by wykazać, że gdy hodowle bakteryjne zainfekuje się bakteriofagami (rodzajem wirusów, zwanych również fagami), to głównym składnikiem bakteriofagów wnikającym do komórki jest DNA (rys. 1.3B). Była to istotna obserwacja, ponieważ wiedziano już, że w czasie cyklu infekcyjnego geny infekujących bakteriofagów kierują syntezą nowych bakteriofagów oraz że ta synteza zachodzi w bakteriach. Jeżeli DNA jest jedyną cząsteczką infekujących bakteriofagów wnikającą do komórki, to wynika z tego, że geny tych bakteriofagów muszą być zbudowane z DNA.

Chociaż z naszej perspektywy te dwa doświadczenia dostarczają podstawowych danych, mówiących, że geny są zbudowane z DNA, jednak w tamtych czasach nie było łatwo przekonać biologów. Obydwa eksperymenty miały ograniczenia dające sceptykom możliwość argumentowania, że białka jednak mogą być materiałem genetycznym. Na przykład wątpiono w specyficzność deoksyrybonukleazy – enzymu, którego Avery z kolegami używali do inaktywacji czynnika transformującego. Wynik ten (główna część dowodu, że czynnik transformujący to DNA) byłby nieważny, gdyby, co wydawało się możliwe, enzym ten zawierał choć śladowe ilości zanieczyszczającej proteazy i tym samym mógłby również degradować białka. Również eksperyment z bakteriofagami nie był rozstrzygający, co Hershey i Chase podkreślili, publikując swoje wyniki: „Nasze doświadczenia pokazują, że jest możliwy fizyczny podział faga T2 na część genetyczną i niegenetyczną… Na chemiczną identyfikację części genetycznej musimy jednak poczekać, dopóki nie będzie znana odpowiedź na kilka pytań”. Z perspektywy czasu te dwa eksperymenty są ważne wcale nie z powodu wniosków, jakie z nich wyciągnięto, ale dlatego, że uświadomiły biologom, iż DNA może być materiałem genetycznym i dlatego warto prowadzić nad nim badania. To właśnie to zainspirowało Watsona i Cricka do pracy nad DNA. I to właśnie ich odkrycie struktury podwójnej helisy (linii śrubowej) dało, jak zobaczymy poniżej, odpowiedź na zagadkowe pytanie o sposób replikacji genów i ostatecznie przekonało świat naukowy o tym, że geny zbudowane są z DNA.

DNA jest polimerem zbudowanym z nukleotydów

Rys. 1.3. Dwa eksperymenty, które sugerowały, że geny są zbudowane z DNA. (A) Avery z kolegami wykazali, że czynnik transformujący jest zbudowany z DNA. Dwie górne części pokazują, co się dzieje, gdy myszy zostaną zainfekowane niezjadliwymi bakteriami Streptococcus pneumoniae, samymi lub z czynnikiem transformującym – ekstraktem komórkowym z wirulentnego szczepu S. pneumoniae. Gdy dodawany jest czynnik transformujący, mysz umiera, ponieważ geny w czynniku transformującym przekształcają niezjadliwe bakterie w formę wirulentną. Takie wirulentne bakterie można było następnie wyizolować z płuc martwej myszy. Dolna część pokazuje, że traktowanie czynnika transformującego proteazą lub rybonukleazą nie daje żadnych efektów, inaktywuje go jednak deoksyrybonukleaza.(B) W doświadczeniu Hersheya i Chase wykorzystano bakteriofagi T2. Zbudowane są one z cząsteczki DNA zawartej w kapsydzie białkowym, złożonym z główki i ogonka z włóknami umożliwiającymi bakteriofagowi przyłączenie się do powierzchni bakterii i wstrzyknięcie genów do komórki. DNA bakteriofagów wyznakowano ³²P, a białka ³⁵S. Kilka minut po infekcji hodowlę wytrząsano w wytrząsarce, by odłączyć puste cząsteczki fagowe od powierzchni komórki. Następnie hodowlę wirowano, w wyniku czego na dnie probówki otrzymywano osad z bakterii z genami fagowymi, a lżejsze cząstki fagowe pozostawały w supernatancie. Hershey i Chase wykazali, że osad bakteryjny zawierał 70 % składników faga wyznakowanych ³²P (DNA) i tylko 20 % materiału wyznakowanego ³⁵S (białka fagowe). W kolejnym doświadczeniu, niepokazanym tutaj, Hershey i Chase wykazali, że nowe fagi, powstałe po zakończeniu cyklu infekcyjnego, zawierały mniej niż 1 % białek fagów rodzicielskich. Więcej szczegółów na temat cyklu infekcyjnego bakteriofagów na rys. 2.27

Nazwiska Jamesa Watsona i Francisa Cricka są tak mocno związane z DNA, że zwykle nie pamięta się o tym, iż w październiku 1951 r., kiedy zaczynali współpracę, szczegółowa struktura polimeru DNA była już znana. Ich wkładem nie jest określenie struktury DNA per se, ale wykazanie, że w żywych komórkach dwa łańcuchy DNA są zwinięte, tworząc podwójną helisę. Dlatego musimy najpierw zapoznać się z tym, co Watson i Crick wiedzieli, zanim rozpoczęli swoje badania.

DNA jest liniowym, nierozgałęzionym polimerem, zbudowanym z monomerycznych podjednostek – czterech różnych chemicznie nukleotydów, które mogą być połączone w różnej kolejności, tworząc łańcuchy składające się z setek, tysięcy, a nawet milionów jednostek. Każdy z nukleotydów w polimerze DNA zawiera trzy składniki (rys. 1.4):

• 2’-deoksyrybozę, która jest pentozą, rodzajem cukru zawierającym pięć atomów węgla; atomy węgla noszą numery 1’ (jeden prim), 2’ itp.; nazwa „2’-deoksyryboza” oznacza, że cukier ten jest pochodną rybozy, w której grupa hydroksylowa (—OH) połączona z atomem węgla 2’ została zastąpiona przez wodór (—H);

• zasadę azotową – cytozynę, tyminę (jednopierścieniowe pirymidyny) albo adeninę, guaninę (dwupierścieniowe puryny); zasada azotowa jest połączona z resztą cukrową wiązaniem β-N-glikozydowym, łączącym atom węgla 1’ reszty cukrowej z atomem azotu numer 1 pirymidyny lub atomem azotu numer 9 puryny;

• grupę fosforanową składającą się z jednej, dwóch lub trzech połączonych reszt fosforanowych związanych z atomem węgla 5’ reszty cukrowej; reszty fosforanowe oznaczono symbolami α, β i γ; reszta α-fosforanowa bezpośrednio łączy się z resztą cukrową.

Cząsteczka składająca się z cukru i zasady azotowej nazywana jest nukleozydem; przyłączenie reszty fosforanowej zamienia ją w nukleotyd. Komórki zawierają nukleotydy z jedną, dwiema lub trzema resztami fosforanowymi, ale jako substraty w procesie syntezy DNA wykorzystywane są tylko trifosforany nukleozydów. Pełne chemiczne nazwy czterech nukleotydów, które w reakcji polimeryzacji tworzą DNA, to:

• 2’-deoksyadenozyno-5’-trifosforan,

• 2’-deoksycytydyno-5’-trifosforan,

• 2’-deoksyguanozyno-5’-trifosforan,

• 2’-deoksytymidyno-5’-trifosforan.

Skróty nazw tych czterech nukleotydów to odpowiednio: dATP, dCTP, dGTP i dTTP lub, gdy mówimy o sekwencji DNA, A, C, G i T.

Rys. 1.4. Struktura nukleotydu. (A) Ogólna struktura deoksyrybonukleotydu – rodzaju nukleotydu występującego w DNA. (B) Cztery zasady azotowe występujące w deoksyrybonukleotydach

W cząsteczce polinukleotydu pojedyncze nukleotydy połączone są wiązaniem fosfodiestrowym, łączącym atomy węgla 5’ i 3’ (rys. 1.5). Struktura tego wiązania wskazuje, że w czasie reakcji polimeryzacji następuje usunięcie z nukleotydu dwóch zewnętrznych grup fosforanowych (β i γ) i zastąpienie nim grupy hydroksylowej połączonej z atomem węgla 3’ następnego nukleotydu (rys. 1.6). Należy zwrócić uwagę, że dwa końce polinukleotydu są chemicznie różne. Na jednym znajduje się grupa trifosforanowa połączona z atomem węgla 5’ (koniec 5’ lub koniec 5’P), a na drugim – grupa hydroksylowa połączona z atomem węgla 3’ (koniec 3’ lub koniec 3’OH). Oznacza to, że polinukleotyd ma określoną orientację chemiczną, zapisywaną jako 5’ → 3’ (w dół na rys. 1.5) lub 3’ → 5’ (w górę na rys. 1.5). Ważną konsekwencją polarności (biegunowości) wiązania fosfodiestrowego jest to, że reakcja chemiczna, która wydłużałaby polimer DNA w kierunku 5’ → 3’, jest różna od reakcji, w wyniku której następowałoby wydłużanie w kierunku 3’ → 5’. W organizmach żywych występują polimerazy DNA zdolne do przeprowadzania reakcji tylko w kierunku 5’ → 3’, co powoduje dodatkowe znaczące komplikacje w procesie replikacji (tworzenia wiernej kopii) dwuniciowej cząsteczki DNA (sekcja 15.3).

