Projekt okładki i stron tytułowych: Lidia Michalak

Ilustracja na okładce: Fotolia/LaCozza

Wydawca: Katarzyna Włodarczyk-Gil

Redaktor prowadzący: Adam Kowalski

Redaktor merytoryczny: Ewa Czarnecka-Żołek

Produkcja: Mariola Grzywacka

Reklama: Agnieszka Borzęcka agnieszka.borzecka@pwn.com.pl

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwa Naukowego PWN: Marcin Kapusta / konwersja.virtualo.pl

W książce użyto znaków towarowych i nazw będących znakami towarowymi; nazwa taka zaczyna się wielką literą. Wydawca oświadcza, że zrobiono to z myślą tylko o tej publikacji i z taką intencją, aby było to z korzyścią dla właściciela znaku, bez zamiaru naruszenia znaku towarowego.

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © by Wydawnictwa Naukowo-Techniczne

Warszawa 1992, 2011

Copyright © by Wydawnictwo Naukowe PWN

Warszawa 2017

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2017 r., (wyd. VI)

Warszawa 2017

ISBN 978-83-01-19248-8

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl www.pwn.pl

Spis treści

Przedmowa

1. Wprowadzenie

1.1. Krótka historia chromatografii

1.2. Znaczenie chromatografii

1.3. Istota rozdzielania chromatograficznego

1.4. Rodzaje chromatografii i techniki chromatograficzne

Literatura uzupełniająca

2. Chromatografia gazowa

2.1. Aparatura do chromatografii gazowej

2.2. Gazy nośne

2.3. Dozowniki i urządzenia dozujące

2.3.1. Ogólne zasady dozowania próbek

2.3.2. Chromatografia pirolityczna

2.3.3. Dozowanie do kolumn pakowanych

2.3.4. Dozowanie próbek gazowych

2.3.5. Dozowanie do kolumn kapilarnych

2.3.6. Dozowniki automatyczne

2.3.7. Uwagi ogólne dotyczące dozowania próbek do chromatografu

2.4. Kolumny

2.4.1. Kolumny pakowane

2.4.2. Kolumny kapilarne

2.4.3. Eksploatacja kolumn kapilarnych

2.5. Wypełnienia kolumn

2.5.1. Wprowadzenie

2.5.2. Adsorbenty

2.5.3. Nośniki ciekłych faz stacjonarnych

2.5.4. Ciekłe fazy stacjonarne

2.5.5. Fazy stacjonarne zalecane do analizy różnych związków chemicznych

2.5.6. Dobór kolumny chromatograficznej

2.6. Wpływ temperatury kolumny na rozdzielanie chromatograficzne

2.7. Sprawność kolumn

2.8. Detektory

2.8.1. Wprowadzenie

2.8.2. Detektor cieplno-przewodnościowy

2.8.3. Detektor płomieniowo-jonizacyjny

2.8.4. Detektor płomieniowo-fotometryczny

2.8.5. Detektor chemiluminescencyjny siarkowy

2.8.6. Detektor termojonowy

2.8.7. Detektor wychwytu elektronów

2.8.8. Detektor argonowy

2.8.9. Detektor helowy

2.8.10. Detektor fotojonizacyjny

2.8.11. Detektor jonizacyjno-wyładowczy

2.8.12. Detektor w zakresie nadfioletu próżniowego

2.8.13. Detektor jonizacyjny z wyładowaniem przez barierę

2.8.14. Detektor jonizacji elektronowej

2.9. Komputery

2.10. Połączenie chromatografii gazowej z innymi technikami analizy instrumentalnej

2.10.1. Wprowadzenie

2.10.2. Połączenie chromatografu gazowego ze spektrometrem mas

2.10.3. Chromatografia gazowa sprzężona z tandemową spektrometrią mas (GC-MS/MS)

2.10.4. Połączenie chromatografu gazowego ze spektrometrem ruchliwości jonów

2.10.5. Połączenie chromatografu gazowego ze spektrometrem podczerwieni

