Projekt okładki i stron tytułowych Weronika Szychowska

Ilustracja na okładce Sasha Yudaev (dla Unsplash)

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Redakcja Joanna Forysiak

Korekta Joanna Forysiak, Anna Wasilewska

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Koordynator produkcji Adam Krajewski

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 2017, 2023

ISBN: 978-83-01-23294-8

DOI: https://doi.org/10.53271/2023.089

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2023 r. (wyd. 2)

Warszawa 2023

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwa Naukowego PWN: mobisfera.pl

Przedmowa do wydania piątego

Zapraszamy do lektury piątego wydania książki, która, tak jak genetyka medyczna i biologia molekularna, przechodziła w ciągu minionych 20 lat widoczne zmiany. Niezmienne, stanowiące kanon genetyki, pozostają prawa Mendla, sposoby dziedziczenia, jak i zasady kodowania informacji genetycznej. Kod genetyczny jest identyczny w całym świecie ożywionym. Warto w tym miejscu zwrócić uwagę na często powtarzany błąd. Różnice, w tym osobnicze, dotyczą nie systemu kodowania, a jedynie informacji genetycznej jako takiej.

Niejako nawiązaniem do wspomnianych praw i podstaw genetyki będzie przypomnienie, że w 2023 r. mija 70. rocznica zaproponowania przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka struktury DNA. Jest to niejako dopełnienie informacji z jednego z poprzednich wydań, gdzie nawiązywaliśmy do 150. rocznicy ogłoszenia przez Grzegorza Mendla praw dziedziczenia.

Współczesna medycyna w wielu płaszczyznach jest postrzegana jako medycyna molekularna, gdzie słowo „molekularna” utożsamiane jest z osiągnięciami genetyki i innowacyjnością technologii. Poznanie pełnego zapisu informacji zawartej w genomie człowieka otworzyło nową erę przed genetyką medyczną i wyznaczyło główne kierunki rozwoju medycyny. Współczesne możliwości analizy kwasów nukleinowych i narzędzia bioinformatyczne są wykorzystywane w badaniach w zasadzie wszystkich typów chorób człowieka – zarówno w badaniach naukowych, jak i racjonalnych, odpowiadających poziomowi współczesnej wiedzy badaniach diagnostycznych. Diagnostyka chorób genetycznie uwarunkowanych, patologia molekularna i zmienność osobnicza widziane są przez pryzmat rutynowej analizy przynajmniej całej części kodującej genomu.

Badania naukowe nad poznaniem etiopatogenezy chorób w zakresie struktury genomu, mechanizmów regulacji ekspresji genów, syntezy białek, złożonych procesów ich modyfikacji i wzajemnego oddziaływania mają obok wartości poznawczej ogromne znaczenie dla tworzenia nowych koncepcji terapeutycznych w medycynie klinicznej oraz zapewnienia pacjentom i ich rodzinom kompleksowej opieki uwzględniającej poradnictwo genetyczne. W książce dokumentujemy wiele rozwiązań z zakresu genetyki medycznej i biologii molekularnej, które z rozważań natury teoretycznej nabrały praktycznego znaczenia. Mamy tu na myśli nie tylko testy genetyczne jako takie, zdobycze biotechnologii, jak i np. immunoterapię w chorobach nowotworowych i klasyczną somatyczną terapię genową w chorobach dziedzicznych. Spektakularnym osiągnięciem, z medycznego i organizacyjnego punktu widzenia, było wprowadzenie w Polsce w 2022 r. terapii genowej rdzeniowego zaniku mięśni (SMA) na bazie noworodkowego powszechnego molekularnego badania przesiewowego.

Często mówi się o rewolucyjnych zmianach i dokonaniach w genetyce od czasu, gdy Watson i Crick przedstawili strukturę DNA. Genetyka to nauka o dziedziczeniu i zmienności. Można przewidywać dalsze kierunki jej rozwoju. Zapewne jednym z nich będzie oddziaływanie środowiska pośrednio, ale i bezpośrednio na nasz genom. Ważnym zagadnieniem jest w tym kontekście mikrobiom, często nazywany drugim genomem. Kolejnym są zmiany epigenetyczne, którym w książce poświęcamy bardzo dużo miejsca. Grupy funkcyjne, często uzależnione od zmian w środowisku, w tym warunków i trybu życia, przyłączając się do poszczególnych nukleotydów w DNA, modyfikują ekspresję genów, co może się przejawiać w zmianach fenotypowych, zachowaniach, postępie procesu starzenia czy występowaniu chorób wrodzonych nawet u osób o identycznym genomie (bliźnięta jednojajowe).

* * *

Struktura obecnego wydania pozostaje niemal bez zmian. Większość rozdziałów została uaktualniona. Wydanie piąte uzupełniono o rozdziały poświęcone genealogii genetycznej i przesiewowym badaniom noworodków w kierunku genetycznych wad wrodzonych. Zasadniczo zmieniono rozdziały o terapii genowej. Doszła immunoterapia. Na nowo spojrzeliśmy na molekularne aspekty klinicznych badań nowotworowych. Rozdział Biotechnologia w pozyskiwaniu naturalnych farmaceutyków z poprzednich wydań nabrał zupełnie nowego wymiaru, w pełni, jak się wydaje, odpowiadający dzisiejszym dokonaniom. Wzajemnie uzupełniają się Techniki inżynierii genetycznej w terapii genowej, medycynie regeneracyjnej i transplantacyjnej oraz Biofarmaceutyki wytwarzane metodami inżynierii genetycznej. Zachowana jest integralność poszczególnych rozdziałów, co skutkuje tym, że pełną wiedzę z danego tematu czytelnik znajdzie w kilku miejscach książki – tak jest w przypadku zastosowań sekwencjonowania następnej generacji w diagnostyce genetycznej, redagowania DNA, terapii genowej. Niektóre rozdziały wzajemnie się uzupełniają, np. Genetyczne choroby metaboliczne i Program badań przesiewowych noworodków. W załącznikach znalazły się przykładowe wyniki analiz cytogenetycznych i sprawozdania z analizy DNA. Właściwa interpretacja uzyskanych wyników nabiera znaczenia szczególnie w przypadkach diagnostyki, w której wykorzystano wysoko przepustowe metody sekwencjonowania DNA.

W tym wydaniu zachowaliśmy wiele informacji opisujących metody analizy molekularnej czy strategie diagnostyczne, które z punktu widzenia stosowanej obecnie praktyki straciły na znaczeniu. Wydaje się jednak, że zapoznanie się z nimi jest niezbędne dla prawidłowego sposobu rozumowania genetycznego również na płaszczyźnie molekularnej.

* * *

Tradycyjnie, jak i w innych dziedzinach życia, kwestia legislacji badań genetycznych pozostaje w Polsce w tyle za Europą. Sprzyja to niepopartej profesjonalnym przygotowaniem aktywności, często ze szkodą dla zainteresowanych genetyka medyczną. Mimo upływu ponad 20 lat od podpisania przez Rząd RP Konwencji o ochronie praw człowieka i godności istoty ludzkiej wobec zastosowań biologii i medycyny, nie została ona ratyfikowana przez sejm. Nie ratyfikowano też protokołu dodatkowego o testach genetycznych dla celów zdrowotnych. Przykładem braku regulacji prawnych, ale też wyobraźni i wiedzy, jest kwestia gromadzenia i przechowywania danych genetycznych. Wraz z rozwojem metod analizy kwasów nukleinowych i poznawania genomu człowieka nabrała ona swoistej wagi i znaczenia zarówno z punktu widzenia osobniczego, jak i danych populacyjnych. Niestety, jak wspomniano, nie ma stosownego prawodawstwa.

W Polsce nie udało się też wypracować systemu „opieki genetycznej” na poziomie pacjent–lekarz i na poziomie krajowym. Nie ma np. struktury (krajowej bądź regionalnej) koordynującej badania, diagnostykę, profilaktykę i leczenie chorób genetycznie uwarunkowanych, bazującej na ośrodkach referencyjnych w zakresie genetyki człowieka.

* * *

Spośród pozycji wydawniczych warte polecenia są:

– z zakresu genetyki klinicznej

M.J. Bamshad, J.C. Carey, J.B. Lynn, Genetyka medyczna, red. nauk. B. Edra Urban & Partner, Wrocław 2019,

Genetycznie uwarunkowane zaburzenia rozwoju u dzieci, red. R. Śmigiel, K. Szczałuba, PZWL, Warszawa 2021,

M.J. Bamshad, J.C. Carey, J.B. Lynn, Genetyka medyczna, red. wyd. polskiego M. Borowiec, Edra Urban & Partner, Wrocław 2021,

– z zakresu genetyki i genetyki molekularnej

T. Brown, Genomy, przekład pod red. P. Węgleńskiego, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2019,

S. Mukherjee, Gen. Ukryta historia, Wydawnictwo Czarne,
Wołowiec 2017,

– z zakresu popularyzacji nauki

W. Isaacson, Kod życia. Jennifer Doudna, edycja genów i przyszłość ludzkości, Wydawnictwo Insignis, Kraków 2023,

– wznowienia podręczników

P. Łuków, T. Pasierski, Etyka medyczna z elementami filozofii, PZWL, Warszawa 2022,

Bioetyka, red. nauk. W. Chańska, J. Różyńska, Wolters Kluwer Polska, Warszawa 2013.

Jerzy Bal

Przedmowa do wydania czwartego

Przedstawiamy książkę Genetyka molekularna i medyczna. Jest ona w prostej linii kontynuacją trzech kolejnych (poczynając od 2001 r.) wydań podręcznika Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej. Tak jak poprzednio, cel, jaki przed sobą stawiamy, to prezentacja współczesnej wiedzy z zakresu genetyki człowieka oraz osiągnięć i zastosowań metod biologii molekularnej w różnych działach medycyny. Jesteśmy też przekonani, że pełnemu zrozumieniu zmian, jakie dokonują się w medycynie, powinna towarzyszyć informacja z zakresu podstaw genetyki i praw rządzących przekazywaniem i ekspresją cech. Odzwierciedla to układ i zawartość książki.