Odkrycie podwójnej helisy

Rys. 1.5. Krótki polinukleotyd DNA z zaznaczoną strukturą wiązania fosfodiestrowego. Zwróć uwagę, że dwa końce polinukleotydu są chemicznie różne

Przed rokiem 1950 wiele różnych dowodów wskazywało, że cząsteczki DNA w komórce zbudowane są z dwóch lub więcej polinukleotydów w jakiś sposób ze sobą połączonych. Wyjaśnienie natury tej struktury mogło pomóc zrozumieć, jak działają geny. Dlatego Watson i Crick, jak też inni badacze, starali się rozwikłać strukturę DNA. Jak pisze Watson w książce The Double Helix (1968, tłum. pol. Podwójna spirala 1974), ich praca była desperackim wyścigiem z amerykańskim biochemikiem Linusem Paulingiem, który początkowo zaproponował błędny model potrójnej helisy. Dzięki temu Watson i Crick zyskali czas potrzebny do ukończenia struktury podwójnej helisy. Trudno dzisiaj oddzielić fakty od fikcji, szczególnie jeśli chodzi o rolę, jaką odegrała Rosalind Franklin. Jej badania z zastosowaniem dyfrakcji rentgenowskiej dostarczyły olbrzymiej ilości danych doświadczalnych, potwierdzających model podwójnej helisy. Ona sama była bardzo bliska rozwikłania tej struktury. Jedno jest pewne – odkrycie podwójnej helisy przez Watsona i Cricka w sobotę 7 marca 1953 r. było najważniejszym wydarzeniem w biologii XX w.

Odkrycie podwójnej helisy można uważać za jeden z pierwszych multidyscyplinarnych biologicznych projektów badawczych. By wywnioskować, jaka jest struktura podwójnej helisy, Watson i Crick wykorzystali cztery rodzaje danych.

• Wykorzystanie różnego rodzaju danych biofizycznych umożliwiło wydedukowanie, jakie są podstawowe cechy tej struktury. Zawartość wody we włóknach DNA była szczególnie istotna, ponieważ umożliwiała określenie gęstości włókna. Liczba łańcuchów w helisie oraz odległość między nukleotydami musiała być zgodna z gęstością włókna. Model potrójnej helisy Paulinga był oparty na błędnych pomiarach gęstości sugerujących, że cząsteczka DNA ma strukturę upakowaną w większym stopniu niż w rzeczywistości.

• Wzory dyfrakcji promieni rentgenowskich (sekcja 11.1), w większości otrzymane przez Rosalind Franklin, sugerowały szczegóły helikalnej struktury DNA (rys. 1.7).

Rys. 1.6. Synteza polinukleotydu DNA następuje w wyniku reakcji polimeryzacji. Reakcja syntezy zachodzi w kierunku 5’ → 3’. Nowo dodawany nukleotyd jest przyłączany do węgla 3’ na końcu istniejącego polinukleotydu. Reszty fosforanowe β i γ są usuwane z dodawanego nukleotydu w formie cząsteczki pirofosforanu

Rys. 1.7. Wykonany przez Rosalind Franklin rentgenogram dyfrakcyjny nr 51, otrzymany przy użyciu włókna DNA. Kształt krzyża świadczy o tym, że DNA ma strukturę helikalną. Stopień zaczernienia wewnątrz rombowej powierzchni nad, pod i po obu stronach krzyża wskazuje, że szkielet cukrowo-fosforanowy jest położony na zewnątrz helisy (rys. 1.9). Na podstawie położenia różnych plam tworzących ramiona krzyża można obliczyć wymiary cząsteczki, takie jak średnica, przyrost długości helisy na parę zasad i skok helisy (tab. 1.1). „Brakujące plamy” (zaznaczone strzałkami przerwy w każdym z ramion krzyża) wskazują na względne ułożenie dwóch polinukleotydów. To dzięki tym brakującym plamom Watson i Crick doszli do wniosku, że na zewnętrznej powierzchni helisy znajdują się dwa rowki o różnej głębokości (rys. 1.9) (przedruk z R. Franklin, R.G. Gosling (1953). Nature 171:740–741, za zgodą Springer Nature)

• Proporcje ilościowe zasad azotowych, odkryte przez Erwina Chargaffa z Uniwersytetu Columbia w Nowym Jorku, umożliwiły wydedukowanie, w jaki sposób polinukleotydy są połączone w podwójnej helisie. Chargaff prowadził długotrwałe serie chromatograficznych badań próbek DNA z różnych źródeł. Wykazał, że chociaż organizmy różnią się zawartością poszczególnych zasad, jednak molowa ilość adeniny jest zawsze równa ilości tyminy, a ilość guaniny ilości cytozyny (rys. 1.8). Takie proporcje ilościowe zasad doprowadziły do sformułowania praw łączenia się zasad w pary, co było podstawą odkrycia struktury podwójnej helisy.

• Konstruowanie modeli (w skali) możliwych struktur DNA było jedyną znaczącą metodą wprowadzoną przez samych Watsona i Cricka. Takie modele umożliwiały sprawdzanie wzajemnego położenia różnych atomów, by upewnić się, że pary zasad tworzące wiązanie nie są za bardzo od siebie oddalone oraz że inne atomy nie są na tyle blisko, by na siebie oddziaływać.

Łączenie się zasad w pary i asocjacja warstwowa stabilizują podwójną helisę

Rys. 1.8. Doświadczenie Chargaffa pokazujące stosunek ilościowy zasad azotowych w DNA. Z różnych organizmów ekstrahowano DNA i traktowano go kwasem, by poddać hydrolizie wiązania fosfodiestrowe i uwolnić wolne nukleotydy. Ilość każdego nukleotydu oszacowano chromatograficznie. Dane pokazują wyniki uzyskane przez Chargaffa. Wyniki te wykazały, że w granicach błędu doświadczalnego ilość adeniny jest równa ilości tyminy, a ilość guaniny – ilości cytozyny

Podwójna helisa jest prawoskrętna. Oznacza to, że gdyby była spiralnymi schodami, po których wspinalibyśmy się w górę, to zewnętrzna poręcz schodów byłaby po naszej prawej stronie. Dwa łańcuchy są przeciwnie skierowane (rys. 1.9A). Helisę stabilizują dwa rodzaje oddziaływań chemicznych.

• Łączenie się zasad w pary (parowanie zasad) polega na utworzeniu wiązań wodorowych między adeniną w jednym a tyminą w drugim łańcuchu lub między cytozyną w jednym a guaniną w drugim łańcuchu (rys. 1.9B). Wiązania wodorowe są lekkimi oddziaływaniami elektrostatycznymi między atomem o ładunku ujemnym (jak tlen czy azot) a atomem wodoru związanym z innym atomem elektroujemnym. Wiązania wodorowe są dłuższe i dużo słabsze od wiązań kowalencyjnych. Typowa dla nich energia wiązania to 8–29 kJ · mol–1 w temperaturze 25° C, w porównaniu z energią do 348 kJ · mol–1 dla wiązania kowalencyjnego między dwoma atomami węgla. Wiązania wodorowe stabilizują nie tylko strukturę podwójnej helisy DNA, lecz także struktury drugorzędowe w białkach. Dwie kombinacje par zasad, A łączy się z T i G łączy się z C, tłumaczą proporcje ilościowe zasad odkryte przez Chargaffa. Są to jedyne dopuszczalne pary zasad. Ograniczenie to wynika częściowo z geometrii zasad azotowych i względnego położenia atomów, które mogą uczestniczyć w wytworzeniu wiązania wodorowego. Poza tym tylko puryna i pirymidyna mogą łączyć się ze sobą. Para puryna– –puryna byłaby zbyt duża, by zmieścić się wewnątrz helisy, a para pirymidyna–pirymidyna byłaby zbyt mała.

Rys. 1.9. Struktura podwójnej helisy DNA. (A) Dwa schematy podwójnej helisy. Po lewej – struktura helisy, w której szkielet cukrowo-fosforanowy każdego polinukleotydu przedstawiono jako szarą wstążkę, z parami zasad w kolorze zielonym. Po prawej – struktura chemiczna trzech par zasad (B) A tworzy parę z T, a G z C. Przedstawiono ogólny schemat zasad, wiązania wodorowe zaznaczono przerywaną linią. Zwróć uwagę, że para G · C łączy się za pomocą trzech wiązań wodorowych, podczas gdy para A · T za pomocą tylko dwóch wiązań wodorowych

• Asocjacja warstwowa (oddziaływania warstwowe) jest związana z siłami przyciągania między sąsiednimi parami zasad i zwiększa stabilność podwójnej helisy po połączeniu się zasad w pary. Asocjacja warstwowa nazywana jest czasami oddziaływaniami typu π–π, ponieważ sądzi się, że uczestniczą w nich elektrony p tworzące wiązania podwójne w strukturach puryny i pirymidyny. Jednak hipoteza ta jest obecnie kwestionowana i prowadzone są badania testujące możliwy udział jakiegoś rodzaju oddziaływań elektrostatycznych w asocjacji warstwowej.

Obydwa rodzaje oddziaływań, zarówno łączenie się zasad w pary, jak i asocjacja warstwowa, są ważne w utrzymaniu razem dwóch polinukleotydów. Zjawisko łączenia się zasad w pary ma również szczególne znaczenie ze względu na jego implikacje biologiczne. Z ograniczenia, że A może łączyć się tylko z T, a G tylko z C wynika, że w procesie replikacji DNA może powstać dokładna kopia cząsteczki rodzicielskiej. W procesie tym sekwencja istniejącej nici dyktuje sekwencję nowej nici. Mechanizm ten nazwano syntezą DNA zależną od matrycy i jest on wykorzystywany przez wszystkie komórkowe polimerazy DNA (sekcja 2.1). Łączenie się zasad w pary jest prostym i eleganckim mechanizmem umożliwiającym replikację cząsteczek DNA. Dlatego bardzo szybko po opublikowaniu struktury podwójnej helisy przez Watsona i Cricka wszyscy biolodzy byli pewni, że geny są naprawdę zbudowane z DNA.

