Bezpłatny fragment

Wstęp – kilka słów o mnie i o tej książce

Podziękowania

1. Jak rozwijała się spektrometria mas?

2. Podstawowe pojęcia, czyli co i jak mierzymy w spektrometrii mas

2.1. Czym jest spektrometria mas?

2.2. Widmo masowe

2.3. Co właściwie mierzymy w spektrometrze mas, czyli parę słów o masie atomowej i cząsteczkowej

2.4. Izotopologi, izotopomery i profile izotopowe

2.5. Zdolność rozdzielcza spektrometru mas i jej wpływ na wygląd widma masowego

2.6. Jak jest zbudowany spektrometr mas?

3. Od próbki w fiolce do jonów w próżni, czyli o technikach jonizacji i źródłach jonów

3.1. Wprowadzenie

3.2. Jonizacja elektronowa (EI)

3.3. Jonizacja chemiczna (CI)

3.3.1. Jonizacja chemiczna w trybie jonów dodatnich

3.3.2. Jonizacja chemiczna w trybie jonów ujemnych

3.4. Jonizacja elektrosprej (ESI)

3.4.1. Wprowadzenie

3.4.2. Zasada działania jonizacji elektrosprej i budowa źródeł jonów ESI

3.4.3. Budowa źródeł jonów elektrosprej

3.5. Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI)

3.6. Fotojonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym (APPI)

3.7. Metody desorpcyjne

3.7.1. Desorpcja laserowa z udziałem matrycy (MALDI)

3.7.2. Desorpcyjny elektrosprej (DESI)

3.7.3. Bezpośrednia analiza w czasie rzeczywistym (DART)

3.7.4. Sonda do analizy próbek pod ciśnieniem atmosferycznym (ASAP)

3.8. Inne metody jonizacji związków organicznych

3.8.1. Bombardowanie szybkimi atomami (FAB) i spektrometria jonów wtórnych z użyciem ciekłej matrycy (LSIMS)

3.8.2. Jonizacja polem i desorpcja polem

3.9. Metody jonizacji – podsumowanie

4. Jak rozróżnić jony o różnych masach, czyli o analizatorach masy

4.1. Analizator magnetyczny

4.2. Analizatory masy złożone z analizatora magnetycznego i elektrycznego

4.3. Analizator kwadrupolowy

4.4. Analizator czasu przelotu

4.5. Kwadrupolowa pułapka jonowa

4.6. Jonowy rezonans cyklotronowy z transformacją Fouriera (FT-ICR)

4.7. Analizator masy typu Orbitrap

4.8. Analizatory tandemowe i hybrydowe

4.9. Analizatory masy – podsumowanie

5. Detekcja jonów i przetwarzanie danych w spektrometrii mas

5.1. Detektory stosowane w spektrometrach mas

5.2. Przetwarzanie i rejestracja sygnału z detektora spektrometru mas

6. Techniki sprzężone w spektrometrii mas

6.1. Chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas

6.2. Chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas

7. Pomiary widm masowych i podstawy ich interpretacji

7.1. Wyznaczanie masy cząsteczkowej

7.1.1. Pomiar masy cząsteczkowej z wykorzystaniem jonizacji EI i CI

7.1.2. Pomiar masy cząsteczkowej z wykorzystaniem jonizacji elektrosprej i metod pokrewnych

7.2. Dokładny pomiar masy jonu i wyznaczanie wzoru sumarycznego

7.3. Wyznaczanie wzoru strukturalnego związku organicznego z wykorzystaniem spektrometrii mas

7.3.1. Identyfikacja związków organicznych z wykorzystaniem komputerowych bibliotek widm masowych

7.3.2. Pomiary widm masowych z wykorzystaniem fragmentacji pod wpływem zderzeń

7.3.3. Techniki pomocnicze

7.4. Ocena czystości próbki. Typowe zanieczyszczenia w spektrometrii mas

8. Mechanizmy fragmentacji jonów w spektrometrii mas

8.1. Podstawy fizykochemiczne procesów fragmentacji

8.2. Jakościowe teorie fragmentacji jonów w spektrometrii mas – wprowadzenie

8.3. Najważniejsze mechanizmy fragmentacji jonów w spektrometrii mas

8.3.1. Rozerwanie wiązania σ inicjowane przez oderwanie jednego z jego elektronów

8.3.2. Rozpad α inicjowany miejscem rodnikowym (rozpad homolityczny)

8.3.3. Rozpad inicjowany ładunkiem (rozpad heterolityczny)

8.3.4. Reakcje przegrupowania wodoru w jonach nieparzystoelektronowych

8.3.5. Reakcje przegrupowania wodoru w jonach parzystoelektronowych

8.3.6. Reakcje fragmentacji związków o budowie pierścieniowej

8.4. Przykłady analizy widm EI wybranych związków

8.4.1. Węglowodory nasycone – 3-metyloheksan

8.4.2. Alkohole alifatyczne – 3-metyloheptan-3-ol

8.4.3. Aminy alifatyczne – N-metylo-N-propylobutyloamina

8.4.4. Ketony alifatyczne – 5-metylooktan-4-on i 6-metylohept-5-en-2-on

8.4.5. Estry – ester metylowy kwasu heksanowego, octan benzylu i ftalan diizooktylu

8.4.6. Kwasy orto- i para-hydroksybenzoesowe – praktyczne wykorzystanie „efektu orto”

8.5. Fragmentacja jonów pseudomolekularnych otrzymywanych w łagodnych metodach jonizacji

8.6. Analiza fragmentacji wybranych związków organicznych

8.6.1. Klopidogrel

8.6.2. Olanzapina

8.6.3. Półprodukt do otrzymywania repaglinidu

8.6.4. Digoksyna i jej zanieczyszczenie

9. Zastosowania spektrometrii mas w biochemii

9.1. Peptydy i białka

9.2. Nukleozydy, nukleotydy i kwasy nukleinowe

9.3. Sacharydy

9.4. Lipidy

9.4.1. Kwasy tłuszczowe

9.4.2. Glicerydy

9.4.3. Fosfolipidy

9.4.4. Sfingolipidy

9.4.5. Sacharolipidy

9.4.6. Steroidy i związki pokrewne

9.4.7. Izoprenoidy i poliizoprenoidy

9.5. Spektrometria mas w metabolomice

10. Wykorzystanie spektrometrii mas do badania mechanizmów reakcji i oddziaływań niekowalencyjnych

10.1. Badania mechanizmów reakcji w roztworach za pomocą spektrometrii mas

10.2. Badania reakcji jonów z cząsteczkami obojętnymi w fazie gazowej

10.3. Badania oddziaływań niekowalencyjnych w spektrometrii mas

11. Spektrometria ruchliwości jonów sprzężona ze spektrometrią mas (IM-MS)

12. Badania powierzchni za pomocą spektrometrii mas

12.1. Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) jako metoda obrazowania powierzchni

12.2. Spektrometria mas jonów wtórnych (SIMS)

13. Oznaczanie pierwiastków z wykorzystaniem spektrometrii mas: metoda ICP-MS

Aneks 1. Dokładne masy atomowe i składy izotopowe pierwiastków występujących na Ziemi i otrzymanych sztucznie

Aneks 2. Widma masowe najczęściej stosowanych wzorców do kalibracji spektrometrów mas

Wykaz skrótów, akronimów i symboli stosowanych w książce

Literatura

Przypisy

Projekt okładki i stron tytułowych Lidia Michalak

Zdjęcie na okładce fot. neznamco/123RF

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Redakcja i korekta Mieczysława Kompanowska

Koordynator produkcji Mariola Grzywacka

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwo Naukowe PWN Michał Latusek

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl.

Polska Izba Książki

Copyright © by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 2020

ISBN 978-83-01-21447-0

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2020r. (wyd. I)

Warszawa 2020

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

WSTĘP – KILKA SŁÓW O MNIE I O TEJ KSIĄŻCE

W dobie wszechobecnego, ogólnodostępnego Internetu zdobycie potrzebnej informacji może wydawać się bardzo łatwe. Wystarczy, że wpiszemy odpowiednią frazę do wyszukiwarki i… – no właśnie – czy na pewno otrzymamy tę informację, na której nam zależy, i czy jest ona prawdziwa? Konieczna jest weryfikacja, porównanie różnych źródeł, co zawsze zabiera czas, a nie zawsze daje pozytywne rezultaty. Dlatego też za wcześnie jeszcze na ogłaszanie końca książek – drukowanych czy e-booków – jako źródła informacji. Książki są pisane – najczęściej – przez specjalistów, którzy znają temat, a ponadto są poddawane wnikliwej recenzji, więc informacje w nich zawarte są zweryfikowane. Oczywiście z książkami jest niemal tak samo jak z komputerami czy telefonami komórkowymi – z chwilą pojawienia się w sprzedaży stają się przestarzałe…. Na szczęście to „niemal” oznacza, że przynajmniej podstawy danej dziedziny opisane w książce pozostają aktualne.

Swoją przygodę ze spektrometrią mas rozpocząłem w 1989 r., kiedy po powrocie ze stażu podoktorskiego otrzymałem propozycję pracy w Zespole Spektrometrii Mas Instytutu Chemii Organicznej PAN. Do tej pory zajmowałem się syntezą organiczną, ale zawsze interesowały mnie metody spektroskopowe, więc propozycję przyjąłem. Zespołem, który, nawiasem mówiąc, nie miał ani jednego spektrometru mas, kierowała dr Elżbieta Baranowska. Udało się jej przekonać dyrekcję Instytutu co do celowości zakupu spektrometru mas i w 1991 r. został zakupiony klasyczny spektrometr magnetyczny o podwójnym ogniskowaniu mało znanej niemieckiej firmy AMD Intectra GmbH. Ten przyrząd funkcjonował w naszym laboratorium przez 20 lat – rekord godny podziwu. Na nim właśnie, pod kierunkiem dr Baranowskiej, zdobywałem swoje pierwsze doświadczenia w spektrometrii mas. W 1992 r., po przejściu dr Baranowskiej na emeryturę, zostałem kierownikiem zespołu. W miarę upływu lat Zespół Spektrometrii Mas wzbogacał się o kolejne spektrometry wykorzystujące różne metody jonizacji i analizy masy jonów. Pojawiły się także zestawy GC-MS i LC-MS, czyli złożone z chromatografu gazowego lub cieczowego sprzężonego ze spektrometrem mas. Jak okaże się w trakcie lektury tego podręcznika, dobrze wyposażone laboratorium musi dysponować co najmniej kilkoma różnymi typami spektrometrów mas, ponieważ w tej dziedzinie nie ma przyrządów uniwersalnych, które nadawałyby się do badania wszystkich rodzajów próbek. Równocześnie Zespół rozrastał się personalnie i – oprócz pomiarów serwisowych – rozpoczął także badania naukowe w dziedzinie spektrometrii mas, zarówno samodzielnie, jak i we współpracy z innymi jednostkami naukowymi.