Lata upływające od poprzedniego wydania naznaczone są przez kolejne kroki milowe w genetyce człowieka. Odkrycia antropologów w połączeniu z nowymi metodami analizy DNA dostarczają nowych danych o ewolucji człowieka, w tym o bagażu, jaki gromadził się w genomie na drodze zasiedlania przez naszych przodków kolejnych kontynentów. C. Venter i C. Hutchison zredukowali życie swobodnie żyjącego organizmu do 473 genów. Technologia CRISPR/Cas9 wydaje się być aplikacją na miarę przełomu, jaki w genetyce molekularnej dokonał się w latach 70/80 ubiegłego wieku za sprawą enzymów restrykcyjnych. Precyzyjne redagowanie genomu urealnia bowiem nadzieje, jakie wiążą się z terapią genową. Zadziwiająco szybko adaptowana do diagnostyki genetycznej metoda sekwencjonowania następnej generacji w wielu przypadkach osiągnęła status badania rutynowego. To kwestia krótkiego czasu, aby metoda ta stała się badaniem z wyboru również w przesiewie noworodkowym czy w farmakogenetyce. Nowe technologie analizy kwasów nukleinowych unaoczniają jednocześnie wyzwania, jakie stoją przed genetyką. Liczba danych otrzymywanych po analizie fragmentu DNA sekwencjonowanego metodą Sangera wzrosła ekspotencjalnie spośród tysięcy lub milionów bajtów poprzez dziesiątek milionów dla mikromacierzy do dziesiątek miliardów w sekwencjonowaniu następnej generacji.

Zmiany w obecnym wydaniu obejmują nie tylko uaktualnienia przekazanych wcześniej informacji. Nowym rozdziałem jest Epigenetyka. Problematyka ta była obecna i w poprzednich wydaniach, ale jej znaczenie dla zrozumienia mechanizmów modyfikacji informacji genetycznej niewątpliwie uzasadnia nowe rozłożenie akcentów. Szerzej nakreślono również spektrum możliwości, jakie przynosi nieinwazyjna molekularna diagnostyka prenatalna. Więcej miejsca niż do tej pory poświęcamy takim zagadnieniom, jak bioinformatyka. W warsztacie genetyka sprawność w wykorzystywaniu dostępnych w internecie danych czy komputerowa analiza sekwencji nukleotydów w DNA już nie wystarcza. Znaczenia nabiera umiejętność stawiania stosownych pytań, jak i zdolność interpretacji wyników analizy eksomu czy genomu pacjenta. Nowym, niewątpliwe brakującym do tej pory, jest rozdział poświęcony epidemiologii chorób dziedzicznych.

Społeczne oddziaływania i odbiór genetyki są bliskie środowisku genetyków człowieka. To bardzo pragmatyczne podejście. Efekty naszych działań będą bowiem tym większe, im większa będzie dla nich akceptacja i zrozumienie. W tym kontekście warto pytać o zasady i reguły towarzyszące genetyce medycznej. Taką też funkcję ma spełniać konsekwentnie uwspółcześniany rozdział poświęcony aspektom prawnym współczesnej genetyki.

Last but not least w rozdziale Słabość i siła genocentrycznej wizji biologii znajdzie czytelnik rozważania, czy, a jeżeli tak, to w jakim stopniu, koncepcja genu wpisuje się w rozwój nauki.

* * *

Nową pozycją wydawniczą wartą polecenia jest Genetyka medyczna E.S. Tobias, M. Connor, M. Ferguson-Smith. Redakcja naukowa A. Latos-Bieleńska. PZWL Warszawa 2014. Szereg informacji z zakresu genetyki klinicznej znajdzie czytelnik również w podręczniku Genetyka medyczna. Redakcja G. Drewa, T. Ferenc. Elsevier Urban & Partner. Wrocław 2011.

Jerzy Bal

Autorzy

Prof. dr hab. Jerzy Bal

Kieruje Zakładem Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie. Zajmuje się badaniami i diagnostyką molekularną chorób dziedzicznych.

Prof. dr hab. Ewa Bartnik

Wieloletnia pracowniczka Instytutu Genetyki i Biotechnologii Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego. W ramach zainteresowań genetyką człowieka specjalizuje się w chorobach powodowanych defektem mitochondrialnego DNA.

Mgr Marta Biedrzycka

Pracuje w Zakładzie Mikrobiologii Molekularnej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie. Zajmuje się epidemiologią molekularną i genomiczną wieloopornych bakterii z rodziny Enterobacterales.

Prof. dr hab. Ewa Bocian

Wieloletnia pracowniczka Zakładu Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie, którym kierowała w latach 2011–2013. Specjalizowała się w badaniach aberracji chromosomowych oraz w nowoczesnej diagnostyce cytogenetycznej i molekularnej chorób genetycznych.

Prof. dr hab. Leszek Bosek

Profesor na Wydziale Prawa i Administracji Uniwersytetu Warszawskiego. Kierownik Centrum Prawa Medycznego i Biotechnologii Uniwersytetu Warszawskiego, sędzia Sądu Najwyższego, w latach 2006–2018 radca, a następnie dyrektor i Prezes Prokuratorii Generalnej Rzeczypospolitej Polskiej; współautor i współredaktor sześciotomowej serii System Prawa Medycznego, ukazującej się od 2017 r., oraz publikacji Konstytucja Rzeczypospolitej Polskiej. Komentarz, t. 1–2, Warszawa 2016 (współredaktor prof. M. Safjan).

Prof. dr hab. Ewa Brojer

Wieloletnia pracowniczka i Kierowniczka Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologiczej Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie. Jej zainteresowania koncentrują się wokół zagadnień alloimmunizacji antygenami komórek krwi oraz molekularnych badań przeglądowych wirusów u dawców krwi.

Dr hab. n. med. Agnieszka Charzewska

Pracuje naukowo w Zakładzie Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie, zajmuje się badaniem podłoża molekularnego i diagnostyką genetycznie uwarunkowanych chorób neurologicznych.

Dr Barbara Czartoryska

Specjalistka w zakresie badań biochemicznych i diagnostyki chorób lizosomalnych. Pracowała w Zakładzie Genetyki Instytutu Psychiatrii i Neurologii w Warszawie.

Dr Patrycja Daca-Roszak

Pracuje w Instytucie Genetyki Człowieka PAN (IGC PAN) w Poznaniu. Specjalizuje się w zagadnieniach genetyki populacyjnej pod kątem kryminalistyki i ewolucji człowieka.

Prof. dr hab. n. farm. Władysława A. Daniel

Kieruje Zakładem Farmakokinetyki i Metabolizmu Leków Instytutu Farmakologii PAN w Krakowie. Specjalizuje się w farmakokinetyce i metabolizmie leków działających na ośrodkowy układ nerwowy oraz prowadzi badania nad fizjologicznym i farmakologicznym znaczeniem wątrobowego i mózgowego cytochromu P450.

Dr Paula Dobosz

Pracuje w Instytucie Genetyki i Biotechnologii Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego. Specjalizuje się w immunoterapii i genetyce onkologicznej.

Prof. dr hab. Józef Dulak

Kierownik Zakładu Biotechnologii Medycznej Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Prowadzi badania nad mechanizmami molekularnymi chorób sercowo-naczyniowych i genetycznych chorób mięśni i układu nerwowego, w tym funkcji komórek macierzystych, i możliwościami terapii genowej. Zajmuje się zagadnieniami bioetycznymi i społeczną rolą nauki.

Dr Janusz Fiett

W Zakładzie Mikrobiologii Molekularnej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie zajmował się epidemiologią molekularną zakażeń bakteryjnych oraz metodami typowania bakterii opartymi na analizie DNA.

Prof. Alain Fischer

Profesor na Uniwersytecie im. Kartezjusza (Paryż V). Członek Francuskiej Akademii Nauk. Specjalista w zakresie diagnostyki i leczenia pierwotnych niedoborów odporności.

Dr hab. Tomasz Gambin, prof. PW

Pracuje w Instytucie Informatyki na Politechnice Warszawskiej oraz w Zakładzie Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie. Zajmuje się rozwijaniem narzędzi bioinformatycznych wykorzystywanych w badaniach i diagnostyce molekularnej.

Prof. dr hab. Marek Gniadkowski

Kierownik Zakładu Mikrobiologii Molekularnej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie. Specjalizuje się w epidemiologii molekularnej zakażeń bakteryjnych.

Dr hab. n. med. Monika Gos, prof. IMiD

Kierowniczka Pracowni Genetyki Rozwoju Zakładu Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie, diagnosta laboratoryjna, specjalistka z laboratoryjnej genetyki medycznej, certyfikowana przez European Board of Medical Geneticists; zajmuje się badaniami i diagnostyką molekularną chorób genetycznie uwarunkowanych, w tym zespołów dysmorficznych, chorób związanych z defektem piętnowania genomowego i chorób nerwowo-mięśniowych; jest odpowiedzialna za stronę genetyczną przesiewu noworodków w kierunku SMA.

Dr hab. n. med. Piotr Grabarczyk

Kierownik Zakładu Wirusologii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie. Zajmuje się zapobieganiem przenoszenia czynników zakaźnych przez przetoczenia krwi, jej składników i produktów krwiopochodnych oraz diagnostyką i monitorowaniem tej grupy zakażeń u pacjentów, zwłaszcza z deficytami odporności.

Dr Katarzyna Guz

Kierowniczka Pracowni Genetyki Komórek Krwi i Chimeryzmu Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologiczej Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie. Specjalizuje się w badaniach molekularnych antygenów erytrocytów, płytek krwi i granulocytów oraz w nieinwazyjnej diagnostyce prenatalnej konfliktów matczyno-płodowych.

Prof. dr hab. Tomasz Grzybowski

Kieruje Katedrą Medycyny Sądowej Collegium Medicum w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Specjalizuje się w badaniach genetyczno-sądowych, populacyjnych i filogeograficznych.

Dr hab. n. med. Dorota Hoffman-Zacharska, prof. IMiD, prof. ucz. UW

Pracuje w Zakładzie Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie, gdzie kieruje Pracownią Neurogenetyki; diagnosta laboratoryjna ze specjalizacją w zakresie laboratoryjnej genetyki medycznej oraz pracownik naukowo-dydaktyczny Instytutu Genetyki i Biotechnologii Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego.
W pracy naukowej zajmuje się badaniem podłoża molekularnego genetycznie uwarunkowanych chorób neurologicznych, w pracy dydaktycznej zagadnieniami genetyki medycznej.