Podwójna helisa jest strukturą elastyczną

Podwójna helisa opisana przez Watsona i Cricka, pokazana na rys. 1.9A, nazywana jest formą B DNA lub B-DNA. Ma charakterystyczne wymiary:

• średnicę helisy – 2,37 nm;

• przyrost długości helisy na parę zasad – 0,34 nm;

• skok helisy (odcinek przypadający na jeden skręt helisy) – 3,4 nm, co odpowiada dziesięciu parom zasad na skręt.

Przyjęto, że DNA w komórce występuje głównie w formie B. Dzisiaj jest jednak oczywiste, że cząsteczki genomowego DNA nie mają jednorodnej struktury. Wynika to z tego, że nukleotydy w helisie charakteryzują się elastycznością, która pozwala ich cząsteczkom przybierać nieco różne kształty. Aby mogła zmienić się konformacja cząsteczki, musi się nieco zmienić względne położenie atomów w nukleotydzie. Istnieje wiele możliwości, ale do najważniejszych zmian konformacyjnych należą:

• rotacja wokół wiązania β-N-glikozydowego, która zmienia orientację zasady w stosunku do reszty cukrowej; dwie możliwe orientacje nazywane są konformacją anti i konformacją syn (rys. 1.10A); rotacja zasady wpływa na względne położenie dwóch polinukleotydów;

Rys. 1.10. Zmiana konfiguracji przestrzennej nukleotydów wpływa na konformację podwójnej helisy. (A) Konformacja anti- i konformacja syn- -deoksyadenozyny. Te dwie konformacje różnią się orientacją zasady azotowej w stosunku do reszty cukrowej nukleozydu. Rotacja wokół wiązania β-N-glikozydowego przekształca jedną konformację w drugą. Pozostałe trzy nukleozydy również występują w konformacji anti lub syn (B) Konformacja cukrów (ang. sugar pucker). Położenie atomów węgla w pierścieniu cukru w konfiguracji przestrzennej C2’-endo i C3’-endo

• zmiany konformacji cukrów (ang. sugar pucker) wpływają na ich trójwymiarowy kształt; pierścień rybozy, wchodzącej w skład nukleotydu, nie jest płaski – widok tej struktury z boku pokazuje, że jeden atom lub dwa atomy węgla są zlokalizowane powyżej lub poniżej płaszczyzny pierścienia cukrowego (rys. 1.10B); w konfiguracji C2’-endo atom węgla 2’ położony jest powyżej tej płaszczyzny, atom węgla 3’ tuż poniżej; natomiast w konformacji C3’-endo atom węgla 3’ jest położony powyżej, a atom węgla 2’ poniżej; ponieważ atom węgla 3’ wchodzi w skład wiązania fosfodiestrowego łączącego cukier z sąsiednim nukleotydem, te dwie konfiguracje pierścienia cukru różnie wpływają na konformację szkieletu cukrowo-fosforanowego.

Zmiany konformacyjne, wynikające z rotacji wokół wiązania β-N-glikozydowego oraz zmian w konformacji pierścienia cukrowego, mogą prowadzić do dużych zmian w ogólnej strukturze helisy. Od lat 50. XX w. wiadomo, że wymiary podwójnej helisy ulegają zmianie, gdy zmienia się względna wilgotność włókien zawierających cząsteczki DNA. Na przykład zmodyfikowana wersja podwójnej helisy, zwana A-DNA, ma średnicę 2,55 nm, przyrost długości helisy na parę zasad wynosi 0,23 nm, a skok helisy – 2,5 nm, co odpowiada 11 parom zasad na skręt (tab. 1.1). Podobnie jak forma B, forma A jest prawoskrętną helisą, w której orientacja zasady w stosunku do reszty cukrowej odpowiada konformacji anti. Podstawowa różnica między formami A i B dotyczy konformacji cukrów. Pierścienie cukrowe w B-DNA występują w konfiguracji C2’-endo, a w A-DNA w konfiguracji C3’-endo. Inne prawoskrętne wersje podwójnej helisy to: B’-, C-, C’-, C’’-, D-, E- i T-DNA.

Możliwa jest również bardziej drastyczna zmiana konformacji, prowadząca do powstania lewoskrętnej formy Z-DNA, w której szkielet cukrowo-fosforanowy ma nieregularny, zygzakowaty kształt. Z-DNA jest ciaśniej zwiniętą wersją podwójnej helisy o skoku 12 par zasad na skręt i średnicy tylko 1,84 nm (tab. 1.1). Wiadomo, że podwójna helisa ma taką formę w rejonach zawierających powtórzone motywy GC, tzn. w takich, w których sekwencja obu nici to ...GCGCGCGC..., gdzie wszystkie nukleotydy guaninowe mają konformację syn i C3’-endo, a wszystkie nukleotydy cytozynowe konformację anti i C2’-endo.

Tabela 1.1. Cechy różnych form podwójnej helisy DNA

Cecha

A-DNA

B-DNA

Z-DNA

Typ helisy

prawoskrętna

prawoskrętna

lewoskrętna

Średnica helisy (nm)

2,55

2,37

1,84

Odległość między sąsiednimi parami zasad (nm)

0,23

0,34

0,38

Przyrost długości na skręt helisy (skok) (nm)

2,5

3,4

4,6

Liczba zasad na skręt

11

10

12

Orientacja zasady azotowej

anti

anti

mieszana

Konformacja cukru

C3ʹ-endo

C2ʹ-endo

mieszana

Same dane dotyczące wymiarów różnych form podwójnej helisy nie odzwierciedlają najbardziej znaczącej różnicy między nimi. Istotna nie jest średnica czy skok helisy, ale to, w jakim stopniu wewnętrzne obszary helisy są dostępne z jej powierzchni. Rysunek 1.9A pokazuje, że powierzchnia formy B DNA nie jest całkowicie gładka, ale że spiralnie biegną wzdłuż niej dwa rowki. Jeden z nich, stosunkowo szeroki i głęboki, nazywany jest większym rowkiem. Drugi, węższy i płytszy, to mniejszy rowek. DNA-A również ma dwa rowki, jednak w tej konformacji większy rowek jest głębszy, a mniejszy rowek płytszy niż w DNA-B (rys. 1.11). Forma Z-DNA jest zdecydowanie inna – większy rowek praktycznie nie istnieje, a mniejszy jest bardzo wąski i głęboki. W każdej z form DNA część powierzchni wewnętrznej przynajmniej jednego rowka jest utworzona przez grupy chemiczne zasad azotowych. Z rozdziału 11 dowiemy się, że ekspresja informacji genetycznej zawartej w genomie zachodzi za pośrednictwem białek wiążących DNA, które wiążą się do podwójnej helisy i regulują aktywność znajdujących się w niej genów. By spełniać swoją funkcję, każde białko wiążące DNA musi specyficznie wiązać się do sekwencji położonej obok genu, którego aktywność reguluje. Jest to możliwe, gdyż białko wiążące DNA oddziałuje z dnem rowka i może z mniejszą lub większą dokładnością „czytać” sekwencję nukleotydową bez otwierania helisy, a więc bez rozrywania wiązań łączących pary zasad. Wynika stąd, że białka wiążące DNA, które mają strukturę umożliwiającą im rozpoznanie specyficznej sekwencji nukleotydów, na przykład w formie B DNA, mogą nie być zdolne do rozpoznania tej samej sekwencji w cząsteczce DNA o innej konformacji. Jak dowiemy się z sekcji 11.3, zmiany konformacyjne wzdłuż cząsteczki DNA oraz polimorfizm strukturalny wynikający z sekwencji nukleotydów mogą determinować specyficzność oddziaływań między genomem a białkami wiążącymi DNA.

1.2. RNA i transkryptom

Rys. 1.11. Modele form A, B i Z  podwójnej helisy. Większy i mniejszy rowek na powierzchni cząsteczek oznaczono odpowiednio literami M i m (dzięki uprzejmości R.S. Wheelera, na licencji GFDL 1.2)

Początkowym produktem ekspresji genomu jest transkryptom (rys. 1.2) – zbiór cząsteczek RNA pochodzących od genów aktywnych w komórce w danym momencie. Cząsteczki RNA tworzące transkryptom są syntetyzowane w procesie transkrypcji (przepisywania z DNA na RNA). W tej sekcji poznamy strukturę RNA i przyjrzymy się dokładniej różnym rodzajom cząsteczek RNA występującym w komórce.

RNA jest drugim rodzajem polinukleotydu

Rys. 1.12. Różnice struktury chemicznej DNA i RNA. (A) RNA jest zbudowany z rybonukleotydów, w skład których wchodzi cukier ryboza, a nie 2’-deoksyryboza. W cząsteczce rybozy do węgla 2’ przyłączona jest grupa hydroksylowa, a nie atom wodoru. (B) RNA zamiast tyminy zawiera pirymidynę o nazwie uracyl

RNA jest polinukleotydem podobnym do DNA, ale różnią go dwie istotne cechy chemiczne (rys. 1.12). Po pierwsze cukrem wchodzącym w skład RNA jest ryboza, po drugie RNA zawiera uracyl zamiast tyminy. Dlatego cztery nukleotydy, substraty w syntezie RNA, to:

• adenozyno-5’-trifosforan,

• cytydyno-5’-trifosforan,

• guanozyno-5’-trifosforan,

• urydyno-5’-trifosforan.