2.10.6. Połączenie chromatografu gazowego ze spektrometrem emisji atomowej

2.10.7. Techniki łączone – ich zalety i wady

2.11. Szybka chromatografia gazowa

2.12. Pełna dwuwymiarowa chromatografia gazowa

2.13. Wielkości retencyjne

2.14. Analiza jakościowa

2.15. Analiza ilościowa

2.16. Wybrane przykłady analitycznych zastosowań chromatografii gazowej łączonej ze spektrometrią mas

Literatura uzupełniająca

3. Chromatografia cieczowa

3.1. Wprowadzenie

3.2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa kolumnowa

3.2.1. Chromatografy cieczowe

3.2.2. Pompy

3.2.3. Dozowniki

3.2.4. Kolumny i ich napełnianie

3.2.5. Wypełnienia kolumn

3.2.6. Kolumny monolityczne

3.2.7. Trwałość kolumn do HPLC i zasady ich używania

3.2.8. Sprawność i selektywność kolumn

3.2.9. Temperatura kolumny

3.2.10. Fazy ruchome

3.2.11. Rozdzielanie związków chiralnych

3.2.12. Detektory

3.2.13. Analiza jakościowa

3.2.14. Analiza ilościowa

3.2.15. Chromatografia jonowa

3.2.16. Chromatografia wykluczania

3.2.17. Chromatografia powinowactwa

3.2.18. Chromatografia micelarna i mikroemulsyjna

3.2.19. Chromatografia oddziaływań hydrofilowych

3.2.20. Chromatografia par jonowych

3.2.21. Chromatografia przeciwprądowa

3.2.22. Szybka chromatografia cieczowa

3.2.23. Dwuwymiarowa chromatografia cieczowa kolumnowa

3.2.24. Wybrane przykłady zastosowania chromatografii cieczowej połączonej z innymi metodami analizy

3.3. Chromatografia planarna

3.3.1. Wprowadzenie

3.3.2. Płytki do chromatografii cienkowarstwowej

3.3.3. Bibuły chromatograficzne

3.3.4. Sorbenty do chromatografii cienkowarstwowej

3.3.5. Eluenty

3.3.6. Nanoszenie próbek

3.3.7. Sposoby rozwijania chromatogramów

3.3.8. Komory do chromatografii cienkowarstwowej

3.3.9. Chromatografia cienkowarstwowa z zastosowaniem pola elektrycznego

3.3.10. Wizualizacja chromatogramów

3.3.11. Dokumentacja i przechowywanie chromatogramów

3.3.12. Chromatogramy planarne

3.3.13. Analiza jakościowa

3.3.14. Analiza ilościowa

3.3.15. Połączenie chromatografii cienkowarstwowej z innymi technikami chromatograficznymi

3.3.16. Normalizacja w TLC

3.3.17. Zastosowanie chromatografii bibułowej do szybkiego wykrywania jonów i związków chemicznych

Literatura uzupełniająca

4. Chromatografia nadkrytyczna

4.1. Wprowadzenie

4.2. Fazy ruchome

4.3. Warunki chromatografowania

4.4. Aparatura

4.4.1. Wiadomości ogólne

4.4.2. Pompy

4.4.3. Dozowniki

4.4.4. Kolumny

4.4.5. Detektory

4.4.6. Restryktory

4.5. Połączenie ekstrakcji nadkrytycznej i chromatografii nadkrytycznej z innymi rodzajami chromatografii

4.6. Zastosowanie chromatografii nadkrytycznej

4.6.1. Wiadomości ogólne

4.6.2. Analiza węglowodorów i ich pochodnych

4.6.3. Analiza kwasów

4.6.4. Analiza leków i substancji biologicznie czynnych

4.6.5. Analiza amin

4.6.6. Rozdzielanie związków chiralnych

4.6.7. Rozdzielanie oligomerów

4.6.8. Analiza materiałów wybuchowych

4.6.9. Analiza różnych związków chemicznych

4.7. Wnioski

Literatura uzupełniająca

5. Kapilarne techniki elektromigracyjne

5.1. Istota kapilarnych technik elektromigracyjnych