Dr hab. Radosław Izdebski

Pracuje w Zakładzie Mikrobiologii Molekularnej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie. Kurator bazy danych Klebsiella pneumoniae MLST Instytutu Pasteura w Paryżu. Zajmuje się epidemiologią molekularną zakażeń bakteryjnych, ze szczególnym uwzględnieniem metod typowania bakterii opartych na sekwencjonowaniu DNA.

Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski

Wieloletni Kierownik Zakładu Biologii Systemów na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego i Zakładu Biosyntezy Białka w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie. Zajmuje się genetyką rozwoju i adaptacji organizmów do środowiska oraz ewolucją molekularną.

Dr Marta Jurek

Wieloletnia pracowniczka Zakładu Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka, diagnosta laboratoryjna. Zajmuje się badaniami podłoża molekularnego chorób dziedzicznych.

Dr hab. Małgorzata Kęsik-Brodacka, prof. NIL

Zastępczyni Dyrektora ds. Naukowych w Narodowym Instytucie Leków w Warszawie. Zajmuje się molekularną analizą antygenów do konstrukcji szczepionek nowej generacji oraz wykorzystywaniem mikrobiologicznych systemów ekspresyjnych do produkcji biofarmaceutyków.

Prof. dr hab. med. Anna Latos-Bieleńska

Kierowniczka Katedry i Zakładu Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Zajmuje się epidemiologią i etiologią wad wrodzonych i rzadkich chorób genetycznych.

Dr hab. med. Beata Lipska-Ziętkiewicz, prof. GUMed

Kierowniczka Poradni Genetycznej Uniwersyteckiego Centrum Klinicznego w Gdańsku. Specjalizuje się w genetyce klinicznej i poradnictwie genetycznym chorób dziedzicznych, zwłaszcza chorób nerek.

Dr Barbara Lisowska-Grospierre

Wieloletnia dyrektorka badań naukowych francuskiego Instytutu Badań Medycznych. W Laboratorium INSERM U429 w Szpitalu Neckera w Paryżu zajmowała się genetyką molekularną pierwotnych niedoborów odporności.

Prof. dr hab. Agnieszka Łoboda

Pracuje w Zakładzie Biotechnologii Medycznej Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Interesuje się biologią komórek macierzystych, zastosowaniem terapii genowych i komórkowych oraz molekularnymi mechanizmami chorób genetycznych, np. dystrofii mięśniowej Duchenne’a.

Prof. dr hab. med. Tadeusz Mazurczak

Współorganizator i wieloletni kierownik Zakładu Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie. Specjalista genetyki klinicznej i pediatrii. Szczególnymi obszarami jego zainteresowań są diagnostyka kliniczna i poradnictwo genetyczne.

Dr hab. Michał Milewski, prof. IMiD

Pracuje w Zakładzie Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie. Zajmuje się molekularną patofizjologią chorób dziedzicznych oraz zastosowaniem analizy DNA do badań genealogicznych.

Prof. dr hab. n. med. Jacek Nowak

Kieruje Zakładem Immunogenetyki Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie. Specjalizuje się w badaniach antygenów zgodności tkankowej, HLA i KIR oraz w immunogenetycznym doborze par biorca–dawca przeszczepu szpiku. Zajmuje się również badaniem związku genów z predyspozycją i przebiegiem chorób nowotworowych oraz genetycznymi badaniami populacyjnymi.

Dr hab. n. med. Beata Nowakowska, prof. IMiD

Pracuje w Zakładzie Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie. Kieruje Zespołem Pracowni Cytogenetycznych. Specjalizuje się w cytogenetyce klasycznej i molekularnej.

Dr Mariusz Ołtarzewski

Kierownik Zakładu Badań Przesiewowych i Diagnostyki Metabolicznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie. Zajmuje się diagnostyką chorób wrodzonych u noworodków. Koordynator badań przesiewowych noworodków w Polsce.

Dr Agnieszka Orzińska

Pracuje w Zakładzie Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie. Specjalizuje się w badaniach antygenów komórek krwi oraz w nieinwazyjnej diagnostyce prenatalnej.

Dr Norman Jan Pieniążek

Wieloletni pracownik i kierownik Laboratorium Referencyjnej Diagnostyki Molekularnej Narodowego Centrum Chorób Infekcyjnych, Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom w Atlancie. Specjalizuje się w diagnostyce molekularnej chorób pasożytniczych.

Prof. dr hab. med. Jacek Józef Pietrzyk

Wieloletni Kierownik Zakładu Genetyki Medycznej i Katedry Pediatrii, Instytutu Pediatrii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Specjalista z pediatrii i genetyki klinicznej. Szczególnymi obszarami jego zainteresowań są poradnictwo genetyczne i badanie chorób kompleksowych.

Prof. dr hab. Tomasz Pniewski

Pracuje w Instytucie Genetyki Roślin PAN w Poznaniu. Przedmiotem jego zainteresowań i pracy badawczej jest zastosowanie roślinnych systemów ekspresyjnych do produkcji biofarmaceutyków.

Dr n. med. Urszula Rogalla-Ładniak

Pracuje w Katedrze Medycyny Sądowej Collegium Medicum w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Zajmuje się genetycznymi badaniami pokrewieństwa i pochodzenia biogeograficznego, a także analizą markerów haploidalnych.

Dr Sylwia Rzońca-Niewczas

Pracuje w Zakładzie Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie. Zajmuje się badaniami i diagnostyką molekularną chorób dziedzicznych. Specjalizuje się w genetyce molekularnej niepełnosprawności intelektualnej.

Prof. dr hab. Marek Safjan

W pracy naukowej w Instytucie Prawa Cywilnego Uniwersytetu Warszawskiego zajmował się prawem cywilnym i medycznym. Prezes Trybunału Konstytucyjnego w latach 1998–2006. Obecnie sędzia Europejskiego Trybunału Sprawiedliwości.

Prof. dr hab. med. Maria Sąsiadek

Kieruje Katedrą i Zakładem Genetyki Uniwersytetu Medycznego oraz Poradnią Genetyczną Fundacji Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu. Jej głównym obecnie obszarem zainteresowań jest genetyka nowotworów.

Dr hab. Elżbieta Sarnowska

Kieruje Zakładem Immunoterapii Eksperymentalnej w Narodowym Instytucie Onkologii im. Marii Skłodowskiej-Curie – Państwowym Instytucie Badawczym w Warszawie. Specjalizuje się w biologii molekularnej nowotworów, a obecnie jej obszar zainteresowań i pracy to immunologia nowotworów i immunoterapia eksperymentalna.

Prof. dr hab. n. farm. Małgorzata Schlegel-Zawadzka

Swoje zainteresowania związane z aspektami żywieniowymi osób zdrowych i chorych realizowała w Wydziale Nauk o Zdrowiu Collegium Medicum UJ. Interesuje się aspektami kulturowymi odżywiania i jego wpływu na nasz stan zdrowia.

Prof. dr hab. Janusz A. Siedlecki

Wieloletni Kierownik Zakładu Onkologii Molekularnej i Translacyjnej w Narodowym Instytucie Onkologii im. Marii Skłodowskiej-Curie – Państwowym Instytucie Badawczym. Specjalizuje się w poszukiwaniu nowych markerów molekularnych i ich wdrażaniu do diagnostyki molekularnej chorób nowotworowych.

Dr hab. Paweł Siedlecki

Prowadzi samodzielną pracownię Cheminformatyki i Modelowania Molekularnego w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie. Jest autorem publikacji z zakresu bioinformatyki, projektowania leków oraz uczenia maszynowego. Wykładał m.in. na Uniwersytecie Warszawskim, Uniwersytecie im. Adama Mickiewicza w Poznaniu oraz University of Manchester.

Prof. dr hab. Katarzyna Tońska

Pracuje w Instytucie Genetyki i Biotechnologii Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego. Zajmuje się podłożem molekularnym i epidemiologią chorób mitochondrialnych oraz zmiennością mitochondrialnego DNA.

Prof. dr hab. med. Anna Tylki-Szymańska

Pracuje w Klinice Pediatrii Żywienia i Chorób Metabolicznych Instytutu „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka” w Warszawie. Zajmuje się diagnostyką i leczeniem osób z chorobami metabolicznymi.

Dr Paweł Urbanowicz

Pracuje w Zakładzie Mikrobiologii Molekularnej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie. Zajmuje się epidemiologią zakażeń szpitalnych z zastosowaniem metod molekularnych i genomicznych.

Dr Joanna Wiszniewska

Specjalistka z zakresu patologii i diagnostyki molekularnej chorób genetycznych w Oregon Health and Sciences University w Portland, USA.

Dr hab. Wojciech Wiszniewski, prof. IMiD

Pracuje w Zakładzie Genetyki Molekularnej i Medycznej, Oregon Health and Sciences University w Portland, USA. Jego zainteresowania badawcze obejmują różne aspekty genetyki klinicznej i diagnostyki molekularnej.

Prof. dr hab. Ewa Ziętkiewicz

Pracuje w Instytucie Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu. Specjalizuje się w zagadnieniach genetyki populacyjnej, epidemiologii genetycznej chorób rzadkich i molekularnych mechanizmach ewolucji Homo sapiens.

1 Zakres zastosowań diagnostyki molekularnej w medycynie Jerzy Bal, Tadeusz Mazurczak

Poznanie informacji genetycznej człowieka (sekwencji nukleotydowej całego genomu) radykalnie zmienia spojrzenie na medycynę. Przypominając Anatomię człowieka Andreasa Vaseliusa z 1543 r., która odegrała ważną rolę w rozwoju medycyny, McKusick proponował dla badania struktury i zmian w genomie wprowadzenie określenia „anatomia genomu”. Konsekwentnie porównywanie genomów to „anatomia porównawcza i rozwojowa”, badanie ekspresji genów to „anatomia czynnościowa i patologiczna”. Nie przesądzając o trafności proponowanej terminologii, należy stwierdzić, że nie ulega wątpliwości, iż współczesna medycyna jest postrzegana jako molekularna. Wcześniejsze i dokładniejsze rozpoznawanie chorób, postęp w leczeniu, nowe możliwości rokowania rozwoju choroby i profilaktyka to praktyka współczesnej medycyny.