W 1995 r. rozpocząłem wykłady ze spektrometrii mas dla doktorantów IChO PAN. Materiały do nich były zamieszczane na stronach internetowych Instytutu i wkrótce – bez mojej wiedzy i zgody – rozpowszechniły się w Sieci. Może dzięki temu zaczęto zapraszać mnie do prowadzenia wykładów ze spektrometrii mas w różnych uczelniach i instytutach naukowych, co robię do tej pory. W 2008 r. zaprzestałem prowadzenia wykładu monograficznego ze spektrometrii mas w IChO PAN, a zamiast niego zacząłem prowadzić wykłady na temat łącznego wykorzystania nowoczesnych metod spektralnych do ustalania budowy związków organicznych. Materiały do tego wykładu są dostępne na stronach internetowych IChO PAN.

W miarę zdobywania wiedzy i doświadczenia w obszarze praktycznej spektrometrii oraz nabywania umiejętności przekazywania tego słuchaczom moich wykładów, postanowiłem wykorzystać opracowane przeze mnie materiały wykładowe i napisać na ich podstawie podręcznik do spektrometrii mas. W 2019 r., w którym rozpocząłem pracę nad książką, na polskim rynku wydawniczym był dostępny jeden nowoczesny podręcznik do spektrometrii mas, napisany przez zespół autorów pod redakcją P. Sudera, A. Bodzoń-Kułakowskiej i J. Silberringa>[1] wydany przez Wydawnictwa AGH w 2016 r. Uznałem, że warto spróbować przedstawić spektrometrię mas w inny sposób, kładąc większy nacisk na praktyczne zagadnienia związane z pomiarami widm masowych różnych próbek oraz interpretację tych widm na podstawie licznych przykładów. Na ile mi się to udało, oceni Czytelnik.

Zdecydowałem się rozpocząć książkę od krótkiego wprowadzenia historycznego, gdyż właśnie minęło 100 lat od pierwszych prac, których wynikiem było uzyskanie czegoś, co można już było nazwać widmem masowym. Treść tego rozdziału nie jest konieczna do zrozumienia materiału zawartego w książce, ale – moim zdaniem – warto wiedzieć, jak rozwijała się spektrometria mas.

Drugi rozdział można traktować jako wprowadzenie do spektrometrii mas. Dla osób, które już coś wiedzą na temat tej dziedziny, będzie to przypomnienie posiadanej wiedzy, natomiast nowicjusze zapoznają się z podstawowymi pojęciami i terminami. Szczególną uwagę warto zwrócić na często niewłaściwie wyjaśniany, pozornie trywialny problem masy cząsteczkowej i tego, jak wpływa ona na postać widma masowego.

Zagadnienia poruszone w trzech kolejnych rozdziałach można znaleźć w każdym podręczniku spektrometrii mas. Dotyczą one metod jonizacji, metod analizy masy jonów oraz detekcji jonów, rejestracji i przetwarzania wyników. W tych rozdziałach starałem się zwrócić uwagę na fizyczne i chemiczne podstawy wykorzystywanych metod oraz zakresy ich zastosowania. Powodzenie pomiaru widma masowego zależy przede wszystkim od wyboru właściwej metody jonizacji, więc powinniśmy wiedzieć, jakie metody są odpowiednie do badania naszych próbek i jak interpretować uzyskane wyniki – nawet wówczas, gdy oddajemy próbki do zbadania specjalistom w laboratorium spektrometrii mas. Z kolei od tego, jakie wyniki są nam potrzebne, zależy wybór analizatora masy. Jeśli chcemy uzyskać dokładny pomiar masy w celu wyznaczenia lub potwierdzenia wzoru sumarycznego badanego związku, musimy zastosować spektrometr o wysokiej zdolności rozdzielczej. Natomiast jeśli badamy makrocząsteczki o bardzo dużych masach, potrzebny nam będzie spektrometr z analizatorem masy, który umożliwi taki pomiar.

W rozdziale 6. opisałem podstawy pomiarów, w których spektrometr mas jest połączony bezpośrednio z chromatografem gazowym lub cieczowym. Starałem się w szczególności pokazać, że spektrometr mas to nie tylko kolejny typ detektora, który można podłączyć do chromatografu, ale przede wszystkim narzędzie do bardzo zaawansowanej analizy jakościowej (oczywiście ilościowej też!) złożonych mieszanin pochodzenia zarówno naturalnego, jak i syntetycznego.

Rozdział 7. należy do najważniejszych w tej książce. Opisałem w nim podstawy wykonywania pomiarów widm masowych oraz interpretacji uzyskanych wyników. Jest to wiedza niezbędna zarówno analitykom obsługującym bezpośrednio spektrometry mas, jak i klientom laboratoriów MS. Do prawidłowego zinterpretowania uzyskanych wyników jest potrzebna wiedza na temat sposobu wykonania pomiaru. Dlatego też informacje zawarte w tym rozdziale uważam za niezwykle istotne.

Jeśli na podstawie pomiarów MS chcemy dowiedzieć się czegoś o budowie cząsteczek badanych związków, musimy poznać podstawy zjawiska fragmentacji jonów. Są one opisane w rozdziale 8. Rozdział o takiej treści coraz rzadziej pojawia się w podręcznikach do spektrometrii mas, co nie oznacza, że jest to wiedza bezużyteczna. W Laboratorium Spektrometrii Mas Instytutu Chemii Organicznej PAN od wielu lat wykorzystujemy spektrometrię mas sprzężoną z chromatografią gazową i cieczową do wykrywania i identyfikacji zanieczyszczeń w lekach, półproduktach do ich syntezy, a także w wielu innych produktach czynnych biologicznie. Ze względu na śladowe ilości tych zanieczyszczeń, jedyną metodą badania ich struktury jest analiza fragmentacji. Wiedza na temat jej mechanizmów jest tu niezbędna. Oczywiście osoby, które wykorzystują spektrometrię mas tylko do potwierdzenia masy cząsteczkowej badanego związku lub do oznaczeń ilościowych znanych związków, niewiele z tego rozdziału skorzystają, ale przecież nigdy nie wiadomo, z jakimi problemami analitycznymi mogą zetknąć się w przyszłości….

Ostatnim z kluczowych rozdziałów tej książki jest rozdział 9., w którym zostały przedstawione wybrane zastosowania spektrometrii mas do analizy związków naturalnych. Jest to obecnie niezwykle obszerna dziedzina wiedzy, dlatego też z konieczności musiałem dokonać pewnego wyboru. Ponieważ na polskim rynku księgarskim jest dostępna książka pt. „Proteomika i metabolomika” pod redakcją A. Kraj, A. Drabik i J. Silberringa, więc postanowiłem potraktować skrótowo zastosowania techniki MS w analizie białek i metabolomice, a skoncentrować się na analizie trzech klas związków naturalnych: lipidów, cukrów oraz nukleotydów i nukleozydów. Szczególną uwagę zwracam na warunki pomiaru najlepsze dla każdej z tych klas związków oraz na to, w jaki sposób na podstawie widm fragmentacyjnych wnioskować jak najwięcej o ich strukturze.

Rozdziały od 10. do 13. dotyczą zagadnień spektrometrii mas, z którymi przeciętny chemik – analityk lub syntetyk – spotyka się znacznie rzadziej, co nie oznacza oczywiście, że są one nieistotne. Tę część książki rozpoczynam od przedstawienia metod wykorzystania spektrometrii mas do badania przebiegu reakcji chemicznych zarówno w roztworze, jak i w fazie gazowej. Może to zainteresować chemików–organików zajmujących się syntezą i odkrywaniem nowych reakcji. W rozdziale 11. z kolei jest mowa o bardzo ciekawej metodzie badawczej – połączeniu spektrometrii ruchliwości jonów ze spektrometrią mas. W tej metodzie rozdziela się jony nie tylko ze względu na ich stosunek masy do ładunku, ale także ze względu na kształt! Metoda IM-MS rozwija się obecnie bardzo szybko i na pewno w ciągu kliku lat znajdzie liczne zastosowania w laboratoriach analitycznych.

Dwa ostatnie rozdziały są ukłonem z stronę badaczy zajmujących się analizą powierzchni – zarówno pod kątem obecności związków organicznych, jak i nieorganicznych – oraz analizą śladową metali ciężkich i innych pierwiastków w produktach, które mają trafić na rynek. Oba rozdziały są potraktowane skrótowo i mają na celu jedynie zasygnalizowanie istnienia takich technik wykorzystujących spektrometrię mas.

Książkę zamykają aneksy, w których znalazły się tablice mas atomowych i składów izotopowych pierwiastków oraz przykładowe widma związków lub mieszanin związków używanych do kalibracji spektrometrów mas, a także wykaz dostępnej literatury w dziedzinie spektrometrii mas i wybranych źródeł danych oraz programów dostępnych w Internecie.

Mam nadzieję, że ta książka przyczyni się do lepszego wykorzystania w pracy możliwości stwarzanych przez spektrometrię mas i – bardzo bym tego pragnął – zainspiruje Czytelników do własnych prac badawczych w tej dziedzinie.

Witold Danikiewicz

PODZIĘKOWANIA

Powstanie tej książki stało się możliwe dzięki pracy wykonanej przez liczne grono osób związanych zarówno z Zespołem Spektrometrii Mas Instytutu Chemii Organicznej PAN w Warszawie, jak i z innych jednostek. Przez blisko 30 lat przez Zespół Spektrometrii Mas przewinęło się wielu pracowników i doktorantów, którzy wykonywali pomiary widm masowych, zarówno do celów usługowych, jak i w ramach prac badawczych. Wiele z tych widm zachowałem i wykorzystałem najpierw w swoich wykładach, a następnie w tej książce. Wszystkich pracowników i doktorantów wymienić nie sposób, ale wszystkim gorąco dziękuję. W książce wykorzystałem także wyniki pomiarów wykonanych w innych instytucjach. Dziękuję tu dr Ewelinie Wielgus z Centrum Badań Molekularnych i Makromolekularnych PAN w Łodzi oraz dr. Alexandrowi Moysie z Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie. Profesorowi Zbigniewowi Postawie z Uniwersytetu Jagiellońskiego dziękuję za zgodę na wykorzystanie wyników modelowania bombardowania powierzchni jonami galu i fulerenu, a dr hab. Katarzynie Pawlak, prof. Politechniki Warszawskiej, za udostępnienie materiałów, dzięki którym powstał rozdział 13., a także za korektę tego rozdziału.

Oddzielne podziękowania należą się pracownikom firm sprzedających na polskim rynku spektrometry mas i zapewniającym serwis oraz wsparcie dla klientów: Anchem, Bruker Polska, Perlan Technologies, Shimpol, Spektrometria i Waters Polska. Materiały tych firm bardzo wzbogaciły zawartość książki. Pragnę też podziękować Mass Spectrometry Data Center z National Institute od Standards and Technology (NIST, USA) za wyrażenie zgody na wykorzystanie w książce widm masowych z biblioteki widm tej firmy. No i na koniec podziękowania należą się rzeszy twórców stron internetowych, dzięki którym było możliwe zdobycie znacznej części materiału ilustracyjnego wykorzystanego w tej książce.