Skróty nazw tych czterech nukleotydów to odpowiednio: ATP, CTP, GTP i UTP lub A, C, G i U.

W polinukleotydzie RNA, podobnie jak w DNA, występują wiązania 3’–5’ fosfodiestrowe. Są one jednak mniej stabilne niż w DNA, co wynika pośrednio z obecności grupy hydroksylowej połączonej z atomem węgla 2’ reszty cukrowej. Cząsteczki RNA rzadko mają długość większą niż kilka tysięcy nukleotydów. Chociaż występują w nich liczne rodzaje wiązań wewnątrzcząsteczkowych, powstałych dzięki łączeniu się zasad w pary (na przykład rys. 5.6A), jednak w większości cząsteczki RNA są jedno-, a nie dwuniciowe.

Enzymy odpowiedzialne za transkrypcję DNA na RNA nazwano polimerazami RNA zależnymi od DNA. Jak wynika z nazwy, przeprowadza on reakcję enzymatyczną polimeryzacji RNA z rybonukleotydów, która jest zależna od DNA. Oznacza to, że sekwencja nukleotydów w cząsteczce DNA – matrycy dyktuje sekwencję nukleotydów w syntetyzowanej cząsteczce RNA (rys. 1.13). Nazwę enzymu można skrócić do polimeraza RNA. Należy jednak pamiętać, by z kontekstu wynikało, że chodzi o ten właśnie enzym, i nie mylić go z polimerazą RNA zależną od RNA, enzymem biorącym udział w replikacji i ekspresji genomów niektórych wirusów. Od strony chemicznej zależna od matrycy synteza RNA odpowiada syntezie DNA (rys. 1.6). Rybonukleotydy są dodawane jeden po drugim do wydłużającego się końca 3’ transkryptu RNA. Rodzaj włączanego nukleotydu określają reguły łączenia się zasad w pary: A tworzy parę z T lub U, G tworzy parę z C. Podczas dodawania każdego kolejnego nukleotydu usuwane są z niego grupy fosforanowe β i γ, a z nukleotydu znajdującego się na końcu łańcucha polinukleotydowego usuwana jest grupa hydroksylowa przy węglu 3’ reszty cukrowej – dokładnie tak samo jak podczas polimeryzacji DNA.

Rodzaje RNA w komórce

Rys. 1.13. Synteza RNA zależna od matrycy. Synteza transkryptu RNA zachodzi w kierunku 5' → 3'. Matryca DNA jest odczytywana w kierunku 3' → 5', a jej sekwencja determinuje sekwencję transkryptu dzięki łączeniu się komplementarnych zasad w pary

Typowa bakteria zawiera 0,05–0,10 pg RNA, co stanowi ok. 6 % jej całkowitej masy. Dużo większa komórka ssaków zawiera również więcej RNA (20–30 pg), jednak stanowi to tylko 1 % jej masy.

Najlepszym sposobem poznania rodzajów RNA w komórce jest podzielenie ich na kategorie i podkategorie w zależności od pełnionych przez nie funkcji. Istnieje wiele możliwości takiego podziału, jednak schemat pokazany na rys. 1.14 wydaje się najbardziej poglądowy. RNA dzielimy przede wszystkim na RNA kodujący i RNA niekodujący. RNA kodujący obejmuje tylko jedną klasę cząsteczek – RNA informacyjne (mRNA, ang. messenger RNA), które są transkryptami genów kodujących białka, a więc ulegają translacji na białka w drugim etapie ekspresji genomu. Cząsteczki mRNA rzadko stanowią więcej niż 4 % całkowitego RNA w komórce, charakteryzują się krótkim okresem półtrwania i są szybko degradowane wkrótce po syntezie. Okres półtrwania bakteryjnych mRNA wynosi nie więcej niż kilka minut, a u eukariontów większość mRNA jest degradowana w ciągu kilku godzin po syntezie. Tak szybki proces degradacji oznacza, że skład transkryptomu nie jest stały i może się szybko zmieniać dzięki zmianie tempa syntezy poszczególnych mRNA.

Drugi rodzaj RNA nazwano niekodującym, ponieważ nie ulega translacji na białka. Alternatywna nazwa to RNA funkcjonalny, co odzwierciedla fakt, że RNA niekodujacy spełnia istotną rolę w komórce. Istnieje wiele rodzajów funkcjonalnego RNA, najważniejsze z nich to:

Rys. 1.14. RNA występujące w komórce. Schemat pokazuje rodzaje RNA (łącznie z prekursorowymi RNA opisanymi poniżej) obecne we wszystkich organizmach oraz te, które występują tylko w komórkach eukariotycznych

• RNA rybosomowe (rRNA) – obecne we wszystkich organizmach i przeważnie stanowiące najliczniejszą klasę RNA w komórce; w aktywnie dzielących się bakteriach stanowią one ponad 80 % całkowitego RNA; cząsteczki te są składnikiem rybosomów, struktur, na których zachodzi synteza białek (sekcja 13.3);

• RNA transportujące (tRNA) (ang. transfer RNA) – małe cząsteczki, które również biorą udział w syntezie białek i podobnie jak rRNA występują we wszystkich organizmach; funkcją tRNA jest dostarczenie aminokwasów do rybosomu i zapewnienie, że aminokwasy są łączone w kolejności zapisanej w sekwencji nukleotydowej mRNA ulegającego translacji (sekcja 13.3).

rRNA i tRNA to dwie najważniejsze kategorie niekodujących RNA, jednak znanych jest wiele innych rodzajów cząsteczek RNA pełniących wyspecjalizowane funkcje w komórkach eukariotycznych lub bakteryjnych. U eukariontów takie RNA są zwykle klasyfikowane do dwóch grup: krótkie niekodujące RNA (sncRNA) (ang. short noncoding RNA), nie dłuższe niż 200 nukleotydów, i długie niekodujące RNA (lncRNA) (ang. long noncoding RNA), dłuższe niż 200 nukleotydów. Różne funkcje tych niekodujących RNA zostaną omówione w rozdziale 12.

Wiele RNA jest syntetyzowanych jako cząsteczki prekursorowe

Oprócz opisanych powyżej dojrzałych cząsteczek RNA komórki zawierają również cząsteczki prekursorowe. Wiele RNA, szczególnie u eukariontów, jest wyjściowo syntetyzowanych jako prekursorowe transkrypty pierwotne, czyli pre-RNA, które muszą ulec procesowi dojrzewania, zanim będą mogły pełnić swoje funkcje.

Najważniejszym etapem procesu dojrzewania jest składanie RNA (ang. splicing), polegające na usuwaniu fragmentów z prekursorowego RNA. Niektóre geny eukariotyczne są nieciągłe i zawierają wewnętrzne segmenty, które są kopiowane w czasie transkrypcji, a następnie wycinane z pre-RNA (rys. 1.15). Te wycinane segmenty to introny, natomiast eksony to segmenty, które są ze sobą składane, by stworzyć dojrzały RNA. Introny występują w niektórych genach kodujących rRNA i tRNA, ale najczęściej w genach kodujących białka. Dlatego składanie pre-mRNA jest bardzo istotną częścią procesu prowadzącego do syntezy części transkryptomu kodującej białka (sekcja 12.4). Składanie RNA zachodzi w jądrze, w którym nieposkładane cząsteczki pre-mRNA tworzą frakcję jądrowego RNA zwaną heterogennym jądrowym RNA (hnRNA, ang. heterogenous nuclear RNA).

Składanie nie jest jedynym rodzajem cięcia występującym w trakcie procesu dojrzewania pre-RNA. Wiele cząsteczek rRNA i tRNA jest początkowo synetyzowanych jako cząsteczki prekursorowe, które zawierają kopię więcej niż jednej cząsteczki. Dlatego pre-rRNA i pre-tRNA muszą być w procesie dojrzewania cięte na kawałki, co prowadzi do powstania dojrzałych RNA (rys. 1.16). Ten typ dojrzewania występuje zarówno u prokariontów, jak i eukariontów.

Rys. 1.15. Składanie eukariotycznego mRNA. Z pre-mRNA są wycinane introny, a eksony są ponownie łączone ze sobą i tworzą funkcjonalny mRNA. Eksony w obrębie genu zaznaczono na zielono, a w obrębie pre-mRNA i mRNA – na niebiesko

Inne etapy procesu dojrzewania prowadzą do zmian na końcach cząsteczki RNA. Takie modyfikacje końców zachodzą w czasie syntezy eukariotycznych mRNA, z których większość na końcu 5’ ma dołączoną strukturę zwaną czapeczką, a na końcu 3’ – ogon poli(A). Czapeczka to zmodyfikowany nukleotyd o nazwie 7-metyloguanozyna, który jest przyłączany do pierwszego nukleotydu pre-mRNA poprzez nietypowe wiązanie trifosforanowe (rys. 1.17A). Pierwszy i drugi nukleotyd pre-mRNA może być również modyfikowany przez dodanie grupy metylowej. Czapeczka jest potrzebna w procesie inicjacji translacji mRNA, w wyniku której syntetyzowane jest białko. Ogon poli(A) składa się z łańcucha nukleotydów adeninowych, o długości do 250 nukleotydów, obecnych na końcu 3’ cząsteczki mRNA. mRNA jest cięty blisko końca 3’, a następnie do tego nowo powstałego końca 3’ dodawane są adeniny przez polimerazę RNA niezależną od matrycy, zwaną polimerazą poli(A) (rys. 1.17B). Nie w pełni rozumiemy rolę procesu poliadenylacji, jednak wiadomo, że mRNA jest degradowany, jeśli brakuje ogona poli(A) lub jest on krótszy niż zwykle.