Klasyczne badania cytogenetyczne są z powodzeniem wykonywane w laboratoriach diagnostycznych od początku lat sześćdziesiątych XX wieku. Przełomowi lat siedemdziesiątych i osiemdziesiątych zeszłego stulecia towarzyszyło stopniowe wprowadzenie technik analizy DNA. Formalne zakończenie, na początku XXI wieku, programu sekwencjonowania genomu człowieka zaowocowało skokowym wzrostem wiedzy o nim, jak też pokonywaniem kolejnych barier metodycznych oraz istotnym przyspieszeniem badań nad wykorzystaniem metod biologii molekularnej w diagnostyce medycznej. Dzięki nowym technologiom zarówno badania, jak i diagnostyka molekularna ulegają kolejnym przeobrażeniom. Wprowadzenie mikromacierzy umożliwiło nie tylko zwiększenie liczby analiz, lecz także, jak w przypadku porównawczej hybrydyzacji genomowej, identyfikację delecji czy duplikacji o wielkości nawet kilku kpz, co w klasycznej cytogenetyce było nieosiągalne. W jednym eksperymencie w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu DNA można obecnie identyfikować markery w całym genomie czy analizować ekspresję równocześnie setek genów. W tych jednak przypadkach wydaje się, że ilość uzyskiwanych informacji jeszcze znacznie przewyższa możliwości ich wykorzystania, zarówno w świetle obróbki informatycznej, jak i wiedzy, którą obecnie dysponujemy.

Rozwój metod analizy genomu towarzyszący postępowi medycyny molekularnej powoduje, że coraz powszechniej znajdują one zastosowanie w diagnostyce rutynowej. W klasycznym badaniu cytogenetycznym oceniana jest morfologia chromosomów. Analiza molekularna – analiza kwasów nukleinowych – umożliwia badanie sekwencji nukleotydów cząsteczki DNA czy RNA. Nowe technologie powoli zacierają te różnice, a tradycyjny podział traci na aktualności.

Zwiększający się zakres badań molekularnych w medycynie łączył się jednak przede wszystkim z zaadaptowaniem do celów diagnostyki laboratoryjnej techniki PCR – enzymatycznego powielania fragmentów DNA. Dzięki temu uległy zwiększeniu czułość i specyficzność badań. Zaowocowało to, obok genetyki medycznej, licznymi zastosowaniami w analizie mikrośladów biologicznych, ale również w badaniu np. wymarłych gatunków zwierząt czy roślin. Obecność DNA wykryto metodą PCR np. w liczących około 135 milionów lat okazach owadów zatopionych w bursztynie czy liczących 5–7 tys. lat zmumifikowanych zwłokach faraonów. Znaczącym wynikiem tego typu badań, który zapewne na stałe znajdzie miejsce w historii genetyki człowieka, było wykazanie przyczyny śmierci dziecka, którego szczątki, liczące kilka tysięcy lat, odkopano w Izraelu. Wykazano, że prawdopodobną przyczyną śmierci była β-talasemia.

Wprowadzenie do diagnostyki medycznej techniki PCR uprościło procedury badawcze, umożliwiając ich automatyzację i wytworzenie wielu rodzajów ogólnie dostępnych testów. W znaczącym stopniu przyczyniło się również do poszerzenia zakresu zadań stawianych przed genetyką medyczną. W 1995 r. zidentyfikowano niespełna 60 genów, w tym ważne skądinąd geny, których defekty są odpowiedzialne za wystąpienie zespołu Aperta i zespołu Cruzona (receptor 2 czynnika wzrostu fibroblastów), zespołu Sanfillipo A, zespołu Blooma, zespołu Werdniga-Hoffmanna, raka sutka czy choroby Alzheimera (presenilina 1 i presenilina 2). W 2003 r. poinformowano o zsekwencjonowaniu całego genomu jądrowego człowieka i poznaniu jego wszystkich 25 tys. genów struktury. Można więc domniemywać, że mamy w rękach informacje o wszystkich chorobach genetycznie uwarunkowanych[1]. Do poznania podłoża molekularnego znanych chorób genetycznie uwarunkowanych jednak jeszcze daleka droga. Zbadanie ekspresji poszczególnych genów i określenie związku między defektem w DNA a występowaniem zmian fenotypowych czy też odwrotnie wymaga wielu lat badań. Ponadto należy pamiętać, że ustalenie takich zależności jest stosunkowo łatwe w przypadku chorób dziedziczących się jako cecha monogenowa. Określenia współzależności dla chorób warunkowanych przez wiele genów, jak i rozwoju samej genetyki medycznej należy oczekiwać od nowych technologii i programów bioinformatycznych czy wręcz metod sztucznej inteligencji dopiero wkraczających do biologii.

Ciągle poszerza się zakres zastosowań biologii molekularnej w medycynie (tab. 1.1). Na szczególne podkreślenie zasługuje wzrastające znaczenie cytogenetyki i analizy molekularnej w onkologii. Zgromadzone wyniki umożliwiają wczesne rozpoznanie obecności komórek nowotworowych, określenie przebiegu choroby, a w wielu przypadkach wybranie rodzaju terapii, np. immunoterapii. Analiza molekularna genów zgodności tkankowej jest badaniem nieodłącznie związanym z transplantologią. Nowe metody badawcze umożliwiają też niezwykle precyzyjne prześledzenie pokrewieństwa wśród członków badanej rodziny w sytuacji czy to spornego ojcostwa, czy identyfikacji mikrośladów. Szczególną rolę i znaczenie metody biologii molekularnej odgrywają w diagnostyce chorób infekcyjnych, inwazyjnych i pasożytniczych. W tym przypadku wyjątkowo duży postęp dokonał się w diagnostyce wolno rosnących lub trudnych do hodowli patogenów. Dzięki możliwości analizy bakteryjnego rybosomowego RNA (rRNA) czułość stosowanych technik zwiększyła się przeszło 1000 razy. Dostępne handlowo zestawy diagnostyczne umożliwiają identyfikację określonych patogenów (np. Mycoplasma pneumoniae) w materiale biologicznym, przy czym badanie trwa około 2 godziny.

Tabela 1.1. Zakres zastosowań badań i diagnostyki molekularnej w medycynie

Specjalności

Zastosowanie

Zasadniczo wszystkie specjalności medyczne ze szczególnym uwzględnieniem

• genetyki klinicznej

• onkologii

• wirusologii

• bakteriologii

• farmakogenetyki

• nutrigenetyki

• transplantologii

• epidemiologii

• medycyny sądowej

• diagnostyka

• patologia molekularna

• badania przesiewowe

• badania prognostyczne

• monitorowanie terapii

• immunoterapia

• terapia genowa

• ustalanie pokrewieństwa

• badanie śladów biologicznych

Biotechnologia

• biofarmaceutyki

• szczepionki

Identyfikacja genów, których defekty są odpowiedzialne za choroby uwarunkowane genetycznie, oraz rozwój metod analizy kwasów nukleinowych stanowią również podstawę do wprowadzania nowych typów leczenia w medycynie. Wynikom pierwszych prób klinicznych terapii genowej wybranych chorób dziedzicznych i nowotworowych towarzyszy ostrożny optymizm. Nowym impulsem stało się wykorzystanie w eksperymentalnej terapii genowej systemu redagowania DNA. U pacjentów z amyloidazą wrodzoną patologia molekularna jest związana z nadekspresją genu TTR. Przy zastosowaniu metody CRISPR/Cas9 udało się skutecznie zablokować wadliwą postać genu, co skutkowało obniżeniem poziomu defektywnego białka. Innym przykładem jest terapia wrodzonej ślepoty Lebera (LCA) powodowanej mutacją genu CEP290. Podając zmodfikowany RNA i przy zastosowaniu metody CRISPR/Cas9, osiągnięto zwiększoną prawidłową ekspresję genu CEP290, co przełożyło się na poprawę widzenia u pacjentów poddanych tej terapii.

Nadzieje pokładane zarówno przez badaczy, jak i chorych w nowych koncepcjach leczenia były i nadal są ogromne. Jest to tym bardziej zrozumiałe, że dotychczas stosowane metody terapii charakteryzowały się brakiem skuteczności lub małą skutecznością wobec większości chorób genetycznych. Niezależnie od mnogości problemów natury biologicznej i metodycznej, które trzeba jeszcze wyjaśnić i rozwiązać, wydaje się, że w ciągu najbliższych lat terapia genowa stanie się metodą wybieraną w leczeniu wielu chorób dziedzicznych, nowotworowych oraz pewnych chorób infekcyjnych. Choć dopiero puka ona do drzwi medycyny, nie oznacza to jednak, że jesteśmy całkowicie bezradni w leczeniu chorób dziedzicznych. W tzw. chorobach metabolicznych suplementacja enzymatyczna, mimo olbrzymich jednostkowych kosztów, jest prowadzona również w Polsce.

Wraz z poszerzaniem naszej wiedzy i rozwojem narzędzi analizy genomu uczestniczymy w zmianie priorytetów, jakimi kieruje się genetyka medyczna. Obserwujemy zwiększone zainteresowanie genetycznie uwarunkowanymi chorobami cywilizacyjnymi, a wraz z tym indywidualizację medycyny. Często w odniesieniu do badań genetycznych stosuje się określenia „medycyna spersonalizowana” czy „medycyna precyzyjna”. Określenia te odnoszą się nie tylko do genetyki medycznej, lecz także – pozostając w tematyce chorób genetycznie uwarunkowanych – są postrzegane jako doskonalsza diagnostyka, identyfikacja wariantów genomowych zwiększonego ryzyka wystąpienia danej choroby i/lub odpowiedzi na lek, a także identyfikacja biomarkerów wyznaczających celowane metody terapii.

Z roku na rok przybywa przykładów celowanych metod leczenia. Od kilku lat stosowane są leki w kierunku określonych mutacji w genie CFTR zwiększające komfort życia chorych na mukowiscydozę. Nieprawidłowy podział i rozrost komórek leżą u podstaw wielu chorób nowotworowych. Często odpowiadają za to mutacje w genie EGFR kodującym receptorowy naskórkowy czynnik wzrostu. Znane jest wiele inhibitorów kinazy tyrozynowej, takich jak inhibitory czy przeciwciała monoklonalne, ale także leków kierowanych przeciwko konkretnym mutacjom w genie EGFR.