5.2. Aparatura do elektroforezy kapilarnej i zasada rozdzielania składników mieszanin

5.2.1. Kapilary

5.2.2. Bufory i naczynka na wlocie i wylocie kapilary

5.2.3. Dozowanie próbek

5.2.4. Zasilacze

5.2.5. Detektory

5.2.6. Kolektory frakcji

5.3. Interpretacja elektroforegramów

5.4. Przepływ elektroosmotyczny

5.5. Odwrócony przepływ elektroosmotyczny

5.6. Mechanizm rozdzielania elektroforetycznego

5.7. Ruchliwość elektroforetyczna

5.8. Charakterystyka rozdzielania w elektroforezie kapilarnej

5.8.1. Czas rozdzielania

5.8.2. Sprawność elektroforezy kapilarnej

5.8.3. Selektywność

5.8.4. Rozdzielczość

5.9. Micelarna chromatografia elektrokinetyczna (MEKC)

5.10. Kapilarna elektroforeza żelowa (CGE)

5.11. Kapilarne ogniskowanie izoelektryczne (CIEF)

5.12. Izotachoforeza kapilarna (CITP)

5.13. Elektrochromatografia kapilarna (CEC)

5.14. Uwagi dotyczące opracowywania warunków i wyników analizy za pomocą elektroforezy kapilarnej

5.14.1. Analiza jakościowa

5.14.2. Analiza ilościowa

5.15. Niektóre problemy występujące w elektroforezie kapilarnej

5.16. Zastosowanie elektroforezy kapilarnej

5.17. Wybrane przykłady zastosowań elektroforezy łączonej ze spektrometrią mas

Literatura uzupełniająca

6. Przygotowanie próbek do analizy chromatograficznej

6.1. Znaczenie przygotowania próbek

6.2. Przygotowanie próbek gazowych

6.2.1. Pobieranie próbek bez zatężania

6.2.2. Absorpcja analitów w cieczy

6.2.3. Adsorpcja analitów

6.3. Przygotowanie próbek ciekłych

6.3.1. Ekstrakcja ciecz-ciecz

6.3.2. Ekstrakcja ciecz-gaz

6.3.3. Ekstrakcja ciecz-ciało stałe

6.3.4. Mikroekstrakcja do fazy upakowanej

6.3.5. Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej

6.3.6. Dynamiczna ekstrakcja do fazy stacjonarnej

6.3.7. Ekstrakcja kroplą rozpuszczalnika

6.3.8. Ekstrakcja ruchomym elementem sorpcyjnym

6.3.9. Destylacja

6.4. Przygotowanie próbek stałych

6.4.1. Ekstrakcja gazami i rozpuszczalnikami

6.4.2. Ekstrakcja nadkrytyczna

6.5. Przeprowadzanie analitów w pochodne

Literatura uzupełniająca

Stosowane akronimy

Przypisy

Przedmowa

Świat, który znamy, jest określany przez niektórych jako matematyczny, bo wszystko można opisać za pomocą zależności matematycznych. Inni twierdzą, że świat jest fizyczny bo wszystko zachodzi według praw i zasad fizyki. Świat jest jednak przede wszystkim chemiczny. Jest on zbiorem pierwiastków i związków chemicznych, z których składa się wszystko co istnieje, także ciało człowieka.

Według Chemical Abstracts Service w 2016 roku znanych było ponad 120 milionów związków chemicznych. Ciało człowieka składa się z ok. 750 000 związków chemicznych, a w produktach spalania tytoniu znaleziono ok. 5000 związków chemicznych. Substancje chemiczne są przedmiotem badań w ramach różnych nauk chemicznych. Wyróżnia się na przykład chemie: nieorganiczną, organiczną i fizyczną. Każda z tych dziedzin nauki potrzebuje wiedzy o składzie i przemianach różnych mieszanin substancji chemicznych. Wiedzę tę uzyskuje się w wyniku analizy chemicznej. Świadczy to o dużej roli chemii analitycznej w rozwoju wiedzy o świecie.