Rys. 1.16. Dojrzewanie bakteryjnych pre-rRNA. Bakteryjne pre-rRNA zawierają po jednej kopii każdego z trzech rodzajów rRNA, które po połączeniu z białkami rybosomowymi tworzą rybosom bakteryjny. Następujące po sobie reakcje cięcia i przycinania uwalniają dojrzałe rRNA z cząsteczki prekursorowej

dodatkowa modyfikacja w czapeczce typu 2

Rys. 1.17. Modyfikacja końców 5’ i 3’ eukariotycznych mRNA. (A) Struktura czapeczki na końcu 5’ mRNA. Czapeczkę typu 0 tworzy zmodyfikowany nukleotyd 7-metyloguanozyna połączony wiązaniem trifosforanowym 5’-5’ z pierwszym nukleotydem pre-mRNA. Przyłączenie dodatkowych grup metylowych w zaznaczonych pozycjach prowadzi do powstania czapeczki typu 1 i czapeczki typu 2. (B) Poliadenylacja końca 3’ mRNA. Sekwencja ogona poli(A) nie jest zakodowana w DNA, a więc nie jest syntetyzowana przez polimerazę RNA w procesie transkrypcji genu. Ogon poli(A) jest dodawany po transkrypcji przez polimerazę poli(A)

Końcowym etapem w procesie dojrzewania RNA są modyfikacje chemiczne. Niektóre zasady azotowe w rRNA i tRNA wszystkich organizmów są modyfikowane poprzez metylację, deaminację (usunięcie grupy -NH₂) i/lub podstawienie siarki (wymiana atomu tlenu na atom siarki). Niektóre zasady podlegają również wewnętrznym rearanżacjom, które prowadzą do zmiany położenia poszczególnych grup i/lub przekształcenia wiązań podwójnych w pojedyncze (rys. 1.18). Nie wiadomo, jaki jest cel wielu takich modyfikacji, choć opisano ich funkcję w pewnych specyficznych przypadkach. W tRNA niektóre ze zmodyfikowanych nukleotydów są rozpoznawane przez enzymy przyłączające aminokwas do końca 3’ cząsteczki, co ma kluczowe znaczenie dla funkcji tRNA w syntezie białek. Właściwy aminokwas musi być przyłączony do odpowiedniej cząsteczki tRNA i uważa się, że modyfikacje tRNA umożliwiają zachodzenie tego procesu z odpowiednią specyficznością. Również eukariotyczne mRNA podlegają modyfikacjom chemicznym. Niektóre z tych modyfikacji zmieniają właściwości łączenia się w pary zasad nukleotydów i w ten sposób zmieniają sekwencję mRNA, a także mogą zmienić sekwencję aminokwasów kodowanego białka (rys. 1.19A). Ten typ modyfikacji chemicznej nazywany jest redagowaniem RNA. Inne modyfikacje nie zmieniają sekwencji mRNA, np. N⁷-metyloguanina w dalszym ciągu łączy się w parę z C (rys. 1.19B). Chociaż takie modyfikacje nie zmieniają sekwencji kodowanego białka, mogą jednak wpływać na proces translacji mRNA (sekcja 12.5).

Różne definicje transkryptomu

Rys. 1.18. Przykłady chemicznie zmodyfikowanych zasad występujących w rRNA i tRNA. Na pomarańczowo zaznaczono różnice między zasadą standardową i pochodzącą od niej zasadą zmodyfikowaną

Rys. 1.19. Modyfikacje chemiczne eukariotycznych mRNA. (A) Redagowanie RNA prowadzi do zmian w sekwencji nukleotydowej mRNA. (B) Modyfikacje, takie jak przekształcenie guaniny w N⁷-metyloguaninę, nie wpływają na łączenie się zasad w pary, a więc nie zmieniają sekwencji nukleotydowej

Chociaż większość biologów definiuje obecnie transkryptom jako cały RNA komórki, jednak ten wprowadzony w 1997 r. termin początkowo odnosił się tylko do mRNA. mRNA stanowi mniej niż 4 % całego komórkowego RNA, ale często jest uważany za jego najistotniejszy składnik, ponieważ zawiera kodujące RNA wykorzystywane w kolejnym etapie ekspresji genomu. Nawet u najprostszych organizmów, takich jak bakterie i drożdże, wiele genów kodujących białka jest aktywnych tylko w pewnym okresie. Dlatego mRNA komórki nie jest jednorodny i zawiera kopie setek, jeśli nie tysięcy różnych genów. Cały mRNA komórki określa zestaw białek wytwarzanych przez komórkę, determinując jej biochemiczne właściwości. Celem wielu wcześniejszych badań transkryptomu było zidentyfikowanie wszystkich lub jak największej liczby komórkowych mRNA, aby zrozumieć ogólny wzór ekspresji genów oraz to, jak ten wzór się zmienia, na przykład wtedy, gdy komórka rakowacieje. Ten rodzaj badań jest ważny również dzisiaj, ale ponieważ skupia się na mRNA, ciągle istnieje tendencja, by mówiąc o transkryptomie, odnosić się tylko do mRNA komórki.

Szersza definicja pojęcia „transkryptom” obejmuje wszystkie rodzaje RNA w komórce i odzwierciedla nasze rosnące zrozumienie tego, jak ważne funkcje w określeniu biochemicznych własności komórki odgrywają niekodujące RNA. W szczególności sncRNA zwane mikroRNA (miRNA) regulują ekspresję genów w komórkach eukariotycznych, biorąc udział w procesie degradacji tych cząsteczek mRNA, których produkty nie są już potrzebne (sekcja 12.6). Komórki ludzkie mogą syntetyzować ok. 1000 rodzajów miRNA, specyficznych dla pojedynczych mRNA lub małych grup mRNA. Zrozumienie tego, jaki rodzaj miRNA jest syntetyzowany w poszczególnych komórkach, oraz tego, jak wzór syntezy miRNA zmienia się w czasie choroby, jest niezbędnym uzupełnieniem równorzędnych badań nad mRNA. Dlatego ma sens objęcie definicją „transkryptom” wszystkich RNA w komórce, ponieważ skupienie się tylko na mRNA prowadzi do pominięcia istotnej roli pozostałych części transkryptomu w regulacji ekspresji informacji biologicznej zakodowanej w genomie.

1.3. Białka i proteom

Kolejnym produktem ekspresji genomu jest proteom (rys. 1.2), zestaw białek komórki określający, jakie reakcje biochemiczne dana komórka może przeprowadzać. Białka te są syntetyzowane w procesie translacji cząsteczek RNA wchodzących w skład transkryptomu.

Cztery hierarchiczne poziomy struktury białka

Rys. 1.20. Ogólna struktura aminokwasu. Ogólna struktura wszystkich aminokwasów jest taka sama. Zbudowane są one z atomu węgla α połączonego z atomem wodoru, grupą karboksylową, grupą aminową i grupą R. Aminokwasy różnią się między sobą grupami R (rys. 1.24)

Białka, podobnie jak DNA, są liniowymi, nierozgałęzionymi polimerami. Monomeryczna podjednostka w białkach nazywana jest aminokwasem (rys. 1.20), a polimer – polipeptydem. Jego długość rzadko przekracza 2000 jednostek.

Tradycyjnie uważa się, że białka mają cztery różne poziomy struktury, które są hierarchiczne. Białko budowane jest stopniowo i każdy poziom struktury zależy od poziomu poprzedzającego.

• Struktura pierwszorzędowa białka powstaje przez połączenie aminokwasów w polipeptyd przez wiązania peptydowe. Polipeptydy są syntetyzowane w wyniku reakcji kondensacji między grupą karboksylową jednego aminokwasu a grupą aminową drugiego aminokwasu (rys. 1.21). Zwróćmy uwagę na to, że podobnie jak w przypadku polinukleotydów dwa końce polipeptydu są chemicznie różne. Na jednym znajduje się wolna grupa aminowa i dlatego nazywa się go końcem aminowym, końcem NH₂ lub końcem N. Na drugim – wolna grupa karboksylowa i nazywa się go końcem karboksylowym, końcem COOH lub końcem C. Kierunek polipeptydu można więc zapisać albo jako N → C (od lewej do prawej na rys. 1.21) albo jako C → N (od prawej do lewej na rys. 1.21).

• Struktura drugorzędowa to różne konformacje, jakie może przybierać polipeptyd. Dwa zasadnicze typy struktur drugorzędowych to helisa α i harmonijka β (β kartka) (rys. 1.22). Obydwie te struktury są stabilizowane głównie przez wiązania wodorowe, które powstają między różnymi aminokwasami w polipeptydzie. Większość polipeptydów ma wystarczającą długość, by sfałdować się w serie struktur drugorzędowych, jedna po drugiej, wzdłuż cząsteczki.