Diagnostyka genetyczna będzie obejmować identyfikację osób o zwiększonej predyspozycji do zachorowania na wiele typów nowotworów, w tym raka sutka, raka gruczołu krokowego czy czerniaka. Wykrywane są mutacje czy markery w specyficznych genach określające podatność na wystąpienie chorób cywilizacyjnych, takich jak nadciśnienie, cukrzyca czy choroby psychiczne.

Badanie osobniczych predyspozycji genetycznych najlepiej ilustrują możliwości farmako- i nutrigenetyki. Farmakogenetyka zajmuje się genetycznie uwarunkowaną zmiennością reakcji organizmu na leki. Zmienność ta, odzwierciedlając zróżnicowanie populacyjne, może mieć charakter nieoczekiwany, niepożądany, a czasami wręcz zagrażający życiu. Możliwość identyfikacji metodami molekularnymi genotypów warunkujących tego rodzaju reakcje jest już wykorzystywana w medycynie do optymalizacji farmakoterapii. Zmienność osobnicza na stopień tolerancji na składniki pokarmowe leży u podstaw nutrigenetyki. Ta stosunkowo nowa dziedzina nauki o człowieku koncentruje się na badaniu uwarunkowanej genetycznie różnorodnej tolerancji na składniki pokarmowe.

Praktycznym przejawem wykorzystania metod biologii molekularnej w rutynowej diagnostyce medycznej jest powszechny dostępnych do kilku tysięcy testów genetycznych, chociaż – jak się wydaje – metody analizy genomowej (mikromacierze, wysokoprzepustowe sekwencjonowanie DNA) zastąpią testy nakierowane na poszczególne mutacje czy określone choroby genetycznie uwarunkowane. Inaczej mówiąc, od testów genetycznych nacelowanych na pojedynczy gen przechodzimy do testów genomowych obejmujące jednoczesną analizę wielu genów. To niewątpliwie różnica ilościowa, ale warto podkreślić, że w obu metodach rozdzielczość jest notowana na poziomie jednego nukleotydu, choć w przypadku metod wieloprzepustowych nowe spodziewane oprogramowanie powinno przynieść większą czułość analizy. Wprowadzenie do diagnostyki genetycznej metod genomowych w jeszcze większym stopniu niż dotychczas zacieśnia współpracę między biologiem molekularnym a genetykiem klinicznym. Bez niej określenie korelacji genotyp–fenotyp może nie być satysfakcjonujące dla procesu diagnostycznego.

Niewątpliwy postęp jest również obserwowany w badaniach prenatalnych dzięki wprowadzeniu analizy wolnego płodowego DNA. Analiza genetyczna nie ogranicza się, jak początkowo, jedynie do identyfikacji zmian o charakterze aberracji chromosomowych, a coraz częściej obejmuje również identyfikację mutacji punktowych w chorobach monogenowych.

Specyfiką badań naukowych z zakresu genetyki i genetyki molekularnej jest bezpośrednie przełożenie wyników badań na praktykę medyczną. Postawienie prawidłowego, zweryfikowanego molekularnie rozpoznania ma kluczowe znaczenie w postępowaniu terapeutycznym i leczeniu farmakologicznym pacjentów. Dzięki badaniom podstaw patologii chorób dziedzicznych stało się możliwe opracowanie optymalnych algorytmów diagnostycznych, co ma znaczenie zarówno dla poradnictwa genetycznego, jak i wspomnianych wcześniej terapii spersonalizowanej, a docelowo terapii genowej. W literaturze angielskojęzycznej często spotyka się skróty odpowiadające hasłom czy poruszanym tematom. Jak się wydaje skrót G2P (ang. genom to people) bardzo dobrze oddaje charakter badań genetycznych i ich przeznaczenie.

Choroby genetycznie uwarunkowane, choć nie należą do najczęściej występujących, charakteryzuje znaczące oddziaływanie społeczne, określające również status zaawansowania rozwojowego danego kraju. Osiągnięcia biologii molekularnej i możliwości manipulacji genetycznych rodzą jednak problemy społeczne, etyczne i prawne, które towarzyszą poznawaniu i „wglądowi” w ludzki DNA. Wiele wątpliwości reguluje kodeks lekarski. Ponieważ jednak w molekularną diagnostykę kliniczną zaangażowani są również specjaliści z dziedzin pozamedycznych, tworzone nowe normy prawne powinny rozwiązywać możliwie wszystkie niejasności istniejące na tym polu. Dotyczy to warunków i kryteriów kwalifikacji osób do badań molekularnych (warunek świadomej zgody) oraz sposobu przechowywania informacji i dostępności do danych uzyskanych w wyniku analizy DNA. Wydaje się, że poza określonymi prawnie wyjątkami tylko osobom najbardziej zainteresowanym, a więc chorym lub zagrożonym wystąpieniem schorzenia, powinno przysługiwać prawo do uzyskania informacji na ten temat. Ujawnienie ich szerszemu gronu może bowiem naruszać prawa jednostki lub grupy osób.

Wprowadzenie metod analizy molekularnej do diagnostyki medycznej sprawia, że umiejętność „myślenia genetycznego” jest jednym z zasadniczych elementów edukacji współczesnego lekarza. Znajomość podstaw genetyki medycznej, w tym cytogenetyki i genetyki molekularnej, staje się niezbędna dla racjonalnego, odpowiadającego poziomowi współczesnej wiedzy i możliwościom, planowania badań diagnostycznych, właściwej interpretacji uzyskanych wyników oraz indywidualizacji leczenia.

Piśmiennictwo uzupełniające

Ashley E.A. (2016), Towards precision medicine, Nature Reviews Genetics 17, 507–522.

Domaradzki J. (2015), DNA jako kod kulturowy, Kultura Popularna 2(44), 44–68.

Strachan T., Read A.P. (2018), Human molecular genetics, wyd. 5, Garland Sciences, New York.

Mazurczak T. (red., 2003), Zastosowania biologii w medycynie a godność osoby ludzkiej. Aspekty etyczne i prawne, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.

2 Podstawy genetyki i genomiki Jerzy Bal, Ewa Bocian

2.1. Podstawy genetyki molekularnej

2.1.1. Kwas deoksyrybonukleinowy i jego replikacja

Podstawową jednostką organizacji DNA jest nukleotyd. Zbudowany jest on z trzech elementów: cukru, zasady azotowej (adeniny, guaniny, cytozyny lub tyminy) oraz reszty kwasu fosforowego. Składnikiem cukrowym jest pięciowęglowa deoksyryboza. Cukier ten, łącząc się z zasadą, tworzy nukleozyd. W zależności od zasady wchodzącej w jego skład, nukleozyd z przyłączoną resztą fosforanową to jeden z czterech nukleotydów: A, G, C lub T. Nukleotydy, łącząc się ze sobą, tworzą łańcuchy. DNA jest więc wielkocząsteczkowym polimerem deoksyrybonukleotydów.

Model struktury kwasu deoksyrybonukleinowego został zaproponowany przez Watsona i Cricka w 1953 r. Zgodnie z nim cząsteczka DNA składa się z dwóch przeciwbieżnych łańcuchów nukleotydowych skręconych wokół siebie. Orientację łańcuchów ułatwia to, że reszta fosforanowa łącząca nukleozydy przyłącza się do węgla 3´ jednego cukru i 5´ sąsiedniego. Łańcuchy zorientowane są więc: jeden od końca 5´ do 3´, a drugi od końca 3´ do 5´. Konstrukcja tej helisy utrzymywana jest między innymi dzięki tworzeniu się między zasadami obu łańcuchów wiązań wodorowych. Szkielet stanowią składniki cukrowo-fosforanowe, a zasady usytuowane są w środku cząsteczki. Układ zasad w jednym łańcuchu determinuje ich układ w drugim w myśl reguły, że adenina łączy się zawsze z tyminą, a cytozyna – z guaniną. Łańcuchy w tak zbudowanej cząsteczce DNA określa się jako komplementarne (ryc. 2.1). Różnice między cząsteczkami DNA pochodzącymi z odmiennych organizmów dotyczą topologii cząsteczki, sekwencji nukleotydów i długości łańcucha. W zależności od organizmu liczba nukleotydów w jednej cząsteczce DNA wynosi od 10⁵ do 10¹¹ (ryc. 2.2). Wzajemne zależności nukleotydów w DNA określa się stosunkiem A + T/G + C. Jest to wielkość charakterystyczna i stała dla DNA każdego organizmu.

Replikacja DNA jest procesem, który poprzedza podział komórki. W jej wyniku powstają kopie macierzystego DNA rozdzielane następnie do komórek potomnych. Odwzorowaniu podlega osobno każda z nici DNA. Replikacja jest katalizowana przez skomplikowany kompleks enzymatyczny, zawierający enzymy rozplatające helisę DNA (helikazy DNA), białka stabilizujące jednoniciowy DNA oraz co najmniej trzy różne polimerazy DNA. Te ostatnie enzymy powodują polikondensację deoksyrybonukleotydów na matrycy, którą są obie nici rodzicielskiego DNA. W wyniku replikacji prowadzonej zgodnie z zasadą komplementarności powstają więc dwie identyczne cząsteczki dwuniciowego DNA, z których każda zawiera nić starą (rodzicielską) i nić nową. Taki typ replikacji jest określany jako semikonserwatywny (ryc. 2.3).

Rycina 2.1. Budowa podwójnej helisy DNA

Rycina 2.2. Wielkość genomów różnych organizmów

Rycina 2.3. Model semikonserwatywnej replikacji DNA. W każdej rundzie replikacyjnej, poprzedzającej podział komórki, obie nici są wykorzystywane jako matryce do syntezy komplementarnego łańcucha. Powstająca w ten sposób podwójna helisa składa się zawsze z łańcucha starego i nowego, a przekazywany zapis informacji genetycznej nie ulega zmianie

W organizmach eukariotycznych replikacja zachodzi z szybkością około 50 nukleotydów na sekundę. Jej swoistość jest przy tym bardzo duża. Jeden błąd zdarza się przeciętnie raz na 106 nowo wstawianych nukleotydów. Ewentualne błędy mogą być naprawiane już w czasie trwania replikacji przez same polimerazy DNA lub też przez specjalne wieloenzymatyczne systemy naprawcze. Większość pozostałych uszkodzeń jest naprawiana przed kolejną rundą replikacji DNA. Konsekwencją nienaprawionych błędów są mutacje prowadzące do zmiany w sekwencji DNA. Zmiany te są utrwalane w następnych rundach replikacyjnych.