1
JAK ROZWIJAŁA SIĘ SPEKTROMETRIA MAS?

Spektrometria mas jako dziedzina badań naukowych i równocześnie metoda analityczna liczy sobie nieco ponad 100 lat. Jak w przypadku każdej innej dziedziny wiedzy, nie da się jednoznacznie podać daty jej powstania. Był to rozciągnięty w czasie proces, w którym uczestniczyło wielu wybitnych uczonych. W początkowym okresie rozwoju była ona domeną fizyków i właśnie fizykami byli ci, których można uważać za ojców spektrometrii mas. Niewątpliwie pierwszym z nich był John Joseph Thomson (1856–1940), angielski fizyk – laureat Nagrody Nobla z fizyki w 1906 r., którą otrzymał, jak napisano w uzasadnieniu: „w uznaniu jego wielkich zasług w badaniach teoretycznych i eksperymentalnych dotyczących przewodzenia elektryczności przez gazy”. Do tych zasług należy niewątpliwie zaliczyć badania tzw. promieni katodowych i stwierdzenie, że są one cząstkami naładowanymi ujemnie o masie ponad 1000 razy mniejszej od masy atomu wodoru. Cząstki te to oczywiście elektrony (chociaż tę nazwę zaproponował kto inny), Thomson jest więc uznawany za odkrywcę elektronu. Jako pierwszy wyznaczył on także stosunek masy do ładunku elektronu.

Sir John Joseph Thomson (1856–1940)

Dla rozwoju spektrometrii mas dużo ważniejsze były jednak prace Thomsona dotyczące tzw. promieniowania anodowego, zwanego też promieniowaniem kanalikowym. Powstawało ono podczas wyładowania elektrycznego w gazie pod niskim ciśnieniem. Obecnie wiemy, że były to kationy cząsteczek lub atomów tego gazu, ale w tamtym czasie nie znano ich istoty. Thomson razem z Francisem Williamem Astonem (1877–1945), który w 1910 r. dołączył do jego zespołu, badali odchylanie promieniowania anodowego podczas przechodzenia przez równoległe pola magnetyczne i elektryczne w przyrządzie nazwanym spektrografem parabolicznym (rys. 1.1a).

Rys. 1.1. Schemat spektrografu parabolicznego Thomsona (a), widmo masowe z 1913 r., na którym po raz pierwszy zarejestrowano izotopy ²⁰Ne i ²²Ne (b)

Źródło: a) Braz. J. Phys. 1999, 29, 401 (licencja CC 4.0); https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-97331999000300002&lng=es&nrm=iso&tlng=en; b) https://digital.sciencehistory.org/works/79407z32j/viewer/zs25x960d.

W tym urządzeniu jony poruszały się po torach, których kształt zależał od stosunku ich masy do ładunku, i na kliszy fotograficznej zostawiały charakterystyczne ślady paraboliczne. W 1912 r. Thomson i Aston podczas badania neonu stwierdzili, że daje on dwie linie na fotografii (rys. 1.1b) – w ten sposób zostały po raz pierwszy odkryte izotopy pierwiastka niepromieniotwórczego (istnienie izotopów pierwiastków promieniotwórczych przewidział dwa lata wcześniej Frederick Soddy).

Po kilkuletniej przerwie spowodowanej I wojną światową, Aston kontynuował już samodzielnie rozpoczęte wcześniej badania izotopów. W tym celu skonstruował kolejne modele spektrografów mas, za pomocą których stwierdził istnienie 212 trwałych izotopów znanych pierwiastków. W 1922 r. otrzymał Nagrodę Nobla z chemii „za odkrycie, za pomocą spektrografu masowego, izotopów w dużej liczbie pierwiastków nieradioaktywnych oraz za zaproponowanie reguły liczb całkowitych”. Ta reguła głosiła, że masy atomowe izotopów pierwiastków są całkowitymi wielokrotnościami masy atomu wodoru. Obecnie wiemy, że ta reguła jest poprawna tylko w przybliżeniu, tj. dla mas zaokrąglonych do liczb całkowitych, ale w tamtym okresie była ważnym krokiem na drodze do poznania budowy atomu.

Francis William Aston (1877–1945)

W tym samym czasie za oceanem pionierskie prace w dziedzinie spektrometrii mas prowadził Arthur Jeffrey Dempster (1886–1950). Jego spektrometr mas jako pierwszy w pełni zasługiwał na tę nazwę (rys. 1.2).

Rys. 1.2. Schemat spektrometru mas A.J. Dempstera z 1921 r. i widmo masowe magnezu zarejestrowane za pomocą tego spektrometru

Źródło: http://www.nvms.nl/wp-content/uploads/2013/11/HistorischoverzichtNoeverdeBrauw.pdf; widmo oryginalnie z: Phys. Rev. 1921, 18, 415.

Jony były wytwarzane w wyniku ogrzewania próbki wspomaganego bombardowaniem elektronami, prawie tak, jak we współczesnych źródłach jonów EI. Rozdział jonów ze względu na stosunek masy do ładunku odbywał się w polu magnetycznym wytwarzanym przez elektromagnes – to rozwiązanie jest nadal stosowane. Jony były rejestrowane w tzw. kubku Faradaya, a zebrany ładunek elektryczny był mierzony za pomocą elektrometru listkowego. Dzięki temu można było uzyskać wyniki ilościowe takie jak na rysunku 1.2. W 1935 r. Dempster odkrył izotop uranu ²³⁵U – brzemienne w skutkach odkrycie, które doprowadziło 10 lat później do skonstruowania bomby atomowej.

Identyfikacja trwałych izotopów wszystkich znanych pierwiastków, dokładny pomiar ich masy oraz wyznaczanie ich proporcji zakończyło w połowie lat 30. XX wieku pierwszy – „fizyczny” – etap rozwoju spektrometrii mas. W literaturze naukowej można znaleźć informację, że wkrótce potem Aston podczas jednego z wykładów stwierdził, że spektrometria mas spełniła swoją rolę i zaniknie jako obszar badań. Tak to bywa, gdy uczony bawi się w proroka… Pod koniec lat 30. i w latach 40. XX wieku rozpoczął się gwałtowny rozwój spektrometrii mas jako metody analitycznej. Równocześnie rozwijała się technika próżniowa, która jest nieodłącznie związana ze spektrometrią mas. Warto poświęcić jej parę słów.

Aby jony podczas przelotu przez spektrometr nie zderzały się z cząsteczkami gazu, musi w nim panować odpowiednio niskie ciśnienie, przynajmniej rzędu 10–4–10–5 mbar (więcej na ten temat – patrz rozdz. 2.1). Pionierzy spektrometrii mas – Thomson i Aston korzystali z napędzanej ręcznie tzw. pompy rtęciowej Gaedego. Uzyskanie odpowiedniej próżni było uciążliwe i czasochłonne. W 1913 r. Wolfgang Gaede skonstruował rtęciową pompę dyfuzyjną, którą w następnych latach udoskonalili inni badacze, przede wszystkim zastępując rtęć wysokowrzącymi olejami. Był to przełom w technice próżniowej, ponieważ dzięki tej pompie stało się możliwe uzyskiwanie próżni rzędu nawet 10⁷–10–8 mbar i to w dużych przestrzeniach. Pompy dyfuzyjne ciągle jeszcze można spotkać w spektrometrach mas i innej aparaturze naukowej, chociaż od lat 70. XX wieku zaczęły rozpowszechniać się pompy turbomolekularne, które obecnie są stosowane w niemal wszystkich dostępnych na rynku spektrometrach mas. Zarówno pompy dyfuzyjne, jak i turbomolekularne wymagają zastosowania pomp próżni wstępnej. Są to najczęściej rotacyjne pompy olejowe, a ostatnio coraz częściej bezolejowe, pozwalające na uzyskanie ciśnienia rzędu 10–2 mbar.

Projekt Manhattan

Zanim spektrometry mas stały się szeroko stosowaną aparaturą naukową i analityczną w różnych gałęziach przemysłu, w historii ich rozwoju miał miejsce ciekawy, ale mało znany epizod. W 1938 r. niemieccy fizycy Otto Hahn i Fritz Strassman okryli zjawisko rozszczepienia jądra uranu. Dalsze badania, prowadzone zarówno w Niemczech, jak i Stanach Zjednoczonych, wykazały, że powinno być możliwe skonstruowanie bomby atomowej – broni, która mogłaby rozstrzygnąć wynik toczącej się właśnie II wojny światowej. Głównym problemem na drodze do skonstruowania bomby atomowej była konieczność uzyskania kilkudziesięciu kilogramów izotopu uranu-235, bo tylko jego jądra ulegają rozszczepieniu. Tymczasem jego zawartość w naturalnym uranie wynosi zaledwie 0,72%. Na początku 1942 r. Ernest Lawrence, wynalazca cyklotronu, wykazał, że urządzenie będące zmodyfikowanym cyklotronem, a tak naprawdę bardzo dużym spektrometrem mas, może posłużyć do preparatywnego rozdzielania izotopów uranu 235 i 238. Schemat tego urządzenia, nazwanego kalutronem (Calutron od California University Cyclotron) pokazano na rysunku 1.3.

W źródle jonów były wytwarzane jony U⁺ w wyniku bombardowania elektronami par tetrachlorku uranu. Jony ²³⁵U⁺ i ²³⁸U⁺ były rozdzielane w polu magnetycznym i trafiały do dwóch kolektorów, gdzie ulegały rozładowaniu na powierzchni grafitu. Po przepuszczeniu przez kalutron odpowiedniej ilości UCl₄, urządzenie otwierano i ręcznie wydobywano zebrany uran-235. Ze względu na ograniczoną rozdzielczość kalutronu, rozdziału izotopów uranu dokonywano w dwóch etapach. W pierwszym uzyskiwano produkt wzbogacony do ok. kilkunastu procent ²³⁵U, a w drugim – do 88% ²³⁵U, co było już czystością wystarczającą do wyprodukowania bomby atomowej – głównego celu powołanego do tego Projektu Manhattan.

Aby uzyskać wystarczającą ilość uranu-235, w latach 1942–1944 zbudowano ponad tysiąc kalutronów zgrupowanych w zestawy po 96 sztuk (fotografia na rys. 1.3). W połowie 1945 r. uzyskano wystarczającą ilość materiału rozszczepialnego (rozdział w kalutronach nie był jedynym stosowanym sposobem wydzielania izotopu ²³⁵U), aby można było skonstruować bombę atomową. W lipcu odbył się pierwszy test tej nowej broni, a 6 sierpnia 1945 r. pierwsza bomba atomowa spadła na Hiroszimę.

Rys. 1.3. Schemat kalutronu i fotografia zestawu 96 kalutronów zbudowanego w ramach Projektu Manhattan

Źródło: schemat: źródło oryginalne: archiwa Oak Ridge National Laboratory; źródło kopii rysunku: J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1997, 8, 943 https://www.nvms.nl/wp-content/uploads/2013/11/HistorischoverzichtNoeverdeBrauw.pdf zdjęcie: James Edward Westcott – http://historyinphotos.blogspot.com.au/2013/10/james-edward-westcott.html (domena publiczna).

Jak to się często zdarza, technologia opracowana do celów militarnych znalazła następnie zastosowania cywilne. Część kalutronów działała także po wojnie i działa do tej pory. Służą one do preparatywnego rozdzielania izotopów do celów naukowych i medycznych. W ciągu 50 lat od zakończenia wojny dokonano w nich rozdzielenia ponad 50 pierwiastków, uzyskując ok. 250 czystych izotopów, niektóre w ilościach kilogramowych.