Rys. 1.21. Aminokwasy w polipeptydach połączone są wiązaniami peptydowymi. Na rysunku pokazano reakcję chemiczną, w wyniku której dwa aminokwasy zostają połączone wiązaniem peptydowym. Jest to reakcja kondensacji, ponieważ w jej wyniku uwolniona zostaje cząsteczka wody

Rys. 1.22. Dwa zasadnicze typy struktur drugorzędowych występujących w białkach: (A) helisa α, (B) harmonijka β (β kartka). Łańcuch polipeptydowy pokazano schematycznie. Dla jasności pominięto grupy R. Obydwie struktury są stabilizowane przez wiązania wodorowe między grupami C = O i N—H wchodzącymi w skład różnych wiązań peptydowych. Pokazana na rysunku harmonijka β jest przeciwbieżna – dwa łańcuchy są skierowane przeciwnie. Istnieją również harmonijki β, w których łańcuchy są skierowane zgodnie

• Struktura trzeciorzędowa jest wynikiem zwijania struktur drugorzędowych polipeptydu w trójwymiarową konfigurację (rys. 1.23). Struktura trzeciorzędowa jest stabilizowana przez różne rodzaje oddziaływań. Są to głównie wiązania wodorowe między poszczególnymi aminokwasami, oddziaływania elektrostatyczne między naładowanymi grupami R aminokwasów (rys. 1.24) oraz efekty hydrofobowe decydujące o tym, że aminokwasy mające niepolarne łańcuchy boczne (tzn. charakteryzujące się „awersją do wody”) muszą być schowane przed wodą i wchodzą w skład wewnętrznych części białka. Możliwe jest również powstawanie kowalencyjnych wiązań disulfidowych, zwanych też mostkami dwusiarczkowymi, które powstają między cysteinami znajdującymi się w różnych miejscach polipeptydu.

• Struktura czwartorzędowa powstaje przez połączenie dwóch lub więcej polipeptydów w białko składające się z kilku podjednostek, z których każda sfałdowana jest w strukturę trzeciorzędową. Nie wszystkie białka tworzą struktury czwartego rzędu. Jest to cecha wielu białek pełniących skomplikowane funkcje, w tym białek biorących udział w ekspresji genomu. Niektóre struktury czwartorzędowe utrzymują się dzięki wiązaniom disulfidowym między różnymi polipeptydami. Dzięki temu powstają zbudowane z wielu podjednostek stabilne białka, które niełatwo rozdzielić na części składowe. Inne struktury czwartorzędowe są luźniejszym połączeniem podjednostek stabilizowanym przez wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe. Oznacza to, że białka te mogą rozpadać się na składowe polipeptydy lub wymieniać swoje podjednostki zależnie od funkcjonalnych wymagań komórki.

Różnorodność białek wynika z różnorodności aminokwasów

Rys. 1.23. Trzeciorzędowa struktura białka. Hipotetyczna struktura białka składającego się z trzech helis α (spirale) i czteroniciowej harmonijki β (strzałki)

Funkcjonalna różnorodność białek wynika z tego, że tworzące je aminokwasy są chemicznie różne. Dlatego łączenie się aminokwasów w rozmaite sekwencje prowadzi do powstawania różnych kombinacji reaktywności chemicznych, od których zależy nie tylko ogólna struktura powstającego białka, lecz także umiejscowienie grup aktywnych na jego powierzchni, co determinuje właściwości chemiczne białka.

Rys. 1.24. Struktura grup R aminokwasów. Dwadzieścia aminokwasów pokazanych na rysunku to te, które są tradycyjnie klasyfikowane jako aminokwasy określane przez kod genetyczny. W przypadku proliny pokazano strukturę całego aminokwasu, nie tylko grupy R, ponieważ ma ona nietypową budowę. Grupa R proliny jest połączona wiązaniem nie tylko z węglem α, lecz także ze związaną z nim grupą aminową

Tabela 1.2. Skróty nazw aminokwasów

Aminokwas

Skrót

Skrót trzyliterowy

Skrót jednoliterowy

Alanina

Ala

A

Arginina

Arg

R

Asparagina

Asn

N

Kwas asparaginowy

Asp

D

Cysteina

Cys

C

Kwas glutaminowy

Glu

E

Glutamina

Gln

Q

Glicyna

Gly

G

Histydyna

His

H

Izoleucyna

Ile

I

Leucyna

Leu

L

Lizyna

Lys

K

Metionina

Met

M

Fenyloalanina

Phe

F

Prolina

Pro

P

Seryna

Ser

S

Treonina

Thr

T

Tryptofan

Trp

W

Tyrozyna

Tyr

Y

Walina

Val

V

Przyczyną różnorodności aminokwasów są grupy R, które bardzo różnią się strukturą i są inne w każdym aminokwasie. Białka zbudowane są z 20 aminokwasów (rys. 1.24, tab. 1.2). Niektóre mają małe grupy R, o stosunkowo prostej budowie, jak atom wodoru w glicynie lub grupa metylowa w alaninie. Inne aminokwasy, jak fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna, mają duże aromatyczne łańcuchy boczne o złożonej strukturze. Większość grup R jest nienaładowana w pH 7,4 – „fizjologicznym pH” większości komórek i tkanek. Dwa aminokwasy są naładowane ujemnie (kwas asparaginowy i glutaminowy), a trzy dodatnio (arginina, histydyna i lizyna). Część aminokwasów ma polarne łańcuchy boczne (np. seryna i treonina), w innych są one niepolarne (np. alanina, leucyna i walina).

Dwadzieścia aminokwasów pokazanych na rys. 1.24 to te tradycyjnie klasyfikowane jako aminokwasy określane przez kod genetyczny. Są to więc aminokwasy łączone ze sobą w czasie translacji cząsteczek mRNA na białka. Jednak chemiczna różnorodność białek nie ogranicza się tylko do tych 20 aminokwasów. Dwa czynniki powodują zwiększenie różnorodności białek:

Rys. 1.25. Struktura selenocysteiny i pirolizyny. Na czerwono zaznaczono różnice między selenocycteiną a cysteiną oraz między lizyną a pirolizyną

• w czasie syntezy białka do łańcucha polipeptydowego mogą być włączane przynajmniej dwa dodatkowe aminokwasy nietypowe – selenocysteina i pirolizyna (rys. 1.25); ich włączenie zależy od zmodyfikowanego sposobu odczytu kodu genetycznego;

• niektóre białka są modyfikowane w procesie ich obróbki potranslacyjnej przez dodanie nowych grup chemicznych, np. hydroksylację, acetylację albo fosforylację, lub przez przyłączenie dużych łańcuchów bocznych składających się z reszt cukrowych (sekcja 13.4).

Dlatego białka charakteryzują się ogromną chemiczną zmiennością, z której część jest określana przez genom, a reszta jest wynikiem procesu obróbki potranslacyjnej.

Powiązanie transkryptomu z proteomem

Proteom składa się z białek obecnych w danym momencie w komórce. Uważa się, że typowa komórka ssaków, np. hepatocyt wątroby, zawiera 10 000–20 000 różnych rodzajów białek – ok. 8 × 10⁹ pojedynczych cząsteczek. Łącznie to ok. 0,5 ng białka, co stanowi 18–20 % całkowitej masy komórki. Liczba cząsteczek poszczególnych białek jest bardzo zmienna – od 20 000 cząsteczek na komórkę dla najmniej licznych, do ponad 100 milionów dla najliczniejszych. Każde białko występujące w komórce w liczbie większej niż 50 000 cząsteczek na komórkę jest uważane za stosunkowo liczne. W typowej komórce ssaków ok. 2000 białek należy do tej kategorii. Gdy porównuje się proteomy różnych komórek ssaków, obserwuje się tylko niewielkie różnice dotyczące klasy białek licznych. Sugeruje to, że większość z nich należy do białek metabolizmu podstawowego (ang. housekeeping proteins), biorących udział w podstawowych reakcjach biochemicznych w komórce. Białka związane z wyspecjalizowanymi funkcjami komórki są przeważnie stosunkowo nieliczne, chociaż istnieją wyjątki, np. ogromne ilości hemoglobiny w komórkach czerwonych krwinek.

Proteom jest syntetyzowany w procesie translacji mRNA, który jest częścią składową transkryptomu. Na początku lat 50. XX w., wkrótce po odkryciu struktury podwójnej helisy DNA, wielu biologów molekularnych starało się wymyślić, w jaki sposób aminokwasy mogłyby przyłączać się do mRNA w uporządkowany sposób. Jednak we wszystkich proponowanych modelach przynajmniej kilka wiązań musiałoby być krótszych lub dłuższych niż dopuszczalna odległość zgodna z prawami chemii fizycznej i dlatego wszystkie te modele odrzucono. Niepewność tę ostatecznie rozwiał w 1957 r. Francis Crick, przewidując istnienie cząsteczki adaptorowej, która mogłaby łączyć mRNA z syntetyzowanym polipeptydem. Wkrótce potem uświadomiono sobie, że cząsteczkami adaptorowymi są tRNA. Po uznaniu tego faktu zwrócono uwagę na rybosomy – struktury, na których syntetyzowane są białka. Stopniowo zrozumiano szczegóły procesu translacji mRNA na białka (sekcja 13.3).