2.1.2. Odczytywanie informacji genetycznej

W DNA, w jego sekwencji nukleotydów, jest zakodowana informacja o strukturze i rodzaju białek, różnych klasach RNA oraz o właściwościach regulacyjnych genów. Odczytywanie informacji dotyczącej białek odbywa się w dwóch etapach. W pierwszym, zwanym transkrypcją, po rozpleceniu helisy jednoniciowe fragmenty DNA są przepisywane na cząsteczki informacyjnego RNA (ang. messenger RNA, mRNA). W drugim etapie, translacji, sekwencje nukleotydowe mRNA zostają przetłumaczone na sekwencje aminokwasów. W procesie translacji jest niezbędny udział transferowych kwasów nukleinowych (tRNA) oraz rybosomów.

RNA, podobnie jak DNA, jest polimerem nukleotydów. Różnice w stosunku do DNA polegają na tym, że ryboza zastępuje deoksyrybozę, a uracyl (U) zastępuje tyminę (T). RNA występuje przeważnie w formie jednoniciowej. Przestrzennie jest to cząsteczka bardzo pofałdowana; choć w zasadzie nie tworzy długich struktur dwuniciowych, komplementarne fragmenty nici mogą się ze sobą łączyć.

W organizmach eukariotycznych synteza RNA odbywa się w obrębie jądra komórkowego. Transkrypcji genów kodujących białka dokonuje specyficzna polimeraza RNA, której w jądrze komórkowym jest około 40 tys. cząsteczek. Łańcuch RNA jest syntetyzowany z rybonukleotydów na matrycy, którą jest rozpleciony jednoniciowy fragment cząsteczki DNA. Naprzeciwko znajdujących się w DNA deoksyrybonukleotydów G, C, T, A, zgodnie z zasadą komplementacji, w nici RNA są wstawiane odpowiednio rybonukleotydy: C, G, A i U.

U organizmów eukariotycznych tylko w nielicznych przypadkach obserwuje się prostą zależność między sekwencją genu kodującego białko a sekwencją transkryptu. Sekwencja nukleotydów pierwotnego transkryptu (pre-mRNA) może być bowiem zmieniana w procesie dojrzewania RNA. Proces ten jest wieloetapowy i obejmuje różne typy modyfikacji transkryptu, składanie genów i niekiedy końcowe redagowanie transkryptu.

W etapie modyfikacji zmianom ulegają oba końce transkryptu (ryc. 2.4). Do końca 5’ zostaje przyłączona 7-metyloguanozyna, tzw. czapeczka, a do końca 3´, w większości znanych transkryptów (wyjątkiem są transkrypty genów kodujących białka histonowe), ogon złożony z poli(A). Rolą czapeczki jest zabezpieczenie transkryptu przed atakiem enzymów nukleolitycznych, ułatwianie transportu transkryptu z jądra do cytoplazmy. Czapeczka odgrywa również rolę w procesie wycinania intronów oraz w inicjacji translacji. Modyfikacja końców decyduje o stabilności i trwałości transkryptu. Usunięcie czapeczki, a także stopniowe odcinanie ogona poli(A) redukuje trwałość mRNA. Niekodująca część może nieść w sobie informacje o tkankowo specyficznej trwałości transkryptu. Modyfikacje końców zachodzą w jądrze komórkowym i odbywają się mniej więcej w tym samym czasie.

W przypadku genów kodujących białka w procesie składania transkryptu (ang. splicing) z pre-mRNA są wycinane fragmenty zwane intronami. Pozostałe fragmenty – eksony – są łączone ze sobą, a powstały w ten sposób mRNA zawiera ciągłą informację o strukturze peptydu, chociaż nie wszystkie eksony ulegają translacji.

Znanych jest kilka mechanizmów składania genów. Samowycinanie obserwuje się między innymi w genach mitochondrialnych. W jądrowych genach kodujących białka u Eukaryota w mechanizmie składania genów bierze udział wiele białek oraz specjalne klasy małych jądrowych RNA, zwanych snRNA. Odszukanie miejsca cięcia cząsteczki RNA jest ułatwione przez zachowanie na wszystkich stykach intron/ekson/intron takich samych lub bardzo podobnych sekwencji nukleotydów. Z reguły każdy intron zaczyna się od sekwencji GT, a kończy AG. Proces wycinania intronów jest niezwykle precyzyjny. Pominięcie lub zamiana nawet jednego nukleotydu w charakterystycznej sekwencji na styku intron/ekson czy ekson/intron jest równoznaczna z mutacją. Rolę we właściwym procesie wycinania przypisuje się tzw. miejscu rozgałęzienia (ang. branch site) znajdującemu się blisko końca każdego intronu.

Introny są różnej długości „wstawkami” w sekwencji genu. W liczącym np. 18 kpz genie pro-α-1 kolagenu znajduje się 50 różnej długości intronów. Stanowią one niekiedy znaczną część samego genu. Ponad 65% sekwencji genu insuliny to sekwencje intronowe. W genie kodującym polimerazę DNA introny stanowią 95% sekwencji genu. W genie CFTR jest ich 97,6%, a w genie DMD aż 99,4%. Introny, po wycięciu, mogą ulec degradacji albo po odpowiedniej obróbce być źródłem niekodujących regulatorowych cząsteczek RNA.

Rycina 2.4. Schemat ekspresji genu eukariotycznego kodującego białko

Dotychczas nie ma pełnej odpowiedzi na pytanie dotyczące funkcji sekwencji intronowych, a także tego, kiedy pojawiły się w trakcie ewolucji. Obecność intronów, ich wycinanie, wykorzystywanie alternatywnych miejsc składania genu oraz procesy tasowania czy duplikacji to mechanizmy, które obok powstawania mutacji sprzyjają tworzeniu się różnorodności molekularnej i powiększaniu zasobu informacji genetycznej.

Transkrypt, który nie przeszedł modyfikacji i obróbki, nie jest zdolny do przemieszczenia się z jądra do cytoplazmy, gdzie odbywa się właściwe odczytanie zawartej w nim informacji genetycznej. Liczba transkryptów kodujących białka (ulegających ekspresji) stanowi jedynie niewielki procent transkryptomu. O funkcji regulatorowego RNA, szczególnie małych RNA, takich jak miRNA czy sRNA, wiemy coraz więcej, ale – jak się wydaje – wciąż jesteśmy na początku drogi.

Na modyfikacji i obróbce transkryptu nie kończy się proces dojrzewania mRNA. Transkrypt może bowiem podlegać jeszcze redagowaniu. Proces ten został po raz pierwszy opisany dla transkryptów mitochondrialnych świdrowców, ale występuje również u roślin i zwierząt, w tym u człowieka. Wydaje się obecnie, że może on dotyczyć większej liczby transkryptów, niż wcześniej myślano. W czasie redagowania transkrypt wzbogaca się o poszczególne nukleotydy lub traci je. Proces ten zachodzi stopniowo od końca 3´ do 5´ i obejmuje różne części transkryptu. W wyniku redagowania mogą powstać nowe otwarte ramki odczytu, nowe miejsca startu translacji czy też sekwencje określające miejsce wycinania intronu. U świdrowców informacji niezbędnej do redagowania dostarczają krótkie, kilkudziesięcionukleotydowe tzw. naprowadzające RNA (ang. guide RNA, gRNA). Przypuszczalnie cząsteczki gRNA, stanowiąc matrycę, zgodnie z którą dokonuje się redagowanie transkryptu, współuczestniczą też w samym procesie enzymatycznej wymiany nukleotydów. Redagowanie mRNA jest jednym z mechanizmów regulacji ekspresji genów. Ponieważ proces ten zmienia się wraz ze stadium rozwoju czy z wiekiem, stopniowa utrata zdolności redagowania może być jedną z oznak starzenia się organizmu.

Cząsteczki kwasów nukleinowych i białek są złożone z jednostek uszeregowanych w łańcuchy. W przypadku DNA i RNA jednostkami tymi są nukleotydy, a w przypadku białek – aminokwasy. Istotą kodu genetycznego jest to, że sekwencja nukleotydów określa rodzaj i kolejność aminokwasów w białkach. Kod genetyczny jest taki sam dla wszystkich organizmów żyjących na Ziemi.

Informacja genetyczna jest cechą charakterystyczną danego organizmu i jest zawarta w DNA, dokładniej w nici kodującej. Do wyjątków należą jedynie niektóre typy wirusów przechowujące swoją informację genetyczną w RNA. W dalszym ciągu tego rozdziału sekwencje nukleotydów będą podawane zgodnie z tymi, jakie występują w RNA.

Informacja genetyczna jest zapisana w postaci trójek nukleotydów stanowiących podstawową jednostkę zwaną kodonem. Ponieważ cząsteczka kwasu nukleinowego jest polimerem czterech różnych nukleotydów, to liczba możliwych trypletów (kodonów) wynosi 64 (4³). Spośród 20 aminokwasów wchodzących w skład białek większość jest więc kodowana przez więcej niż jeden tryplet. O takim kodzie mówi się, że jest zdegenerowany. Trzy spośród 64 trypletów: UAA, UAG i UGA nie kodują żadnego aminokwasu i sygnalizują koniec syntezy polipeptydu. Określane są one jako kodony stop lub nonsens.

Wśród trypletów należy wyróżnić trójkę AUG kodującą zwykle metioninę. Stanowi ona zazwyczaj początek zapisu informacji dla każdego białka. Właściwe jej rozpoznanie przez aparat translacyjny warunkuje prawidłowe odczytanie następujących po niej trypletów. Początkowy kodon AUG wyznacza więc trójkową ramkę odczytu (ang. open reading frame, ORF). Przesunięcie fazy w ramce o jeden lub dwa nukleotydy, np. w wyniku mutacji, prowadzi do zmiany sensu zapisu i powstania polipeptydu odmiennego niż pierwotnie kodowany (ryc. 2.5).