Wśród wielu metod analizy chemicznej największe znaczenie ma chromatografia. Jest to metoda, która umożliwia badanie składu dowolnych mieszanin substancji chemicznych występujących w bardzo różnych ilościach obok siebie. Można te substancje wykrywać, identyfikować i oznaczać ilościowo. Możliwe jest przy tym wykrywanie niektórych substancji na poziomie zbliżonym do ich ilości femtogramowych (10–15 g).

Chromatografia jest znana od ponad stu lat i wciąż się rozwija. Jej możliwości dotyczące analizy, badań fizykochemicznych i otrzymywania czystych substancji w skali laboratoryjnej i przemysłowej są coraz większe. W niniejszej książce chromatografia jest opisana jako metoda analityczna. Zajmując się analizą chromatograficzną od dawna, mieliśmy okazję śledzić jej rozwój i wzrost znaczenia w Polsce i na świecie. Nie ma chyba już laboratorium analitycznego, w którym nie byłoby chociaż jednego chromatografu. Często jest ich kilka – gazowych i cieczowych. Korzystne jest wyposażenie laboratorium także w aparaturę do chromatografii cienkowarstwowej i do elektroforezy kapilarnej oraz do chromatografii nadkrytycznej. Wynika to z doskonałości aparatury i bogactwa technik oraz procedur wzajemnie się uzupełniających i umożliwiających rozwiązywanie nawet bardzo skomplikowanych problemów analitycznych.

Chromatografii poświęca się coraz więcej uwagi w szkolnictwie, głównie wyższym, wprowadzając do programów wykłady i ćwiczenia laboratoryjne z chromatografii. Organizowane są studia podyplomowe i kursy chromatograficzne. Do tego potrzebne są podręczniki. Jednym z podręczników wykorzystywanych w nauczaniu i uczeniu się chromatografii, są Podstawy chromatografii. Podręcznik ten ukazał się po raz pierwszy w 1992 r., a następne wydania w latach 1995, 2000, 2005 i 2012. Każde kolejne wydanie różniło się od poprzedniego. W każdym następnym było więcej wiadomości niż w poprzednim. Książka wydana w 1992 r. miała 253 strony, a wydana w 2012 r. – 453 strony. Ale nie tylko liczbą stron i zakresem opisywanych wiadomości różniły się poszczególne wydania Podstaw. Były one, w miarę coraz lepszego rozumienia i rozwoju chromatografii, poprawiane, uzupełniane i zmieniana była nomenklatura chromatograficzna. W tym, że książka była coraz lepsza pomogli Czytelnicy, którzy zwracali uwagę na to, co należało zmienić albo poprawić. Szczególnie dziękujemy dr inż. Ewie Śliwce z Politechniki Wrocławskiej za jej wnikliwe uwagi merytoryczne i redakcyjne.

Niniejsze wydanie książki uzupełniono o nowe aktualne wiadomości, szczególnie dotyczące chromatografii cieczowej. Wiadomości, które straciły na aktualności, np. dotyczące kolumn pakowanych w chromatografii gazowej zostały usunięte.

Od poprzedniego wydania niniejszej książki ukazały się dwie książki w języku polskim zawierające szczegółowe opisy dwóch technik chromatograficznych, których podstawy są opisane w niniejszej książce. Są to książki: Techniki elektromigracyjne. Teoria i praktyka pod redakcją B. Buszewskiego, E. Dziubakiewicza i M. Szumskiego oraz Chromatografia jonowa, której autorem jest Rajmund Michalski. Ukazał się też słownik chromatograficzny: Chromatografia i techniki elektromigracyjne. Słownik pięciojęzyczny. Jest to praca zbiorowa pod redakcją Z. Witkiewicza i E. Śliwki.