Rozwój analizatorów masy jonów

Spektrometry mas skonstruowane przez Astona i Dempstera nadawały się dobrze do głównego celu, do którego zostały skonstruowane, czyli do identyfikacji i pomiaru masy i względnych zawartości izotopów pierwiastków chemicznych. Jednak już pod koniec lat 30. XX wieku zaczęto sobie zdawać sprawę z tego, że spektrometry mas mogą być wykorzystane także do innych celów, przede wszystkim do badania związków chemicznych, w tym – związków organicznych.

Niewątpliwie milowym krokiem na drodze do upowszechnienia spektrometrii mas jako metody analitycznej było wprowadzenie na rynek pod koniec 1942 r. pierwszego komercyjnego spektrometru mas przez amerykańską firmę Consolidated Electrical Engineering (CEC).

Rys. 1.4. Pierwszy komercyjny spektrometr mas: CEC Model 21-101 firmy Consolidated Electrical Engineering (USA)

Źródło: Wikimedia Commons, Science History Institute (licencja CC BY-SA 3.0).

Podstawą do zbudowania tego spektrometru były urządzenia skonstruowane przez Dempstera (rys. 1.2). Warto wiedzieć, że głównym motorem napędzającym rozwój spektrometrii mas w latach 40. i 50. XX wieku było zapotrzebowanie na szybkie analizy paliw dla burzliwie rozwijającego się przemysłu petrochemicznego.

Oprócz wspomnianego spektrometru firmy CEC, na rynku pojawiły się w tamtym czasie także spektrometry mas innych firm. Ich główną wadą było jednak stosunkowo powolne skanowanie – ze względu na zjawisko histerezy magnetycznej analizatory wykorzystujące elektromagnesy nie nadawały się do szybkiego skanowania, a wykorzystanie w tym celu zmian napięcia przyspieszającego jony ograniczało się do bardzo wąskich zakresów mas. Dlatego też już w latach 40. pojawiły się pierwsze konstrukcje spektrometrów wykorzystujących analizator czasu przelotu (TOF), a w latach 50. firma Bendix Corporation (USA) rozpoczęła produkcję szeregu modeli spektrometrów wyposażonych w ten analizator. Takie spektrometry mogły w ciągu sekundy zarejestrować nawet 10 000 widm, ale ze względu na brak odpowiednio szybkich rejestratorów można je było oglądać tylko na ekranie oscyloskopu, a uzyskanie trwałej kopii wymagało zrobienia zdjęcia ekranu. Po wprowadzeniu do użytku analizatora kwadrupolowego w latach 60. analizatory TOF praktycznie zniknęły z rynku, by tryumfalnie powrócić w latach 90. Jest o tym mowa dalej.

Rys. 1.5. Spektrometr mas z analizatorem czasu przelotu MA-2 firmy Bendix Corporation (USA)

Źródło: https://digital.sciencehistory.org/works/c821gk120 (domena publiczna).

Innym bodźcem do konstruowania coraz lepszych i szybszych spektrometrów mas stało się wynalezienie w 1954 r. pierwszego chromatografu gazowego. Już w następnym roku Roland S. Gohlke i Fred W. McLafferty zbudowali pierwszy zestaw GC-MS, czyli połączenie spektrometru mas (z analizatorem TOF) z chromatografem gazowym. Technika GC-MS szybko zdobywała sobie coraz to nowe obszary zastosowań, ale prawdziwy przełom w jej spopularyzowaniu nastąpił dzięki skonstruowaniu po koniec lat 50. przez zespół profesora Wolfganga Paula analizatora kwadrupolowego. Ten prosty i tani typ analizatora masy okazał się idealny do współpracy z chromatografem gazowym, dzięki czemu w latach 60. pojawiło się na rynku wiele konstrukcji zestawów GC-MS różnych firm. Do dnia dzisiejszego zestawy GC-MS, w których spektrometr mas jest wyposażony w analizator kwadrupolowy, są najpopularniejszymi urządzeniami tego typu.

Równolegle z rozwojem zastosowań analitycznych spektrometrii mas, przede wszystkim w przemyśle naftowym i chemicznym, rozwijały się badania naukowe związane z tą techniką. Prace zespołów Alfreda Niera i Josepha Mattaucha doprowadziły do skonstruowania spektrometrów mas o wysokiej zdolności rozdzielczej. Największą popularność zyskały spektrometry o tzw. geometrii Niera-Johnsona, w których wykorzystano analizator elektryczny i magnetyczny. Dzięki komorze zderzeń umieszczonej pomiędzy źródłem jonów a sektorem elektrycznym (patrz rozdz. 4.2) stało się możliwe badanie ścieżek fragmentacji jonów. Szybko okazało się, że jeszcze większe możliwości daje tzw. odwrotna geometria Niera-Johnsona, w której elektromagnes jest umieszczony przed sektorem elektrycznym. W tej konfiguracji można było umieścić komorę zderzeń także między magnesem a sektorem elektrycznym, uzyskując w ten sposób dodatkowy, bardzo skuteczny tryb pomiaru jonów fragmentacyjnych określany akronimem MIKES (Mass-analyzed Ion-Kinetic-Energy Spectrometry). Spektrometry tego typu swego czasu zdominowały rynek spektrometrów mas stosowanych do celów naukowych. Ich najbardziej zaawansowanym technicznie przedstawicielem był spektrometr ZAB-2F i jego różne modyfikacje (rys. 1.6).

Rys. 1.6. Spektrometr mas typu ZAB-2F firmy VG

Źródło: http://www.rzuser.uni-heidelberg.de/~bl5/facility/zab_hist1.html.

Spektrometry magnetyczne o podwójnym ogniskowaniu były wykorzystywane przez wiele lat nie tylko do badań jonów w fazie gazowej, ale też do celów analitycznych. W połączeniu z chromatografem gazowym służyły do oznaczania na poziomie ppb (części na miliard) dioksyn i polichlorowanych bifenyli. Do tych analiz potrzebny był spektrometr o wysokiej zdolności rozdzielczej i możliwości śledzenia wybranych jonów w tym trybie. Dopiero niedawno opracowano inne metody oznaczania dioksyn, które nie wymagały już wysokiej zdolności rozdzielczej, co spowodowało praktycznie zniknięcie z rynku spektrometrów magnetycznych o podwójnym ogniskowaniu. Na początku 2020 r. już tylko jedna firma na świecie oferowała ten typ spektrometru.

Spektrometry magnetyczne o podwójnym ogniskowaniu dobrze nadawały się do badań fragmentacji jonów, ale były duże i kosztowne. W 1978 r. został skonstruowany pierwszy spektrometr mas, w którym połączono szeregowo trzy analizatory kwadrupolowe: pierwszy i trzeci były analizatorami masy, natomiast drugi służył jako komora zderzeń do wywoływania fragmentacji jonów (patrz rozdz. 4.8). Przyrząd ten, nazwany potrójnym kwadrupolem, jest obecnie jednym z najczęściej spotykanych spektrometrów mas w laboratoriach analitycznych. W latach 90. pojawiła się na rynku jego modyfikacja, w której zastąpiono trzeci kwadrupol analizatorem czasu przelotu o wysokiej zdolności rozdzielczej. Uzyskano w ten sposób spektrometr łączący w sobie możliwości badania fragmentacji jonów i dokładnego pomiaru ich masy. Tego typu spektrometry nazywane Q-TOF są obecnie również bardzo szeroko rozpowszechnione i ciągle powstają ich nowe konstrukcje.

Zwróćmy uwagę, że częścią spektrometru Q-TOF jest analizator czasu przelotu o wysokiej zdolności rozdzielczej. Jak było napisane wyżej, analizatory TOF przez dość krótki czas w latach 50. były szeroko stosowane, ale nierozwiązanym problemem była rejestracja widm. Przełom w tej dziedzinie nastąpił na początku lat 90. XX wieku. Złożyły się na to dwa czynniki: szybki rozwój elektroniki i zakończenie „zimnej wojny”. Dzięki odprężeniu w stosunkach międzynarodowych „do cywila” trafiły urządzenia stosowane uprzednio tylko do celów militarnych, w tym bardzo szybkie przetworniki analogowo-cyfrowe, pracujące z częstościami powyżej 1 GHz. Równocześnie komputery osiągnęły wydajność pozwalającą na przetwarzanie i rejestrowanie ogromnego strumienia danych dostarczanych przez te przetworniki. Możliwość rejestracji widm uzyskiwanych za pomocą analizatora TOF spowodowała szybki rozwój tego urządzenia, dzięki czemu powstały konstrukcje typu V i W (patrz rozdz. 4.4) o wysokiej zdolności rozdzielczej. W rezultacie w latach 90. pojawiły się spektrometry mas wyposażone w wysokorozdzielczy analizator TOF – samodzielny lub połączony z analizatorem kwadrupolowym.

We wszystkich opisanych wyżej analizatorach masy rozdział jonów ze względu na stosunek ich masy do ładunku odbywał się podczas przelotu wiązki jonów przez analizator. Nie jest to jednak jedyna metoda analizy masy jonów. Już w drugiej połowie lat 50. XX wieku Wolfgang Paul, twórca analizatora kwadrupolowego, skonstruował urządzenie nazwane kwadrupolową pułapką jonową. W pułapce jonowej jony poruszają się w ograniczonej przestrzeni i przez dobór parametrów pracy pułapki, czyli wartości i częstości napięcia elektrycznego doprowadzonego do jej elektrod, można je w selektywny sposób wypuszczać z pułapki i rejestrować (patrz rozdz. 4.5). Za osiągnięcia w dziedzinie konstruowania pułapek jonowych Wolfgang Paul otrzymał w 1989 r. Nagrodę Nobla.

Wolfgang Paul (1913–1993)

Źródło: https://www.mediatheque.lindau-nobel.org/laureates/paul.

Jeszcze inne podejście do analizy masy jonów zaproponowali w 1974 r. Melvin B. Comisarow i Alan G. Marshall. Wykorzystali oni znane od co najmniej 20 lat zjawisko jonowego rezonansu cyklotronowego (ICR) i skonstruowali spektrometr mas, w którym jony poruszały się po kołowych trajektoriach w komorze ICR, a pomiar stosunku ich masy do ładunku odbywał się za pomocą rejestracji napięć zmiennych generowanych przez ruch jonów, przetwarzanych następnie z wykorzystaniem transformacji Fouriera na widmo masowe (patrz rozdz. 4.6). Spektrometry FT-ICR są produkowane do tej pory, ale przez tylko jedną firmę na świecie. Przez pewien czas były wykorzystywane do badania reakcji jonów w fazie gazowej, a także do badania struktury białek. To ostatnie zastosowanie wynikało z bardzo wysokiej zdolności rozdzielczej tych przyrządów. Niestety, spektrometry FT-ICR są bardzo drogie i równocześnie koszty ich utrzymania są wysokie ze względu na konieczność stosowania ciekłego helu w elektromagnesie nadprzewodzącym.