Rycina 2.5. Różne możliwości odczytu tej samej sekwencji nukleotydów. Informacja zawarta w RNA jest odczytywana od końca 5´ do końca 3´ w postaci kodonów złożonych z trzech kolejnych nukleotydów. Rodzaj nukleotydów wchodzących w skład kodonu wyznacza określony aminokwas. Przesunięcie ramki odczytu kolejno o jeden nukleotyd prowadzi do otrzymania polipeptydów różniących się całkowicie składem aminokwasów, a często do przedwczesnej terminacji translacji

Właściwe rozszyfrowanie kodu genetycznego następuje w procesie translacji. Obok mRNA biorą w tym udział także cząsteczki tRNA i rybosomy. Cząsteczki tRNA odgrywają rolę klucza umożliwiającego rozszyfrowanie kodu zawartego w strukturze mRNA. Rybosomy są organellami komórkowymi zbudowanymi z białek i rybosomowego RNA (rRNA). W strukturze tej jest katalizowany proces biosyntezy białek (tab. 2.1).

Tabela 2.1. Budowa rybosomu eukariotycznego

Białka

Podjednostka duża

Podjednostka mała

Masa cząsteczkowa (w daltonach)

28 000 000 (60S)

1 400 000 (40S)

Liczba

ok. 49

ok. 33

rRNA

Masa cząsteczkowa

5S

28S

5,8S

18S

Liczba nukleotydów

120

4700

160

1900

Ocenia się, że do prawidłowego przeprowadzenia procesu biosyntezy białek komórka eukariotyczna w czasie swojego życia musi wytworzyć około 10 milionów rybosomów. Zadanie to jest o tyle ułatwione, że w genomie człowieka znajduje się około 200 kopii genów kodujących rRNA. Geny te są zgrupowane w blokach w krótkich ramionach chromosomów 13, 14, 15, 21 i 22.

Synteza rRNA odbywa się w obrębie jąderka, wydzielonej struktury jądra komórkowego, do której wypętlają się fragmenty chromosomów kodujących zblokowane geny rRNA. W procesie syntezy rRNA, a następnie formowania się rybosomu uczestniczą inne specyficzne cząsteczki RNA – snRNA (ang. small nucleolus RNA). Przyjmuje się, że ułatwiają one przyjęcie przez rRNA odpowiedniej struktury przestrzennej i stopniowe obudowywanie jej białkami rybosomowymi.

Tworzenie łańcucha polipeptydowego odbywa się na rybosomie. Funkcja cząsteczek tRNA polega na odczytywaniu kodonów z mRNA oraz dostarczaniu aminokwasów odpowiednich dla tworzącego się polipeptydu. Odczytywanie sekwencji nukleotydów w mRNA jest rolą jednej z pętli cząsteczki tRNA. Wśród siedmiu nukleotydów wchodzących w jej skład trzy stanowią tak zwany antykodon. Sekwencja antykodonu jest komplementarna do trójki nukleotydów tworzącej kodon w mRNA.

Proces syntezy łańcucha polipeptydowego można podzielić na trzy etapy: inicjację, elongację i terminację. W czasie inicjacji dochodzi do stopniowego uformowania się kompleksu mRNA–rybosom–inicjatorowy tRNA. Inicjatorowym tRNA jest specyficzna cząsteczka przenosząca metioninę, której antykodon rozpoznaje na mRNA początkową trójkę AUG. Właściwa budowa i wydłużanie łańcucha polipeptydowego następuje w procesie elongacji. Aminokwasy dostarczane przez odpowiedni tRNA są dodawane jeden po drugim zgodnie z informacją wyznaczoną przez kolejne kodony w mRNA. Wiązanie peptydowe między aminokwasami powstaje z udziałem enzymu – transferazy peptydylowej, której katalitycznym komponentem jest rRNA. Proces elongacji powtarza się cyklicznie, a powstający polipeptyd się wydłuża. Sygnałem dla terminacji translacji jest sekwencja zasad zawierająca jeden lub kilka kodonów nonsens. Jak wspomniano wyżej, translacja rozpoczyna się zazwyczaj od trójki AUG kodującej metioninę. Nie oznacza to jednak, że wszystkie białka rozpoczynają się od tego aminokwasu, jest on bowiem zazwyczaj usuwany.

Chociaż proces odczytywania mRNA charakteryzuje się dużą specyficznością, zdarzają się jednak błędy. Szacuje się, że na skutek mutacji powstałych w genach kodujących tRNA i białka rybosomowe jeden na 1000 do 10 tys. aminokwasów jest podstawiony błędnie. Podczas lawinowego wręcz wytwarzania białek, odbywającego się równocześnie na wielu rybosomach, nie ma to istotnego znaczenia. Na przykład w organizmie człowieka w ciągu sekundy jest wytwarzanych 5 × 10¹⁴ kopii hemoglobiny, białka składającego się z 574 aminokwasów.

Różnice w strukturze białek i RNA biorących udział w procesach transkrypcji i translacji u Prokaryota i Eukaryota są przyczyną różnic między innymi we wrażliwości na antybiotyki. Znalazło to szerokie zastosowanie w biologii i medycynie (tab. 2.2), umożliwia bowiem wybiórcze hamowanie rozwoju jednych organizmów bez ingerencji w rozwój drugich.

Tabela 2.2. Inhibitory hamujące transkrypcję lub translację

Nazwa inhibitora

Zakres działania

Miejsce działania

Prokaryota

Eukaryota

Tetracyklina

+

blokuje wiązanie naładowanego tRNA do miejsca A na rybosomie

Streptomycyna

+

hamuje inicjację syntezy białka

Chloramfenikol

+

blokuje transferazę peptydylową

Erytromycyna

+

blokuje przesuwanie się rybosomu po matrycy

Ryfampicyna

+

blokuje inicjację transkrypcji

Cykloheksamid

+

blokuje transferazę peptydylową

α-Amanityna

+

blokuje syntezę mRNA

Puromycyna

+

+

prowadzi do przedwczesnej terminacji polipeptydu

Aktynomycyna D

+

+

wiążąc się do DNA, blokuje ruch polimerazy RNA

Wyjaśnienie mechanizmu transkrypcji stwarza nowe możliwości specyficznej ingerencji w proces jej regulacji. Poznanie białek uczestniczących w procesie transkrypcji określonych genów to nadzieja na produkcję nowej generacji leków do walki z nowotworami, chorobami serca, układu odpornościowego, a także infekcjami wirusowymi.

2.1.3. Regulacja ekspresji

Regulacja ekspresji, regulacja działania genów i ich produktów zachodzi w komórce zarówno na poziomie DNA, RNA, jak i białka. U Prokaryota system inicjacji transkrypcji obejmuje zasadniczo jeden fragment genu, położony w sąsiedztwie części kodującej, nazywany promotorem. Polimeraza RNA wiąże się do DNA i rozpoczyna transkrypcję od promotora, a regulacja działania genu – liczba powstających transkryptów – jest funkcją liczby przyłączanych do niego cząsteczek polimerazy. Polimeraza rozpoznaje sekwencje promotorowe genu dzięki podjednostce „sigma”.

Eukariotyczny promotor składa się z kilku części regulatorowych. Miejsce startu transkrypcji poprzedza promotor rdzeniowy pełniący funckję podobną do promotora bakteryjnego. W obrębie części rdzeniowej występuje najczęściej sekwencja bogata w pary AT (TATA-box) oraz sekwencja CAAT (CAAT-box). Inne sekwencje regulacyjne są umiejscowione poza rdzeniem promotora. Należą do nich: wzmacniacze (ang. enhancers) i wyciszacze (ang. silencers). Regiony regulacyjne mogą być położone w znacznej odległości, niekiedy nawet kilku tysięcy nukleotydów, od części kodującej genu. Rozpoczęcie procesu transkrypcji, jego szybkość i czas trwania są regulowane przez białkowe czynniki transkrypcyjne przyłączające
się do sekwencji regulatorowych. U Eukaryota sekwencja promotora nie jest bezpośrednio rozpoznawana przez polimerazę, lecz przez wspomniane czynniki transkrypcyjne. Zapoczątkowywany jest w ten sposób kompleks transkrypcyjny, który obok polimerazy RNA składa się z około 50 białek. Znajdują się w nim białka rozpoznające sekwencję TATA, specyficzne aktywatory, represory spowalniające transkrypcję itp. Eukariotyczna „sigma” jest więc kompleksem białkowym.

Opisanemu systemowi regulacji transkrypcji nie podlega pewna klasa genów, zwanych genami metabolizmu podstawowego (ang. housekeeping genes), których produkty są niezbędne do ciągłego przebiegu procesów życiowych komórki. W genach tych polimeraza rozpoczyna transkrypcję od sekwencji bogatej w pary GC rozpoznawanej przez czynnik transkrypcyjny SP1.

System regulacji działania genów może mieć strukturę hierarchiczną. Najbardziej jest to widoczne w procesach genetycznej regulacji różnicowania się organizmów tkankowych. Każdy organizm zwierzęcy powstaje z pojedynczej, zapłodnionej komórki jajowej, która dzieląc się wielokrotnie, różnicuje się, tworząc w pełni ukształtowany organizm złożony z odmiennych i różnie umiejscowionych tkanek. Jak się wydaje, geny kierujące procesem różnicowania (np. geny homeotyczne) są podobne zarówno u bezkręgowców, jak i kręgowców. Prawidłowa funkcja genów homeotycznych polega na przypisaniu komórkom, znajdującym się w różnych częściach tworzącego się organizmu, określonej orientacji przestrzennej. Wydaje się, że liniowy porządek występujących w blokach genów homeotycznych (od 5´ do 3´) odpowiada osiowemu porządkowi różnicującego się organizmu (typu głowa–ogon). Produktami genów homeotycznych są białka wiążące się z DNA, uczestniczące w procesie regulacji genów.