Mamy nadzieję, że podobnie jak poprzednie wydania, nowe Podstawy będą dobrze służyły kolejnym rocznikom studentów i tym Czytelnikom, którzy kiedyś uczyli się chromatografii i stosują ją w swojej pracy, a chcieliby znajomość chromatografii uaktualnić i pogłębić.

Doświadczeni chromatografiści wiedzą, że chromatografia służy do rozdzielania związków chemicznych, ale łączy ludzi. Byłoby dobrze, gdyby to łączenie mogło zachodzić także za pośrednictwem niniejszej książki.

Autorzy

2. Chromatografia gazowa

2.6. Wpływ temperatury kolumny na rozdzielanie chromatograficzne

Temperatura kolumny jest czynnikiem, który oprócz rodzaju kolumny i jej wypełnienia (adsorbentu lub fazy ciekłej) wywiera bardzo duży wpływ na efekt rozdzielania chromatograficznego. Dobór odpowiedniej temperatury chromatografowania zależy od temperatury wrzenia (lotności) składników rozdzielanej mieszaniny i od rodzaju zastosowanego wypełnienia kolumny.

Gdy temperatury wrzenia wszystkich składników próbki nie różnią się więcej niż o kilkadziesiąt stopni, wówczas można utrzymywać jednakową temperaturę kolumny w czasie rozdzielania składników tej próbki. Jest to chromatografia izotermiczna. Takie temperaturowe warunki chromatografowania są dobre, jeżeli piki na chromatogramie są rozłożone równomiernie i nie ma dużych odstępów między nimi.

Temperatura kolumny w chromatografii podziałowej powinna być zbliżona do temperatury wrzenia analizowanych substancji – zwykle nieco niższa. W chromatografii adsorpcyjnej temperatura kolumny jest zwykle wyższa, niekiedy dużo wyższa, od temperatury wrzenia substancji chromatografowanych.

Ogólna zależność między temperaturą kolumny a uzyskiwanymi wynikami rozdzielania jest następująca: podwyższanie temperatury pogarsza rozdzielenie, a obniżanie temperatury – polepsza je. Zbyt niska temperatura kolumny powoduje jednak poszerzanie i niesymetryczność pików. W konsekwencji uzyskuje się zły chromatogram, a ponadto rozmycie pików może być tak duże, że śladowe ilości analizowanych substancji mogą nie być wykryte. Jednocześnie wydłuża się czas rozdzielania i dlatego należy stosować optymalną temperaturę kolumny. Wzrost temperatury kolumny o 20–25°C skraca czas rozdzielania o ok. połowę. Zależność wpływu temperatury na efekt rozdzielania przedstawiono na rys. 2.18.

Rysunek 2.18. Chromatogramy tej samej mieszaniny węglowodorów w zależności od temperatury kolumny: a) 75°C, b) 110°C, c) 130°C

Wpływ temperatury na czas rozdzielania jest większy w przypadku kolumn o długości poniżej 10 m, o średnicy poniżej 0,2 mm i przy przepływach ponad 100 cm/s, w porównaniu z tym wpływem w przypadku kolumn dłuższych, o większych średnicach i przy mniejszych przepływach gazu nośnego. Podobna zależność istnieje w przypadku kolumn pakowanych.

Gdy temperatury wrzenia rozdzielanych składników różnią się między sobą znacznie – np. o 100°C (często to występuje, gdy w mieszaninie jest 10 lub więcej składników), wówczas znalezienie optymalnej temperatury kolumny może być trudne lub nawet niemożliwe. Przy chromatografowaniu takich wieloskładnikowych mieszanin temperatura może być albo zbyt niska dla składników o wysokich temperaturach wrzenia, albo za wysoka dla składników o niskich temperaturach wrzenia, lub niewłaściwa dla jednych i drugich. W takich sytuacjach stosuje się programowanie temperatury kolumny. Zwykle postępuje się w taki sposób, że po pewnym czasie utrzymywania stałej temperatury zwiększa się ją przez czas wcześniej zaprogramowany, a następnie utrzymuje na osiągniętym poziomie, także przez określony czas. Takie postępowanie w przypadku próbki ze zbyt dużymi odstępami pików składników mieszaniny o wysokich temperaturach wrzenia, w porównaniu z chromatografowaniem izotermicznym, przedstawiono na rys. 2.19. Niekiedy jest konieczne powtórzenie tego cyklu przy dalszym podwyższaniu temperatury. Czasem wystarcza tylko liniowe podwyższanie temperatury – jak w przykładzie na rys. 2.20.