Kres popularności spektrometrów FT-ICR przyniósł w 1999 r. nowy wynalazek rosyjskiego fizyka Aleksandra Makarowa. Opracował on matematyczne podstawy konstrukcji zupełnie nowego typu analizatora masy, który skomercjalizowała w 2005 r. firma Thermo Scientific pod nazwą handlową „Orbitrap”. W tym urządzaniu jony poruszają się w zamkniętej komorze o skomplikowanym kształcie, a rejestracja sygnału odbywa się na tej samej zasadzie, co w spektrometrze FT-ICR (patrz rozdz. 4.7). Spektrometry wyposażone w analizator Orbitrap charakteryzują się bardzo wysoką zdolnością rozdzielczą, porównywalną z osiąganą przez FT-ICR, a dzięki dużo prostszej konstrukcji i braku magnesu nadprzewodzącego są dużo tańsze, także w eksploatacji.

Na zakończenie tej części historii spektrometrii mas warto jeszcze wspomnieć o technice IM-MS, czyli połączeniu spektrometrii ruchliwości jonów ze spektrometrią mas. Różne próby połączenia tych dwóch metod separacji jonów były prowadzone od lat 70. XX wieku, ale dopiero w 2006 r. firma Waters wypuściła na rynek pierwszy komercyjny spektrometr tego typu. Spektrometria ruchliwości jonów opiera się na ich rozdziale ze względu nie tylko na ich masę, ale także kształt, dzięki czemu świetnie uzupełnia możliwości spektrometrii mas, ponieważ umożliwia rozdzielanie jonów izomerycznych. Obecnie już kilka firm ma swojej ofercie spektrometry IM-MS. Jest o tym mowa w rozdz. 11.

Rozwój metod jonizacji

Wprowadzona przez Dempstera w 1918 r. jonizacja elektronowa (EI) była przez wiele lat jedyną praktyczną metodą jonizacji związków organicznych. Konstrukcje źródeł jonów EI były oczywiście rozwijane i modyfikowane, ale zasada pozostała ta sama: jonizacja następowała w wyniku bombardowania gazowej próbki wiązką elektronów. Jednak tą metodą nie można zarejestrować jonu molekularnego, czyli wyznaczyć masy, bardzo wielu związków organicznych. Dopiero w 1966 r. Munson i Field zaprezentowali metodę nazwaną jonizacją chemiczną (CI). Dzięki niej stało się możliwe uzyskiwanie jonów molekularnych (ściślej: pseudomolekularnych – patrz rozdz. 3.2) związków, których nie dało się zaobserwować w jonizacji elektronowej. W dalszym ciągu jednak próbkę przed jonizacją należało odparować, co oczywiście uniemożliwiało wykonanie analizy próbek nielotnych, w tym większości biomolekuł. Pewnym postępem było wprowadzenie w 1973 r. przez Baldwina i McLafferty’ego metody nazwanej bezpośrednią jonizacją chemiczną (DCI), dzięki której można było jonizować próbki stałe. Zakres stosowalności tej metody był jednak niewielki.

Rozwijająca się intensywnie biochemia potrzebowała lepszych metod jonizacji, dzięki którym można byłoby badać peptydy, białka, cukry, kwasy nukleinowe i wiele innych ważnych grup związków. Pierwszą metodą jonizacji, która okazała się skuteczna w badaniu biomolekuł, była desorpcja plazmą wprowadzona przez Macfarlane’a i Torgersona w 1976 r. Czynnikiem jonizującym była tu wiązka produktów rozpadu promieniotwórczego izotopu kalifornu-252 (²⁵²Cf), którą bombardowano stałą próbkę. Ta metoda nie znalazła jednak szerszego zastosowania ze względu na trudności techniczne i niezbyt wysoką skuteczność. W 1980 r. Michel Barber zaproponował nowy sposób jonizacji nielotnych próbek, który został nazwany bombardowaniem szybkimi atomami (FAB). W tej metodzie roztwór próbki w nielotnej cieczy, zwanej matrycą, był bombardowany wiązką atomów ksenonu (patrz rozdz. 3.7.1). W ten sposób można było zjonizować związki o masach rzędu kilku tysięcy daltonów. Szybko okazało się, że łatwiej jest bombardować roztwór próbki przyspieszonymi jonami np. cezu. Ta metoda została nazwana spektrometrią jonów wtórnych z użyciem ciekłej matrycy (LSIMS – patrz rozdz. 3.7.1). Warto wspomnieć, że jonizację w wyniku bombardowania stałych próbek związków nieorganicznych jonami (SIMS) badano już w latach 30. Po rozmaitych modyfikacjach technika SIMS jest stosowana do tej pory w badaniach przede wszystkim próbek nieorganicznych. Do badania związków organicznych lepsze okazało się zastosowanie ciekłej matrycy. Techniki FAB i LSIMS były stosowane aż do lat 90. XX wieku, kiedy zostały wyparte przez elektrosprej i metody pokrewne.

Inną metodą jonizacji, która do czasu wprowadzenia do użytku elektrospreju cieszyła się pewną popularnością, był termosprej (termorozpylanie) wprowadzony w połowie lat 80. W tej metodzie do źródła jonów wprowadzano roztwór próbki ogrzany do wysokiej temperatury. Z utworzonej mieszaniny drobnych kropelek i par rozpuszczalnika oraz próbki uwalniały się jony powstające najczęściej w wyniku przyłączenia kationu amonowego (sól amonowa musiała być składnikiem roztworu próbki). W innych wariantach tej metody wytwarzano jony za pomocą wiązki elektronów lub w wyniku wyładowania elektrycznego. Była to pierwsza w miarę skuteczna metoda jonizacji umożliwiająca współpracę spektrometru mas z chromatografem cieczowym, ale nadawała się tylko do analizy związków o niezbyt dużych masach cząsteczkowych i dość szybko przeszła do historii.

Druga połowa lat 80. XX wieku przyniosła naukowcom i analitykom wykorzystującym spektrometrię mas dwie metody jonizacji, które obecnie – oprócz najstarszej, ale ciągle popularnej metody jonizacji elektronowej – są stosowane najczęściej. Mowa tu o elektrospreju (ESI) i desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI). Badania elektrospreju jako zjawiska fizycznego były prowadzone już w latach 60., ale dopiero badania zespołu Johna Fenna w połowie lat 80. uczyniły z niego niezwykle wszechstronną i skuteczną metodę jonizacji nawet bardzo dużych, polarnych związków organicznych. ESI współpracowało też znakomicie z chromatografem cieczowym. W kolejnych latach powstawały coraz to doskonalsze konstrukcje źródeł ESI i proces ten trwa do dziś. Więcej informacji na ten znajduje się w rozdz. 3.3.

Rys. 1.7. Spektrometr mas z analizatorem kwadrupolowym i źródłem jonów ESI skonstruowanym przez zespół J. Fenna

Źródło: Wikimedia Commons, Jeff Dahl (licencja CC BY-SA 3.0).

Technika jonizacji MALDI okazała się z kolei doskonałą metodą jonizacji cząsteczek o masach sięgających 1·10⁶ Da. Próby zastosowania lasera jako źródła energii w procesie jonizacji w spektrometrii mas były czynione już wcześniej, ale dopiero w połowie lat 80. Franz Hillenkamp i Michael Karas zaobserwowali, że zmieszanie stałej próbki z substancją absorbującą promieniowanie lasera – którą nazwano matrycą – bardzo poprawia wydajność jonizacji. W tym samym czasie Koichi Tanaka pracujący w firmie Shimadzu – japońskim producencie aparatury naukowej – wykazał, że wykorzystanie jako matrycy ciekłej gliceryny z nanocząstkami metalicznego kobaltu umożliwia zarejestrowanie widma białka o masie ok. 34 tys. Da. Za to osiągnięcie otrzymał on w 2002 r. Nagrodę Nobla z chemii razem z Johnem Fennem, którego uhonorowano za wykorzystanie elektrospreju do rejestracji widm makrocząsteczek. Można tu mówić o pewnej niesprawiedliwości historii, ponieważ metodyka zastosowana przez Tanakę nigdy nie weszła do użytku, natomiast stałe matryce zaproponowane przez Hillenkampa i Karasa są obecnie powszechnie stosowane. Techniki jonizacji z wykorzystaniem lasera są ciągle rozwijane i modyfikowane. Więcej informacji na ten temat znajduje się w rozdziale 3.6.1.

Jonizacja elektrosprej, mimo licznych zalet, nie nadawała się jednak do analizy związków o niskiej polarności. Dlatego też w latach 90. rozpowszechniły się dwie metody komplementarne w stosunku do ESI: jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) i fotojonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym (APPI). Są one opisane w rozdz. 3.4 i 3.5.

Początek XXI wieku przyniósł rozwój metod desorpcyjnych. Do znanej i szeroko stosowanej techniki MALDI doszły takie metody jak DART (Direct Analysis in Real Time) czy DESI (Desorption Electrospray). Ich wspólną cechą jest możliwość jonizacji związków znajdujących na powierzchni ciała stałego pod ciśnieniem atmosferycznym w sposób nieniszczący. Te i inne stosowane obecnie metody jonizacji są szczegółowo opisane w rozdz. 3.

Rejestracja widm masowych i ich przetwarzanie

W obecnych czasach, kiedy powszechnie dostępne są wydajne komputery, trudno jest zrozumieć problemy, z którymi borykali się twórcy podstaw spektrometrii mas. Pierwsze widma masowe były rejestrowane bezpośrednio na kliszach fotograficznych (rys. 1.1). Wprowadzenie do użytku spektrometrów skanujących wyposażonych w detektor jonów, którym początkowo był tzw. kubek Faradaya, a następnie powielacz elektronowy (patrz rozdz. 5), wymusiło opracowanie metod rejestracji widm. Rozwój elektroniki, w tamtych czasach opartej na lampach elektronowych, umożliwił skonstruowanie różnego typu rejestratorów elektromechanicznych, w których widmo było zapisywane pisakiem na taśmie papierowej. Ta metoda miała jednak ograniczone zastosowanie ze względu na małą szybkość działania i niski zakres dynamiczny. Dla niektórych typów bardzo szybko działających analizatorów masy, takich jak analizator czasu przelotu, jedynym sposobem obserwacji widma było zastosowanie oscyloskopu, a trwały zapis widma uzyskiwało się fotografując ekran.

W późniejszych, ale jeszcze przedkomputerowych czasach stosowano szeroko rejestratory, w których widmo zapisywano na taśmie pokrytej emulsją czułą na nadfiolet. Widmo było „rysowane” promieniem światła nadfioletowego sterowanym przez czuły galwanometr zwierciadłowy, a ściślej przez 3 galwanometry o różnej czułości. Dzięki temu na taśmie były rysowane 3 widma o stosunku intensywności 1 : 10 : 100, co bardzo poprawiało zakres dynamiczny. Taki typ rejestracji widm był powszechnie stosowany jeszcze w latach 80. XX wieku (rys. 1.8).

Rys. 1.8. Widmo masowe zarejestrowane na taśmie czułej na promieniowanie UV

Źródło: ze zbiorów autora.