Rys. 1.26. Kod genetyczny. Kodony w mRNA są odczytywane w kierunku 5’→ 3’. Objaśnienie trzyliterowych skrótów nazw aminokwasów – tab. 1.2

Innym aspektem procesu syntezy białek, który interesował biologów molekularnych w latach 50. XX w., był problem informacyjny odnoszący się do drugiego istotnego powiązania transkryptomu z proteomem: kod genetyczny powinien określać, w jaki sposób sekwencja mRNA jest tłumaczona na sekwencję aminokwasów w białku. W latach 50. XX w. zorientowano się, że kod genetyczny, aby mógł kodować informację o wszystkich 20 aminokwasach wchodzących w skład białek, musi być kodem trójkowym. Oznacza to, że jeden znak kodu, czyli kodon, musi składać się z trzech nukleotydów. Kod dwuliterowy miałby tylko 4² = 16 kodonów, co nie wystarcza do zakodowania wszystkich 20 aminokwasów, podczas gdy kod trzyliterowy może mieć 4³ = 64 kodony. Kod genetyczny rozszyfrowano w latach 60. XX w. na podstawie analizy polipeptydów powstałych po translacji syntetycznych mRNA o znanej lub przewidywalnej sekwencji w bezkomórkowych systemach translacji. Zastosowano również testy wykorzystujące oczyszczone rybosomy i pozwalające określić, jakie aminokwasy wiążą się z rybosomem w obecności mRNA o znanej sekwencji. Po ukończeniu tych doświadczeń okazało się, że 64 kodony można podzielić na grupy. Kodony wchodzące w skład jednej grupy kodują ten sam aminokwas (rys. 1.26). Tylko tryptofan i metionina kodowane są przez jeden kodon, wszystkie pozostałe aminokwasy przez dwa, trzy, cztery lub sześć kodonów. Dlatego mówimy, że kod genetyczny jest zdegenerowany. Kod ma także cztery kodony przestankowe, które określają w mRNA miejsce rozpoczęcia i zakończenia translacji sekwencji nukleotydowej (rys. 1.27). Kodonem inicjacyjnym jest zwykle trójka 5’-AUG-3’, kodująca również metioninę, co powoduje, że większość nowo zsyntetyzowanych polipeptydów rozpoczyna się od metioniny. Jako inicjacyjne, szczególnie u bakterii, mogą być również wykorzystywane inne kodony, takie jak 5’-GUG-3’ i 5’-UUG-3’. Trzy kodony terminacyjne to 5’-UAG-3’, 5’-UAA-3’ i 5’-UGA-3’.

Rys. 1.27. Położenie kodonów przestankowych w mRNA

Kod genetyczny nie jest uniwersalny

Tabela 1.3. Przykłady odstępstw od standardowego kodu genetycznego

Organizm

Kodon

Standardowo koduje

W tym przypadku koduje

(A) Genomy mitochondrialne

Ssaki

UGA

stop

Trp

AGA, AGG

Arg

stop

AUA

Ile

Met

Drosophila

UGA

stop

Trp

AGA

Arg

Ser

AUA

Ile

Met

Saccharomyces cerevisiae

UGA

stop

Trp

CUN

Leu

Thr

AUA

Ile

Met

Grzyby

UGA

stop

Trp

Kukurydza

CGG

Arg

Trp

(B) Genomy jądrowe i prokariotyczne

Niektóre pierwotniaki

UAA, UAG

stop

Gln

Candida cylindracea

CUG

Leu

Ser

Euplotes sp.

UGA

stop

Cys

Mycoplasma sp.

UGA

stop

Trp

(C) Zmiana znaczenia kodonu zależna od kontekstu

Różne organizmy

UGA

stop

selenocysteinę

Archeony

UAG

stop

pirolizynę

Skróty: N – dowolny nukleotyd

Początkowo sądzono, że kod genetyczny musi być taki sam we wszystkich organizmach. Uważano, że po powstaniu kodu jakakolwiek jego zmiana byłaby niemożliwa, gdyż wprowadzałaby nowe znaczenie poszczególnych kodonów. Prowadziłoby to do dużych zmian w sekwencji aminokwasowej białek. Rozumowanie to wydaje się trafne, ale, co dziwne, w rzeczywistości kod genetyczny nie jest uniwersalny. Kod przedstawiony na rys. 1.26 jest wykorzystywany w ogromnej większości genów prawie we wszystkich organizmach, choć odstępstwa od tej zasady są często spotykane. W szczególności genomy mitochondrialne często wykorzystują kod niestandardowy (tab. 1.3A). Po raz pierwszy odkryła to w 1979 r. grupa Frederika Sangera z Cambridge w Wielkiej Brytanii. Badacze ci stwierdzili, że wiele ludzkich genów mitochondrialnych zawiera kodony 5’-UGA-3’, które zazwyczaj pełnią funkcję kodonów terminacyjnych. Kodony te występowały w pozycjach środkowych, w których nie spodziewano się zatrzymywania translacji. Analiza sekwencji białek kodowanych przez te geny wykazała, że kodon 5’-UGA-3’ jest w ludzkich mitochondriach kodonem tryptofanowym oraz że w tym szczególnym systemie genetycznym jest to tylko jedno z czterech odstępstw od kodu standardowego. Również w innych organizmach geny mitochondrialne wykazują odstępstwa od standardowego kodu genetycznego. Jednak przynajmniej w jednym z tych przypadków, a mianowicie zastosowania kodonu 5’-CGG-3’ jako kodonu tryptofanowego w mitochondriach roślin, prawdopodobnie jest to korygowane w procesie redagowania RNA przed rozpoczęciem translacji.

Rys. 1.28. Zmiana znaczenia kodonu 5’-UGA-3’ zależna od kontekstu. Kodon 5’-UGA-3’ kodujący selenocysteinę jest odróżniany dzięki obecności na mRNA struktury typu łodyżka–pętelka. U Prokaryota (pokazane na rysunku) struktura ta położona jest tuż poniżej kodonu selenocysteinowego, a u Eukaryota w obrębie regionu 3’UTR

Niestandardowy kod jest również wykorzystywany w genomach jądrowych niższych Eukaryota. Często modyfikacja ogranicza się do niewielkiej grupy organizmów i przeważnie polega na zmianie znaczenia kodonów terminacyjnych (tab. 1.3B). Wśród Prokaryota modyfikacje są rzadsze, znany jest jeden przypadek u Mycoplasma. Ważniejszą zmianą kodu jest zmiana znaczenia kodonu zależna od kontekstu, z którą mamy do czynienia, gdy syntetyzowane białko zawiera selenocysteinę lub pirolizynę. Białka zawierające pirolizynę występują rzadko, prawdopodobnie tylko w grupie archeonów (rozdz. 8). Jednak białka zawierające selenocysteinę są dość rozpowszechnione u wielu organizmów. Należy do nich np. peroksydaza glutationowa, chroniąca komórki człowieka i innych ssaków przed uszkodzeniami oksydacyjnymi. Selenocysteina jest kodowana przez kodon 5’-UGA-3’, a pirolizyna przez kodon 5’-UAG-3’. W omawianych organizmach kodony te mają więc podwójne znaczenie, ponieważ są również ciągle wykorzystywane jako kodony terminacyjne (tab. 1.3C). Kodon 5’-UGA-3’ kodujący selenocysteinę jest odróżniany od prawdziwych kodonów terminacyjnych dzięki obecności na mRNA struktury typu łodyżka–pętelka (ang. stem–loop), w której pętelka tworzy się przez zagięcie mRNA do tyłu i jednoczesne powstawanie par zasad tworzących łodyżkę utrzymującą całą strukturę (rys. 1.28). U Prokaryota struktura ta położona jest tuż poniżej (ang. downstream) kodonu selenocysteinowego, a u Eukaryota w obrębie regionu 3’UTR, tzn. w części mRNA znajdującej się poniżej kodonu terminacyjnego. W procesie rozpoznania kodonu selenocysteinowego niezbędne jest oddziaływanie między strukturą łodyżka–pętelka a specjalnym białkiem biorącym udział w translacji tych mRNA. Podobny system działa prawdopodobnie przy rozpoznawaniu kodonu pirolizynowego.

Powiązanie proteomu z biochemią komórki

Końcowym wynikiem ekspresji informacji genetycznej zakodowanej w genomie jest białko, którego biologiczne właściwości determinuje sfałdowana struktura i przestrzenne rozmieszczenie grup chemicznych na jej powierzchni. Dzięki temu, że genom koduje różnego rodzaju białka, może on budować i zachowywać proteom, którego ogólne właściwości biologiczne tworzą podstawy życia. Proteom spełnia tę rolę dzięki ogromnej różnorodności struktur białkowych, które mogą się tworzyć. Pozwala to białkom pełnić wiele biologicznych funkcji, do których należą:

• kataliza biochemiczna przeprowadzana przez specyficzny rodzaj białek zwanych enzymami – enzymy są katalizatorami reakcji głównych szlaków metabolicznych dostarczających komórce energię, oraz reakcji biosyntetycznych, w wyniku których powstają kwasy nukleinowe, białka, węglowodany i tłuszcze; kataliza biochemiczna kieruje również ekspresją genomu przez aktywność enzymów, takich jak polimeraza RNA;

• struktura, na poziomie komórkowym determinowana przez białka budujące cytoszkielet – jej utrzymanie jest podstawową funkcją części białek zewnątrzkomórkowych; przykładem jest kolagen, ważny składnik kości i ścięgien;

• ruch zależny od białek kurczliwych, z których najbardziej znane to aktyna i miozyna, tworzące włókna cytoszkieletu;

• transport różnych związków chemicznych w organizmie związany z istotną aktywnością białek, np. hemoglobina transportuje tlen we krwi, a albumina osocza – kwasy tłuszczowe;

• regulacja procesów komórkowych, w której pośredniczą białka sygnałowe, takie jak czynniki transkrypcyjne wiążące się z genomem i wpływające na poziom ekspresji zarówno pojedynczych genów, jak i grup genów (sekcja 12.3); aktywność grup komórek regulują i koordynują zewnątrzkomórkowe hormony i cytokiny, z których wiele jest białkami, np. insulina kontrolująca poziom cukru we krwi lub interleukiny – grupa cytokin regulujących podział i różnicowanie komórek;

• ochrona organizmu i poszczególnych komórek jest funkcją wielu białek, takich jak przeciwciała oraz białka uczestniczące w procesie krzepnięcia krwi;

• funkcje magazynowania są związane z białkami takimi jak ferrytyna, która gromadzi żelazo w wątrobie, oraz gliadyny – białka zapasowe, które są magazynem aminokwasów w nasionach pszenicy w stanie spoczynkowym.