Rysunek 2.19. Chromatogramy składników mieszaniny otrzymane: a) w warunkach izotermicznych (temp. 60°C), b) w warunkach programowania temperatury wg podanego wykresu

W celu powtórzenia analizy tej samej próbki temperaturę kolumny obniża się do temperatury początkowej (zwykle automatycznie) i po zadozowaniu próbki powtarza się programowany wzrost temperatury. Opracowując warunki programowania temperatury, optymalizuje się czas i wartość temperatury początkowej, czas i wartość temperatury końcowej oraz szybkość wzrostu temperatury – od początkowej do końcowej. Korzystne może być ustalenie początkowej temperatury tak niskiej, aby wszystkie składniki próbki (oprócz rozpuszczalnika) zostały zatrzymane podczas dozowania na wlocie do kolumny. W takiej sytuacji temperatura początkowa w małym stopniu wpływa na czas rozdzielania składników mieszaniny. Czas ten zależy głównie od szybkości wzrostu temperatury. Temperatura końcowa powinna być wystarczająco wysoka, aby chromatografowane składniki były eluowane w postaci wąskich pików i aby w kolumnie nie pozostały składniki o małej lotności.

Rysunek 2.20. Chromatogramy składników mieszaniny otrzymane: a) w warunkach izotermicznych (temp. 100°C), b) w warunkach programowania temperatury wg podanego schematu

Szybkość wzrostu temperatury jest bardzo ważnym czynnikiem, ponieważ określa ona czas analizy i jakość uzyskanego rozdzielenia (podobnie jak wartość temperatury w chromatografii izotermicznej). Im szybciej wzrasta temperatura, tym krótszy jest czas rozdzielania składników, ale efekt rozdzielania może być gorszy. Typowa szybkość programowania temperatury wynosi 2–10°C/min, ale może wynosić 120 a w szybkiej chromatografii nawet 1200°C/min. W ostatnim przypadku kolumnę ogrzewa się w ciągu niecałej minuty.

Kolumny w termnostatach są ogrzewane i chłodzone zwykle za pośrednictwem powietrza. W szybkiej chromatografii gazowej i w przenośnych chromatografach gazowych stosuje się też bezpośrednie ogrzewanie kolumn za pomocą prądu elektrycznego.

Przy programowaniu temperatury w chromatografii podziałowej może wystąpić zjawisko dryftu (przesuwania się) linii podstawowej chromatogramu. Zasadniczą przyczyną tego zjawiska jest wynoszenie fazy stacjonarnej z kolumny, wskutek wzrostu jej lotności, przy podwyższaniu temperatury. Dlatego do chromatografii z programowaniem temperatury należy stosować fazy stacjonarne stabilne chemicznie i termicznie w szerokim zakresie temperatur oraz gazy nośne niezawierające tlenu i wilgoci.

Programowanie temperatury stosuje się z reguły przy chromatografowaniu z użyciem kolumn kapilarnych. Jest to związane z tym, że te kolumny są zwykle stosowane do rozdzielania składników złożonych mieszanin. Składniki te przeważnie różnią się znacznie temperaturami wrzenia. W kolumnach kapilarnych z zasady stosuje się fazy stacjonarne o małej lotności w szerokim zakresie temperatur, często związane chemicznie ze ściankami kapilar lub sieciowane.