Sytuacja uległa radykalnej zmianie wraz z rozpowszechnieniem komputerów – najpierw stacji roboczych, potem komputerów osobistych. Obecnie każdy spektrometr mas współpracuje z komputerem, który służy nie tylko do rejestracji i przetwarzania widm, ale też do sterowania spektrometrem.

I co dalej?

Obecnie, czyli na początku lat 20. XXI wieku, spektrometria mas jest już dojrzałą metodą analityczną i powszechnie stosowanym narzędziem badawczym w wielu dziedzinach nauki – nie tylko w chemii, ale przede wszystkim w biochemii i biotechnologii oraz inżynierii materiałowej. Spośród wielu typów analizatorów masy na rynku dominują analizatory kwadrupolowe i analizatory czasu przelotu oraz układy tandemowe i hybrydowe zbudowane z tych analizatorów. Stale rozwija się Orbitrap, który jest niewątpliwie techniką perspektywiczną. Od 25 lat nie pojawiła się żadna nowa metoda analizy jonów, ale nie oznacza to, że możliwości w tym zakresie się skończyły. Dodajmy jeszcze, że od kilku lat rozwija się technika łącząca spektrometrię ruchliwości jonów ze spektrometrią mas, a zakres zastosowań tej metody ciągle nie jest wystarczająco zbadany.

Jeśli chodzi o techniki jonizacji, to dominują dwie – najstarsza z nich – jonizacja elektronowa (EI), uzupełniana często jonizacją chemiczną (CI) oraz jedna z najnowszych, czyli elektrosprej (ESI), i metody komplementarne: jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) i fotojonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym (APPI). Ważną rolę odgrywa też laserowa desorpcja/jonizacja z udziałem matrycy (MALDI). Szybko rozwijają się także metody desorpcyjne z powierzchni ciała stałego, a także metody obrazowania powierzchni z wykorzystaniem spektrometrii mas.

Bardzo szeroko rozpowszechnione są obecnie techniki analityczne, w których spektrometr mas jest detektorem chromatografu gazowego lub cieczowego. Te urządzenia są wykorzystywane wszędzie tam, gdzie jest konieczne wykrywanie i oznaczanie ilościowe najróżniejszych związków chemicznych, często w bardzo małych stężeniach.

Tak więc 100 lat rozwoju uczyniło ze spektrometrii mas jedną z dominujących obecnie metod analitycznych i nic nie wskazuje na to, że jakakolwiek inna metoda mogłaby jej zagrozić.

2
PODSTAWOWE POJĘCIA, CZYLI CO I JAK MIERZYMY W SPEKTROMETRII MAS

2.1.
Czym jest spektrometria mas?

Zgodnie z obowiązującą obecnie definicją spektrometria mas jest metodą analityczną, której podstawą jest pomiar stosunku masy do ładunku (m/z) jonów w fazie gazowej. W tej zwięzłej definicji prawie każde słowo ma duże znaczenie. Termin „spektrometria” określa wszystkie metody badawcze, w których wykorzystuje się oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego z materią, czyli te, do których odnosi się nazwa „spektroskopia”, a także te metody, w których wynikiem pomiaru jest widmo innego rodzaju – takie właśnie jak widmo masowe. Spektrometria mas to nie spektroskopia, więc nie należy używać terminu „spektroskopia mas”.

Kolejne ważne słowa to „stosunek masy do ładunku jonów”. Uściślijmy od razu, że „ładunek” jest tu skrótem myślowym, z którego będziemy często korzystali, a oznacza w tym przypadku liczbę ładunków elementarnych jonu, zarówno dodatnich, jak i ujemnych, czyli zawsze jest dodatnią liczbą całkowitą. Masę będziemy natomiast wyrażać w jednostkach masy atomowej, czyli daltonach (Da). Przypomnijmy, że 1 Da jest równy 1/12 masy atomu izotopu węgla ¹²C. Zgodnie z przyjętą umową m/z jest wielkością bezwymiarową. Opisując stosunek masy do ładunku jonu stosujemy notację np. m/z 45 bez znaku równości między symbolem m/z a liczbą.

Dlaczego jednak w spektrometrii mas musimy „ważyć” jony, a nie obojętne cząsteczki lub atomy? W końcu wynikiem pomiaru ma i tak być masa atomu lub cząsteczki. Odpowiedzi dostarcza nam fizyka. Jedyną siłą, która oddziałuje na cząstki obojętne jest grawitacja. Niestety, jest to siła bardzo słaba. Siłę przyciągania F dwóch ciał o masach m₁ i m₂ odległych od siebie o dystans r określa równanie Newtona

W równaniu tym G jest stałą grawitacyjną równą 6,674·10⁻¹¹ N·m²·kg⁻². Jak widać, jest to bardzo mała liczba. No i – poza być może autorami powieści science fiction – nie potrafimy wytwarzać pól grawitacyjnych.

Nadanie cząstce ładunku elektrycznego całkowicie zmienia sytuację. Z podstawowego kursu fizyki wiemy, że cząstkę naładowaną można przyspieszyć za pomocą pola elektrycznego, a tor jej lotu można zakrzywiać, wykorzystując zarówno pola elektryczne, jak i magnetyczne. I tak cząstka o ładunku elektrycznym ze (z – liczba ładunków elementarnych, e – ładunek elementarny, czyli ładunek elektronu) przyspieszona napięciem V uzyskuje energię kinetyczną równą mv²/2 (m – masa cząstki, v – prędkość). Cząstka porusza się więc z prędkością

Pojawia się więc tutaj parametr m/z, który wystąpił w definicji spektrometrii mas. Cząstka przyspieszona danym napięciem V porusza się zatem tym szybciej, im większy ma ładunek i tym wolniej, im większą ma masę. Można to oczywiście wykorzystać do pomiaru wartości m/z – wrócimy do tego równania w rozdziale 4.4 przy omawianiu analizatora czasu przelotu.

Patrząc z historycznego punktu widzenia, po raz pierwszy do rozdzielania cząstek naładowanych o różnych wartościach m/z wykorzystano pole magnetyczne. Cząstka o ładunku ze przyspieszona napięciem V, wlatując w pole magnetyczne prostopadle do linii sił tego pola, zaczyna poruszać się po okręgu o promieniu r danym równaniem

gdzie B jest wartością indukcji pola magnetycznego. I tu także pojawia się parametr m/z. Tak więc w spektrometrii mas musimy wykorzystywać cząstki naładowane, czyli z punktu widzenia chemika – jony, a parametrem, który możemy zmierzyć, jest zawsze stosunek masy jonu do jego ładunku.

Manewrowanie jonami: przyspieszanie i zmiana toru ich lotu musi odbywać się w warunkach bezkolizyjnych z otaczającą je materią, co oznacza konieczność pracy w wysokiej próżni. To, jak bardzo musimy obniżyć ciśnienie w spektrometrze mas, aby jony mogły bez przeszkód dolecieć do detektora, można oszacować na podstawie przybliżonego równania określającego średnią drogę swobodną cząstki w gazie, czyli średni dystans, który cząstka w gazie przebywa między dwoma kolejnymi zderzeniami z innymi cząstkami

Powyższe równanie dotyczy powietrza, ponieważ to właśnie powietrza musimy się pozbyć z naszego przyrządu. Przykładowe wartości średniej drogi swobodnej dla różnych ciśnień przedstawiono w tabeli 2.1.

Z tabeli 2.1 wynika, że najwyższym dopuszczalnym ciśnieniem w spektrometrze jest wartość ok. 1·10–5 mbar, która gwarantuje, że w typowych przyrządach, w których droga jonów nie przekracza 2–3 m, jony bez przeszkód dolecą do detektora. W niektórych typach przyrządów ta droga jest jednak znacznie dłuższa i tam trzeba pracować w warunkach znacznie wyższej próżni. Będzie o tym mowa w rozdziale 4.6.

Tabela 2.1. Przykładowe wartości średniej drogi swobodnej cząstki w powietrzu dla różnych ciśnień

P [mbar]

L

P [mbar]

L

1013

0,00068 mm

1·10–4

70 cm

1

0,07 mm

1·10–5

7 m

0,1

0,7 mm

1·10–6

70 m

1·10–2

7 mm

1·10–7

700 m

1·10–3

7 cm

1·10–8

7 km

Warto wspomnieć, że to właśnie problemy z uzyskaniem wystarczająco wysokiej próżni były przyczyną stosunkowo powolnego rozwoju spektrometrii mas. Dopiero skonstruowanie najpierw pomp dyfuzyjnych, a następnie pomp turbomolekularnych umożliwiło uzyskiwanie próżni nawet rzędu 10–9 mbar w warunkach statycznych, czyli bez dopływu gazu z zewnątrz, a także pozwoliło na połączenie technik chromatograficznych ze spektrometrią mas.

2.2.
Widmo masowe

Wynikiem analizy techniką spektrometrii mas jest najczęściej widmo masowe. Przykładowe widmo kwasu octowego zarejestrowane techniką jonizacji elektronowej (EI) przedstawiono na rysunku 2.1.

Widmo masowe to wykres, na którego poziomej osi znajdują się wartości m/z, natomiast na osi pionowej – intensywność względna lub bezwzględna sygnałów (pików) odpowiadających zarejestrowanym jonom. Zazwyczaj sygnałowi o najwyższej intensywności przypisuje się wartość 100%, ale często oś intensywności jest wyskalowana w jednostkach bezwzględnych, np. liczbie zliczeń jonów na sekundę lub wartości napięcia sygnału z detektora. Jest to przydatne wtedy, gdy chcemy porównać rzeczywiste intensywności sygnałów w różnych widmach. Warto w tym miejscu zrobić uwagę terminologiczną. Słowem „intensywność” określamy wysokość sygnału lub pole jego powierzchni w widmie masowym. Natomiast w sytuacji, gdy mówimy o liczbie jonów, które zostały zarejestrowane, powinniśmy używać terminu „abundancja”. Tak więc powiemy, że w widmie pokazanym na rysunku 2.1 intensywność sygnału o m/z 15 jest mniejsza od intensywności sygnału o m/z 43, co oznacza, że abundancja jonów o m/z 15 była mniejsza od abundancji jonów o m/z 43.

Rys. 2.1. Widmo masowe kwasu octowego

Źródło: opracowanie własne.

Jon, którego masa jest równa masie cząsteczkowej badanego związku (z dokładnością do masy elektronu – będzie o tym mowa dalej), nosi nazwę jonu molekularnego. Jony o mniejszych masach, które powstają w wyniku rozpadu jonu molekularnego, to jony fragmentacyjne. Obecność jonu molekularnego w widmie jest niezbędna w celu wyznaczenia masy cząsteczkowej badanego związku. Jony fragmentacyjne są przydatne do identyfikacji badanej próbki. Powiedzmy od razu, że w niektórych typach widm i dla niektórych typów związków nie daje się zarejestrować jonu molekularnego i trzeba w takiej sytuacji wybrać inną technikę jonizacji. Częsta jest też sytuacja odwrotna, kiedy w widmie obserwujemy tylko jon molekularny, a nie ma jonów fragmentacyjnych. W takiej sytuacji fragmentację można wymusić różnymi technikami. Przykład ilustrujący powyższe stwierdzenia jest pokazany na rysunku 2.2.