Dzięki tak zróżnicowanym funkcjom białek proteom może przekształcić zapisany w genomie plan w zasadnicze właściwości procesów życia.

Podsumowanie

• Każdy organizm na naszej planecie ma genom przechowujący informację biologiczną.

• Większość genomów jest zbudowana z DNA, z wyjątkiem niektórych genomów wirusowych zbudowanych z RNA.

• Ekspresja genomu to proces, w którym informacja zawarta w genomie jest przekazywana do komórki.

• Pierwszym produktem ekspresji genomu jest transkryptom – zbiór cząsteczek mRNA powstałych po transkrypcji genów aktywnych w komórce w określonym czasie.

• Kolejnym produktem jest proteom – zbiór białek komórki określający charakter reakcji biochemicznych, które dana komórka może przeprowadzać.

• Dowody eksperymentalne potwierdzające, że geny są zbudowane z DNA, otrzymano po raz pierwszy w latach 1945–1952, jednak dopiero odkrycie podwójnej helisy przez Watsona i Cricka w 1953 r. przekonało biologów, że DNA jest faktycznie materiałem genetycznym.

• DNA jest nierozgałęzionym polinukleotydem zbudowanym z wielu kopii czterech chemicznie różnych nukleotydów.

• W podwójnej helisie dwa polinukleotydy są owinięte wokół siebie tak, że zasady azotowe znajdują się wewnątrz cząsteczki.

• Polinukleotydy łączą się wiązaniami wodorowymi pomiędzy zasadami: A zawsze tworzy parę z T, a G – zawsze z C.

• RNA jest również polinukleotydem, ale poszczególne nukleotydy mają inną strukturę niż nukleotydy w DNA. RNA jest zwykle jednoniciowy.

• Komórki zawierają różne rodzaje RNA, między innymi mRNA, które są transkryptami genów kodujących białka, a także wiele innych niekodujących RNA.

• Wiele RNA jest syntetyzowanych wyjściowo jako cząsteczki prekursorowe. Aby uzyskać ostateczną formę, podlegają one dojrzewaniu – reakcjom cięcia i łączenia końców oraz modyfikacjom chemicznym.

• Białka są również nierozgałęzionymi polimerami zbudowanymi z aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi.

• Sekwencja aminokwasów jest pierwszorzędową strukturą białka. Struktury wyższego rzędu – drugorzędowa, trzeciorzędowa i czwartorzędowa – tworzą się przez zwinięcie struktury pierwszorzędowej w trójwymiarowe konformacje oraz przez łączenie się pojedynczych polipeptydów w białka składające się z wielu podjednostek.

• Funkcjonalna różnorodność białek wynika z tego, że tworzące je aminokwasy mają różne właściwości chemicznie. Dlatego łączenie się aminokwasów w rozmaite sekwencje prowadzi do powstania białek różniących się reaktywnością chemiczną.

• Białka są syntetyzowane w procesie translacji, zgodnie z zasadami kodu genetycznego określającego, jaki aminokwas jest kodowany przez daną trójkę (tryplet) nukleotydów.

• Kod genetyczny nie jest uniwersalny. Odstępstwa od jego zasad występują w mitochondriach i u niższych eukariontów. Niektóre kodony w obrębie jednego genu mogą mieć dwa różne znaczenia.

Krótkie pytania otwarte

1. Kiedy odkryto DNA; wykazano, że DNA jest materiałem genetycznym, odkryto strukturę DNA? Kiedy scharakteryzowano pierwszy genom?

2. Jakie dwa rodzaje oddziaływań chemicznych stabilizują strukturę podwójnej helisy?

3. Dlaczego specyficzne łączenie się zasad w pary (A łączy się z T, a G z C) jest podstawą wierności procesu replikacji DNA?

4. Jakie są istotne różnice chemiczne między RNA a DNA?

5. Dlaczego niekodujące RNA nazywane są również funkcjonalnymi RNA?

6. Przedstaw różne etapy w procesie dojrzewania cząsteczek RNA.

7. Czy komórki kiedykolwiek mogą nie mieć transkryptomu? Uzasadnij swoją odpowiedź.

8. Dlaczego wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne i oddziaływania hydrofobowe odgrywają ważną rolę w pierwszorzędowej, drugorzędowej, trzeciorzędowej i czwartorzędowej strukturze białek?

9. Dlaczego białka mogą tak bardzo różnić się strukturalnie i funkcjonalnie, skoro są syntetyzowane tylko z 20 aminokwasów?

10. Chemiczna różnorodność białek wynika z tego, że składają się one z 20 aminokwasów, a także z dwóch dodatkowych czynników. Jakie to czynniki i jakie mają znaczenie?

11. W jaki sposób kodon 5’-UGA-3’ funkcjonuje zarówno jako kodon stop, jak i kodon dla zmodyfikowanego aminokwasu selenocysteiny?

12. W jaki sposób genom kieruje aktywnością biologiczną komórki?

Pytania problemowe

1. W tekście jest stwierdzenie, że Watson i Crick odkryli strukturę podwójnej helisy DNA w sobotę 7 marca 1953 r. Uzasadnij to stwierdzenie.

2. Przedyskutuj, dlaczego podwójna helisa prawie natychmiast uzyskała ogólną akceptację jako właściwa struktura DNA.

3. Jakie eksperymenty doprowadziły do rozszyfrowania kodu genetycznego w latach 60. XX w.?

4. Dlaczego polipeptydy mogą występować w wielu różnych formach strukturalnych, a polinukleotydy nie?

5. Uważa się, że transkryptom i proteom są, odpowiednio, pośrednim i końcowym produktem ekspresji genomu. Oceń zalety i ograniczenia tych definicji dla naszego zrozumienia ekspresji genomu.

Literatura uzupełniająca

Książki i artykuły opisujące odkrycie podwójnej helisy oraz inne ważne momenty przełomowe w badaniach DNA

Brock T.D. (1990). The Emergence of Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. (Opisuje szczegółowo prace nad czynnikiem transformującym oraz doświadczenia Hersheya i Chase).

Judson H.F. (1996). The Eighth Day of Creation. Makers of the revolution in Biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. (Bardzo poczytny opis rozwoju biologii molekularnej do lat 90.).

Kay L.E. (1996). The Molecular Vision of Life. Oxford University Press. Oxford. (Zawiera szczegółowe wyjaśnienie, dlaczego początkowo uważano, że geny są zbudowane z białek).

Lander E.S., Weinberg R.A. (2000). Genomics: Journey to the center of biology. Science 287: 1777–1782. (Krótki opis genetyki i biologii molekularnej od Mendla do sekwencji genomu ludzkiego).

Maddox B. (2003). Rosalind Franklin: The Dark Lady of DNA. HarperCollins, London.

McCarty M. (1986). The Transforming Principle: Discovering that Genes are Made of DNA. Norton, London.

Olby R. (2012). The Path to the Double Helix. Dover Publications, Mineola. New York. (Naukowa relacja opisująca badania, które doprowadziły do odkrycia podwójnej helisy).

Watson J.D. (1968). The Double Helix. Atheneum. London. (Najważniejsze odkrycie XX w. opisane w stylu opery mydlanej).

Artykuły oryginalne i przeglądowe opisujące ważne aspekty dotyczące struktury DNA, RNA i białek

Altona C., Sundaralingam M. (1972). Conformational analysis of the sugar ring in nucleosides and nucleotides: a new description using the concept of pseudorotation. Journal of the American Chemical Society 94:8205–8212. (Informacje na temat konformacji cukrów).

Eisenberg D. (2003). The discovery of the α-helix and β-sheet, the principal structural features of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100:11207–11210.

Pauling L., Corey R.B. (1951). The pleated sheet, a new layer configuration of polypeptide chains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 37:251–256. (Pierwszy opis harmonijki β – β kartki).

Pauling L., Corey R.B., Branson H.R. (1951). The structure of proteins: two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 37:205–211 (Pierwszy opis helisy α).

Ravichandran S., Subramani V.K., Kim K.K. (2019). Z-DNA in the genome: From structure to disease. Biophys. Rev. 11:383–387.

Watson J.D., Crick F.H.C. (1953). Molecular structure of nucleic acids: A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171:737–738. (Naukowy opis odkrycia struktury podwójnej helisy DNA).

Yakovchuk P., Protozanova E., Frank-Kamenetskii M.D. (2006). Base-stacking and base-pairing contributions into thermal stability of the DNA double helix. Nucleic Acids Research 34:564–574.

Zacharias M. (2020). Base-pairing and base-stacking contributions to double-stranded DNA formation. J. Phys. Chem B 124:10345–10352.

Zasoby internetowe

Protein Data Bank. https://www.wwpdb.org/. Archiwum informacji o trzeciorzędowych strukturach białek i kwasów nukleinowych.

Kody genetyczne. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi. Informacje o niestandardowych kodach genetycznych u różnych gatunków; także na stronie https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_genetic_codes.