Rys. 2.2. Widma kaprylanu butylu zarejestrowane z wykorzystaniem różnych technik jonizacji. Widmo górne: jonizacja polem (FI), widmo środkowe: jonizacja chemiczna z wykorzystaniem amoniaku (CI), widmo dolne: jonizacja elektronowa (EI)

Źródło: opracowanie własne.

W dolnym widmie, które zostało zarejestrowane z wykorzystaniem jonizacji elektronowej, w ogóle nie obserwuje się jonu molekularnego. Oznacza to, że w tych warunkach cała populacja jonów molekularnych uległa rozpadowi na fragmenty już w źródle jonów. Jest to typowe dla jonizacji EI, w której jony molekularne otrzymują w procesie jonizacji stosunkowo wysoką energię, co powoduje ich fragmentację. Na podstawie tego widma nie określimy masy cząsteczkowej badanego związku, ale być może potrafimy go zidentyfikować, porównując zarejestrowane widmo z widmami z komputerowych bibliotek widm. W widmie wykorzystującym jonizację chemiczną (CI), która jest znacznie „łagodniejszą” metodą jonizacji, czyli taką, w której tworzący się jon molekularny otrzymuje niższą energię, jest on już głównym jonem w widmie, a sygnały jonów fragmentacyjnych są słabe. Dodajmy od razu, że, mówiąc ściśle, w tej metodzie jonizacji nie powstaje „prawdziwy” jon molekularny, ale jon utworzony w wyniku przyłączenia kationu H⁺ do badanej cząsteczki – jony takie nazywamy jonami pseudomolekularnymi. I wreszcie górne widmo zostało zarejestrowane z wykorzystaniem najłagodniejszej metody jonizacji – jonizacji polem (FI). Widać w nim praktycznie tylko jon molekularny, tak więc na podstawie tego widma nie będziemy mogli nic powiedzieć o strukturze cząsteczki. Te przykłady pokazują, jak ważny jest właściwy dobór metody wytwarzania jonów w spektrometrii mas.

Takie widmo jak pokazane na rysunku 2.1 widmo kwasu octowego można bardzo łatwo zinterpretować, czyli powiązać obecność określonych pików w widmie ze strukturą cząsteczki. I tak np. jon o m/z 45 różni się o 15 jednostek m/z od jonu molekularnego. W widmach zarejestrowanych z wykorzystaniem technik jonizacji elektronowej (EI) jony są praktycznie zawsze naładowane pojedynczo, czyli liczbowo wartości m/z odpowiadają wartościom masy atomowej. Masę 15 Da może mieć w rozpatrywanym przykładzie tylko grupa metylowa (CH₃), czyli jon o m/z 45 powstaje w wyniku rozerwania wiązania pomiędzy atomem węgla grupy metylowej i atomem węgla grupy karbonylowej (rys. 2.3). Analogicznie, jon o m/z 43 powstaje w wyniku oderwania od jonu molekularnego grupy o masie 17 Da, czyli grupy hydroksylowej (OH). Analizie fragmentacji jonów w spektrometrii jest poświęcony rozdział 8.

Niestety, nie każde widmo masowe daje się tak łatwo zinterpretować jak widmo kwasu octowego. Na rysunku 2.4. przedstawiono widmo EI cholesterolu. Interpretacja takiego widma w sposób opisany dla widma kwasu octowego nie jest możliwa i tak naprawdę nikt obecnie takich widm nie interpretuje. Stanowią one jedynie swoisty „odcisk palca” badanego związku i służą do jego identyfikacji przez porównanie z widmami znajdującymi się w komputerowych bazach danych.

Rys. 2.3. Podstawowe sposoby rozpadu jonu molekularnego kwasu octowego

Rys. 2.4. Widmo EI cholesterolu

Źródło: baza danych widm masowych NIST.

Na rysunkach 2.1, 2.2 i 2.4 pokazano jeden z dwóch sposobów prezentacji wyników pomiarów technikami spektrometrii mas – przetworzenie za pomocą procedury centroidowania (centroiding). Niemniej widma masowe, podobnie jak praktycznie wszystkie inne typy widm, charakteryzują się nie tylko położeniem i intensywnością sygnałów, ale także ich szerokością, która zależy m.in. od zdolności rozdzielczej spektrometru. Takie widmo, noszące nazwę widma profilowego lub nieprzetworzonego (raw data spectrum), pokazano na rysunku 2.5a. Widoczna tu postać wydruku widma ma tę zaletę, że pokazuje dokładnie to, co zostało zarejestrowane przez spektrometr. Istotną wadą – przynajmniej do niedawna – była wielokrotnie większa ilość danych, które należało zapisać w pamięci komputera. Ponadto widma nieprzetworzone jest dużo trudniej porównywać ze sobą i gromadzić w bazach danych. Wad tych pozbawione jest widmo centroidowane. W takim widmie każdy pik jest opisany tylko dwiema liczbami: wartością m/z, którą dla niezbyt dużych cząsteczek zaokrągla się najczęściej do najbliższej liczby całkowitej, odpowiadającej masie nominalnej jonu (patrz podrozdział 2.3), oraz względnej intensywności, czyli też najczęściej liczby całkowitej z przedziału od 1 do 100%. Takie dane zajmują bardzo mało miejsca w pamięci komputera i bardzo dobrze nadają się do dalszego przetwarzania, np. w celu wyszukania podobnych widm w bazie danych. Wadą widm centroidowanych jest ich jakość, która bardzo zależy od jakości widm profilowych, więc w przypadku niskiej rozdzielczości spektrometru i/lub niskiego stosunku sygnału do szumu (np. w przypadku badania bardzo małych ilości substancji) niektóre piki mogą zostać podczas centroidowania „zgubione”. Dużo zależy tu od jakości numerycznej procedury centroidowania zaimplementowanej w programie do obróbki widm danego producenta. Więcej informacji na ten temat można znaleźć w rozdziale 5.2.

Rys. 2.5. Widma: a) profilowe nieprzetworzone (raw data spectrum), b) centroidowane (centroid spectrum)

Źródło: opracowanie własne.

2.3.
Co właściwie mierzymy w spektrometrze mas, czyli parę słów o masie atomowej i cząsteczkowej

Jedną z najważniejszych informacji, których dostarcza nam pomiar za pomocą spektrometrii mas, jest masa cząsteczkowa badanego związku chemicznego. Stwierdzenie niby jednoznaczne, ale… chemicy posługują się trzema „typami” mas cząsteczkowych. Co więc tak naprawdę mierzy spektrometr mas? Zacznijmy od początku.

Już od lat 20. XX wieku wiadomo (dzięki spektrometrii mas!), że w większości pierwiastki chemiczne występujące w przyrodzie są mieszaninami izotopów. Izotopy danego pierwiastka mają taką samą liczbę atomową, ale różne liczby masowe i w związku z tym różne masy atomowe. Zestawienie mas atomowych i składów izotopowych najlżejszych pierwiastków, z którymi mamy najczęściej do czynienia w chemii organicznej, przedstawiono w tabeli 2.2. Pełny wykaz obejmujący wszystkie pierwiastki występujące w przyrodzie znajduje się w Aneksie 1 na s. 389.

Należy w tym miejscu podkreślić, że zawartości procentowe izotopów poszczególnych pierwiastków w przyrodzie nie są stałe i mogą zmieniać się w pewnych granicach w zależności od pierwiastka, źródła pochodzenia próbki i sposobu jej przygotowania. Ilustrują to różne liczby miejsc po przecinku w kolumnie Zawartość procentowa w tabeli 2.2 – im ta liczba jest mniejsza, tym zmienność składów izotopowych pierwiastka jest większa. Zmiany te są jednak na tyle małe, że z punktu widzenia spektrometrii mas związków organicznych nie mają znaczenia. Aktualne informacje dotyczące wartości mas atomowych i składów izotopowych można znaleźć na stronach Komisji ds. Składów Izotopowych i Mas Atomowych Unii Chemii Czystej i Stosowanej (CIAAW IUPAC): http://www.ciaaw.org/.

Tabela 2.2. Dokładne masy atomowe i składy izotopowe najlżejszych pierwiastków

Liczba atomowa

Symbol

Masa atomowa

Zawartość procentowa

1

H

1,007825

99,9885

D

2,014102

0,0115

2

He

3,016029

0,000134

4,002603

99,999866

3

Li

6,015123

7,59

7,016003

92,41

4

Be

9,012183

100

5

B

10,012937

19,9

11,009305

80,1

6

C

12,000000

98,93

13,003355

1,07

7

N

14,003074

99,636

15,000109

0,364

8

O

15,994915

99,757

16,999132

0,038

17,999160

0,205

9

F

18,998403

100

Liczba atomowa

Symbol

Masa atomowa

Zawartość procentowa

10

Ne

19,992440

90,48

20,993847

0,27

21,991385

9,25

11

Na

22,989769

100

12

Mg

23,985042

78,99

24,985837

10,00

25,982593

11,01

13

Al

26,981539

100

14

Si

27,976927

92,223

28,976495

4,685

29,973770

3,092

15

P

30,973762

100

16

S

31,972071

94,99

32,971459

0,75

33,967867

4,25

35,967081

0,01

17

Cl

34,968853

75,76

36,965903

24,24

Uwaga! Kursywą oznaczono pierwiastki monoizotopowe, a drukiem pogrubionym pierwiastki, których masy atomowe są wyższe od najbliższej liczby całkowitej.

Chemik pracujący w laboratorium ma najczęściej do czynienia z pierwiastkami i związkami chemicznymi o naturalnej zawartości izotopów. Dlatego też posługuje się w obliczeniach stechiometrycznych średnimi masami atomowymi MS, które są obliczane zgodnie ze wzorem:

gdzie M(i) oznacza masę atomową i-tego izotopu, x(i) – jego zawartość, a n – liczbę izotopów. Dlatego też na przykład w obliczeniach stechiometrycznych jako masę atomową chloru przyjmujemy wartość 35,5, będącą wynikiem obliczenia: 35 · 0,758 + + 37 · 0,242 ≅ 35,5.

Po tym wstępie pora na omówienie wspomnianych na początku rozdziału trzech typów mas cząsteczkowych, z którymi spotykamy się w chemii i w spektrometrii mas. Są to:

— masa nominalna,

— masa monoizotopowa,

— masa średnia.

Zacznijmy od tej ostatniej. Jak sama nazwa wskazuje, średnią masę cząsteczkową oblicza się ze średnich mas atomowych pierwiastków wchodzących w skład cząsteczki. Jest to przydatne w obliczeniach stechiometrycznych, ale z punktu widzenia spektrometrii mas nie ma żadnego sensu. Dla spektrometru każdy izotop danego pierwiastka jest czymś innym, ponieważ ma inną masę, dlatego też w spektrometrii mas posługujemy się masami monoizotopowymi. Masy monoizotopowe obliczamy z dokładnych masy atomowych konkretnych izotopów pierwiastków wchodzących w skład cząsteczki. Czym innym – z punktu widzenia spektrometrii mas – jest więc chlorowodór zawierający izotop ³⁵Cl, a czym innym – zawierający izotop ³⁷Cl. W przypadku związków o niezbyt dużych cząsteczkach i zawierających lekkie pierwiastki, których masy atomowe niewiele różnią się od liczb całkowitych, posługujemy się często nominalnymi masami cząsteczkowymi, obliczonymi z wykorzystaniem mas atomowych zaokrąglonych do liczb całkowitych.

Zestawienie trzech typów mas cząsteczkowych obliczonych dla cząsteczek o różnej wielkości przedstawiono na rysunku 2.6. Jak widać, masa nominalna jest zawsze najniższa, a masa średnia – najwyższa, przy czym różnica między wartościami tych mas rośnie wraz ze wzrostem rozmiaru cząsteczki. O ile więc posługiwanie się masami nominalnymi dla cząsteczek nie większych niż ok. 500 Da jest uzasadnione i nie wprowadza większego błędu, to dla cząsteczek większych, a zwłaszcza bardzo dużych, musimy już korzystać z dokładnych mas monoizotopowych. Te ostatnie są też niezbędne, jeśli chcemy na podstawie zmierzonej masy jonu wyznaczyć jego wzór sumaryczny (patrz rozdział 7.2).

Rys. 2.6. Porównanie różnych typów mas cząsteczkowych oraz profili izotopowych jonów o różnej wielkości

Ta dyskusja na temat masy cząsteczkowej może wydawać się zbyt obszerna, ale jest ona wynikiem wieloletnich doświadczeń autora jako operatora spektrometrów mas, a następnie kierownika pracowni MS. Mimo że informacje o typach mas cząsteczkowych powinny być znane chemikom, ciągle zdarzają się sytuacje, w których klient ma pretensje, że źle zmierzono masę cząsteczkową jego próbki. Po bliższym przyjrzeniu okazuje się jednak, że podał on masę średnią, a spektrometr zmierzył masę monoizotopową… Mam nadzieję, że czytelnicy tej książki takiego błędu już nie popełnią.

2.4.
Izotopologi, izotopomery i profile izotopowe

Na rysunku 2.6 pokazano jeszcze jedno zagadnienie niezwykle istotne w spektrometrii mas – wpływ składu izotopowego cząsteczki na wygląd widma masowego. Przyjrzyjmy się widmu jonu molekularnego związku o wzorze C₃H₇NO₂ (pierwszy wykres z lewej). Oprócz głównego sygnału o masie nominalnej 89 pojawiają się słabe sygnały o masach 90 i 91 – dla zwięzłości będziemy tu posługiwać się masą zamiast wartością m/z, ponieważ dyskutowane jony są naładowane pojedynczo. Jeśli spojrzymy do tabeli 2.2, to zobaczymy, że węgiel składa się z ok. 99% izotopu ¹²C i 1% izotopu ¹³C. Jest więc ok. trzyprocentowe prawdopodobieństwo, że w cząsteczce zawierającej 3 atomy węgla znajdziemy jeden atom ¹³C. I właśnie od takich cząsteczek pochodzi jon o masie 90. Swój wkład wnosi także izotop ¹⁵N azotu (ok. 0,4%). Jeszcze mniejsze, ale niezerowe, jest prawdopodobieństwo znalezienia w cząsteczce dwóch cięższych izotopów, np. dwóch atomów ¹³C lub jednego atomu ¹³C i jednego atomu ¹⁵N, ewentualnie jednego atomu tlenu ¹⁸O (ok. 0,2%). Stąd pochodzi jon o masie 92.

Jony o masach większych od jonu złożonego tylko z najlżejszych izotopów tworzących go pierwiastków (jon podstawowy) noszą nazwę jonów izotopowych. Względne intensywności ich sygnałów razem z intensywnością sygnału jonu podstawowego tworzą razem profil izotopowy, zwany też obwiednią izotopową (isotope pattern). Dokładny kształt profilu izotopowego dla jonu o podanym wzorze sumarycznym i naturalnej zawartości izotopów można obliczyć teoretycznie, chociaż nie jest to proste, zwłaszcza dla dużych i bardzo dużych cząsteczek. Na szczęście wszystkie programy dołączane do komercyjnych spektrometrów mas zawierają moduł obliczania profili izotopowych, a ponadto sporo darmowych programów tego typu można znaleźć w Internecie.

Cząsteczki tego samego związku chemicznego różniące się składem izotopowym noszą nazwę izotopologów. Izotopologami są więc związki o wzorach np. C₃H₇NO₂, C₂¹³CH₇NO₂ lub C₃H₇¹⁵NO2. We wzorach izotopologów zwyczajowo nie podaje się liczb masowych przy symbolach najlżejszych izotopów, których na ogół w danym pierwiastku jest najwięcej, czyli np. ¹H, ¹²C, ¹⁴N czy ¹⁶O. Mówiąc o izotopologach nie wypowiadamy się na temat położenia cięższego atomu w cząsteczce. Jeśli jednak cząsteczka zawiera co najmniej dwa nierównocenne chemicznie atomy danego pierwiastka, jego cięższy izotop może znaleźć się w różnych miejscach cząsteczki. Cząsteczki o tym samym składzie izotopowym, ale różniące się położeniem izotopów w cząsteczce noszą nazwę izotopomerów. I tak izotopomerami są na przykład cząsteczki: ¹³CH₃–CH₂–OH i CH₃–¹³CH₂–OH. O ile izotopologi mają ogromne znaczenie w spektrometrii mas, ponieważ ich obecność powoduje pojawianie się profili izotopowych jonów w widmach, o tyle izotopomery odgrywają znacznie mniejszą rolę. Mają one te same masy, więc pojawiają się na widmie dokładnie w tym samym miejscu. Mogą natomiast dawać różne produkty – czyli różne izotopologi – w wyniku fragmentacji, co bywało wykorzystywane do badania ścieżek fragmentacji przez selektywne znaczenie izotopowe.

Znaczenie jonów izotopowych rośnie wraz ze wzrostem rozmiaru cząsteczki. Widać to na widmie największej cząsteczki na rysunku 2.6. W profilu izotopowym jonu o wzorze C₁₅₀H₃₄₈N₅₀O₉₉ i nominalnej masie cząsteczkowej równej 4432 Da to wcale nie jon złożony z najlżejszych izotopów daje najsilniejszy sygnał, ale izotopolog zawierający dwa cięższe izotopy węgla, wodoru lub azotu (lub jeden izotop ¹⁸O). Po prostu ze statystyki wynika, że właśnie takich cząsteczek jest najwięcej w tym związku. Co w tej sytuacji uznamy za masę cząsteczkową związku? Tu nic się nie zmienia: zawsze jako monoizotopową masę cząsteczkową związku przyjmujemy masę najlżejszego izotopologu, czyli cząsteczki złożonej wyłącznie z najlżejszych izotopów tworzących ją pierwiastków. W profilu izotopowym jest to więc zawsze skrajny sygnał z lewej strony.

Powyższa zasada nie dotyczy związków zawierających metale, czyli związków metaloorganicznych i koordynacyjnych (kompleksowych). Ilustruje to widmo związku cynoorganicznego pokazane na rysunku 2.7.

Rys. 2.7. Widmo EI tetraetylocyny (strzałką zaznaczono izotop cyny o największej zawartości)

Źródło: baza danych widm masowych NIST.

Metale, zwłaszcza te o wyższych liczbach masowych, mają na ogół wiele trwałych izotopów o znaczącej zawartości. Rekordzistką jest cyna, która ma 10 izotopów, z czego aż 7 charakteryzuje się zawartością powyżej 4,5%. Widać to wyraźnie na widmie (rys. 2.7). Na przykład wszystkie piki o m/z od 199 do 211 odpowiadają z chemicznego punktu widzenia temu samemu jonowi o wzorze C₆H₁₅Sn, ale pochodzą od jego różnych izotopologów. Przyjęto umownie, że jako monoizotopową masę cząsteczkową takich związków podaje się masę izotopologu zawierającego izotop metalu o największej zawartości, czyli w przypadku cyny izotop ¹²⁰Sn.

Złożone profile izotopowe mają także związki organiczne zawierające wiele atomów chloru lub bromu, takie jak np. jeden z izomerycznych heptachlorobifenyli, którego widmo pokazano na rysunku 2.8. Dla takich związków obowiązuje ta sama zasada, co w przypadku innych „zwykłych” związków organicznych, czyli jako masę cząsteczkową podamy masę najlżejszego izotopologu – w tym przypadku tego o masie 392.

Rys. 2.8. Widmo EI 2,2’,3,3’,4’4’,6-heptachlorobifenylu

Źródło: baza danych widm masowych NIST.

Do tej pory posługiwaliśmy się przykładami widm, w których występowały wyłącznie jony naładowane pojedynczo. We współczesnej spektrometrii mas mamy jednak bardzo często do czynienia z jonami naładowanymi wielokrotnie. Dotyczy to zwłaszcza dużych biocząsteczek, takich jak np. peptydy i białka. Znane są przykłady widm, w których pojawiają się jony o ładunku nawet +100! Zobaczmy teraz, jak zwiększenie ładunku jonów wpływa na wygląd widma, a w szczególności na profil izotopowy jonów.

Na rysunku 2.9 są przedstawione profile izotopowe jonów o tym samym wzorze sumarycznym C₆₀H₁₃₈N₂₀O₃₉, ale różniących się ładunkiem. Profil jonu o ładunku jednostkowym wygląda tak jak należałoby się tego spodziewać: kolejne jony izotopowe różnią się od siebie o jedną jednostkę masy atomowej (1 Da), a ponieważ ładunek jest jednostkowy, także różnice wartości m/z są równe jedności. Sytuacja zmienia się w przypadku jonu naładowanego dwukrotnie. Różnica masy między izotopologami oczywiście nie uległa zmianie, ale zmienił się ładunek. Wartości m/z będą więc dwa razy mniejsze, a zatem i odległość między pikami izotopologów w widmie będzie wynosiła ½, czyli 0,5. Analogicznie będzie w przypadku jonów naładowanych 3- i 4-krotnie. Uogólniając, odległość między kolejnymi jonami izotopowymi w widmie jonu o ładunku z (obojętne, czy +z, czy –z) będzie wynosiła 1/z. Większe znaczenie praktyczne ma obliczenie odwrotne: jeśli wartość różnicy m/z dwóch sąsiadujących jonów izotopowych jest równa Δm/z, to ładunek jonu wynosi 1/Δm/z. Tak więc mierząc odległość między jonami izotopowymi możemy obliczyć ładunek jonu. Ma to ogromne znaczenie praktyczne, zwłaszcza w spektrometrii mas dużych cząsteczek.

Rys. 2.9. Profile izotopowe jonu o wzorze C₆₀H₁₃₈N₂₀O₃₉ i ładunku: a) +1, b) +2, c) +3, d) +4

Źródło: opracowanie własne z wykorzystaniem programu komputerowego Molecular Weight Calculator for Windows Version 6.49 (http://www.alchemistmatt.com/mwtwin.html).

2.5.
Zdolność rozdzielcza spektrometru mas i jej wpływ na wygląd widma masowego

2.6.
Jak jest zbudowany spektrometr mas?

PRZYPISY

[1] Wykaz podręczników i literatury z dziedziny spektrometrii mas znajduje się na końcu książki.