O ile opisywane mechanizmy regulacji transkrypcji dotyczyły konkretnych genów czy też ich fragmentów regulatorowych, o tyle metylacja DNA nie jest tak specyficzna, dotyczy bowiem sekwencji występujących w genomie bardzo często. Może więc dotyczyć regulacji grupy genów, a nawet całego chromosomu (inaktywacja jednego z chromosomów X). Metylacja zaliczana jest do tzw. mechanizmów epigenetycznych; termin ten stworzono początkowo jedynie dla tej części regulacji, która jest związana z rozwojem zarodka. Proces metylacji/demetylacji DNA jest powiązany z innymi regulacyjnymi mechanizmami epigenetycznymi, takimi jak np. acetylacja/deacetylacja histonów, w wyniku którego następują zmiany struktury chromatyny, co umożliwia lub blokuje aktywność transkrypcyjną poszczególnych fragmentów chromosomów.

Po zakończeniu translacji wiele białek przechodzi swoistą potranslacyjną modyfikację, polegającą między innymi na metylacji, fosforylacji lub glikozylacji cząsteczki. Liczne białka są syntetyzowane w formie prekursorów. W tym przypadku modyfikacja polega na odcięciu fragmentu peptydu. Potranslacyjna modyfikacja może mieć również charakter swoistego procesu składania białka, analogicznego do składania RNA. Wykazano, że niektóre peptydy mają zdolność autokatalitycznego usuwania ze swojej struktury fragmentów zwanych inteinami (analogia do intronów). Trudno powiedzieć, jak powszechny jest to proces i jakie funkcje pełnią w komórce inteiny. Niewątpliwie proces składania białka zwiększa różnorodność produktów kodowanych przez dany gen.

Prawidłowa funkcja białka jest związana z przyjęciem odpowiedniej struktury drugo- i trzeciorzędowej. Do niedawna panowało przekonanie, że pełna informacja o prawidłowym pofałdowaniu białka jest zawarta w sekwencji nukleotydów kodujących odpowiednie aminokwasy. Mówiono nawet o drugim kodzie genetycznym. Okazało się jednak, że do przyjęcia właściwej konformacji niezbędna jest obecność specyficznej klasy białek. Wśród nich wyróżnia się enzymy katalizujące fałdowanie oraz białka opiekuńcze (towarzyszące) (ang. chaperone). Opisano kilka klas tych białek. Białka opiekuńcze ułatwiają właściwe fałdowanie innych białek, ale nie jest to proces aktywny. Nie towarzyszy mu powstawanie wiązań kowalencyjnych, białka te nie wchodzą również w skład fałdujących się polipeptydów. Białka opiekuńcze biorą udział także we wszystkich etapach metabolizmu komórkowego, w ochronie przed stresem (np. podwyższeniem temperatury), a także w „naznaczaniu” białek przeznaczonych do degradacji. Charakteryzują się między innymi dużą konserwatywnością sekwencji aminokwasów.

Swoistym mechanizmem regulacji ekspresji genu jest tzw. wyciszanie. Wyciszanie ekspresji danego genu może się dokonać poprzez degradację transkryptu, blokowanie translacji lub indukcję mechanizmów epigenetycznych, takich jak metylacja DNA.

2.1.3.1. Wyciszanie ekspresji genu

Jedna z postaci potranskrypcyjnego mechanizmu wyciszania ekspresji genów jest nazywana interferencją RNA (ang. RNA interference, RNAi). Szczególną rolę w tym procesie pełni klasa cząsteczek RNA zaliczanych do niekodującego RNA (niekodujących białek) (ang. noncoding RNA, ncRNA).

Na etapie transkrypcji regulacja ekspresji odbywa się poprzez degradację transkryptu. W procesie tym uczestniczą tzw. siRNA (ang. small interfering RNA). siRNA to dwuniciowy RNA o wielkości 21–23 nukleotydów, który powstaje w wyniku cięcia długich dwuniciowych fragmentów RNA przez RNazy specyficzne wobec tego typu cząsteczek. W kompleksie z białkami siRNA rozplata się i teraz już jednoniciowy RNA łączy się z komplementarnymi fragmentami transkryptu. Uruchamiany proces degradacji transkryptu zostaje ostatecznie dokonany przez specjalny kompleks białkowy.

W blokowaniu translacji uczestniczą inne cząsteczki niekodującego RNA. Są nimi miRNA. W odróżnieniu od siRNA, miRNA, chociaż jednoniciowy, tworzy struktury komplementarne. Proces blokowania translacji polega na połączeniu wraz z kompleksem białkowym z nieulegającym translacji końcem 3´ transkryptu (3´ UTR) i nie jest aż tak specyficzny, jak komplementacja siRNA. miRNA powstaje również z większych prekursorowych cząsteczek RNA. Na terenie cytoplazmy przyjmują one strukturę „spinki do włosów”. Wykazano, że siRNA i miRNA często współuczestniczą w wyciszaniu genów.

Ewolucyjnie mechanizm RNAi rozwinął się jako jeden z elementów obrony przed infekcją wirusową, również jako mechanizm eliminujący rearanżacje genomu związane z przemieszczaniem się transpozonów. Jak się wydaje, poza wyciszaniem ekspresji genów RNAi może również odgrywać rolę w degradacji transkryptów zawierających przedwczesny kodon terminacji translacji (ang. nonsense-mediated decay, NMD).

Przykładem wyciszania ekspresji poprzez indukcję procesów epigenetycznych jest proces inaktywacji jednego z chromosomów X u kobiet. Proces ten jest sterowany przez gen XIST zlokalizowany na nieaktywnym transkrypcyjnie chromosomie X. Produktem tego genu jest specyficzny ncRNA, którego powstanie zapoczątkowuje proces inaktywacji innych genów na tym chromosomie.

2.1.3.2. Piętnowanie genomowe

Informacja genetyczna u człowieka jest sumą informacji przekazanych przez matkę i ojca. Komórki naszego organizmu są diploidalne. Stwierdzenie to w pełni odnosi się jednak tylko do kobiet. Tylko u nich bowiem każdy z alleli ma swój odpowiednik (22 pary autosomów i 2 chromosomy X). U mężczyzn występowanie dwóch różnych chromosomów płci (X i Y) powoduje, że większość genów kodowanych na tych chromosomach ulega monoallelicznej ekspresji. Występuje ona często w przypadku loci autosomalnych, gdy z dwóch alleli danej pary tylko jeden ulega ekspresji. Ewolucyjnie musiał więc powstać mechanizm równoważący dawkę genu. Takim mechanizmem jest piętnowanie genomowe (ang. genomic imprinting). Mechanizm ten nie jest związany ze zmianą sekwencji DNA, ma więc charakter epigenetyczny i potencjalnie dotyczy odwracalnych modyfikacji DNA. Mechanizm wyciszania alleli w piętnowaniu genomowym polega z reguły na metylacji fragmentu DNA. Piętnowanie może mieć charakter losowy, jak u kobiet w przypadku inaktywacji jednego z chromosomów X, lub rodzicielski (ang. parental genomic imprinting), gdy wykluczanie poszczególnych alleli jest uzależnione od ich ojcowskiego bądź matczynego pochodzenia.

Uważa się, że brak ekspresji informacji genetycznej w określonych loci pochodzenia ojcowskiego jest odpowiedzialny za następujące zespoły wad genetycznych człowieka: Pradera–Willego (chromosom 15q), kociego krzyku (5p), Millera–Diekera (17p), Wolfa–Hirschhorna (4p) czy Beckwitha–Wiedemanna (11p). Brak ekspresji w określonym locus informacji pochodzenia matczynego jest odpowiedzialny za występowanie zespołów Angelmana (15q), Di George’a (22q) czy zespołu włosowo-nosowo-paliczkowego typu II (ang. trichorhino-phalangeal syndrome) (8q) (por. rozdział 12). Defekt w piętnowaniu genomowym wykazano także w wielu chorobach nowotworowych, w tym zleżnych od ekspresji niektórych onkogenów.

2.1.4. Gen

Kolejnym etapom rozwoju genetyki towarzyszyły różne definicje genu. Trudno obecnie podać prosty opis, w którym jest zawarta pełna wiedza, jaką na ten temat posiadamy. Najogólniej gen to fragment kwasu nukleinowego, DNA lub RNA (jak to jest u niektórych wirusów), w którym jest zapisana informacja o kodowanym produkcie. W swej strukturze gen obok fragmentów kodujących (eksonów) (tab. 2.3) może zawierać elementy niekodujące, takie jak promotor czy introny.

W zasadzie jeden gen koduje jeden produkt, chociaż i od tej zasady znanych jest wiele odstępstw. Przykładem może być kodowanie różnych produktów z wykorzystywaniem odmiennych faz w tej samej ramce odczytu lub też kodowanie drugiego produktu w intronie danego genu. Geny mogą kodować informacje o RNA (np. tRNA, rRNA, snRNA) lub za jego pośrednictwem o białku.

Istnieją także wyjątki od zasady, że gen zajmuje zawsze stałe miejsce w chromosomie. Tak zwane transpozony, czyli fragmenty DNA mające zdolność przemieszczania się po chromosomie, liczą niekiedy kilka tysięcy par nukleotydów i mogą kodować różne geny. Skutkiem „nieuprawnionego” włączenia się transpozonu w chromosom może być inaktywacja genu, a także jego zwielokrotniona i wyzwolona spod kontroli ekspresja. Inny przykład zmienności struktury genów jest związany z procesem różnicowania się limfocytów. Sposób powstawania ogromnej liczby specyficznych przeciwciał został wyjaśniony, gdy okazało się, że układ segmentów, z których są składane geny kodujące przeciwciała, może ulegać różnym przekształceniom. Prowadzi to w konsekwencji do zmian w zapisie genetycznym w komórkach układu odpornościowego, czyli zmian w strukturze genu.

Tabela 2.3. Wielkość niektórych genów człowieka kodujących białka*

Produkt genu

Wielkość (kpz)

mRNA (kpz)

Liczba eksonów

α-Globina

0,8

0,5

3

β-Globina

1,5

0,6

3

Pro-α 1 kolagen I

18

5,0

51

Albumina

25

2,1

14

Receptor LDL

45

5,5

18

Hydroksylaza fenyloalaninowa

90

2,4

12

Czynnik VIII

186

9,0

26

CFTR

250

6,5

27

Neurofibromina

350

12,0

60

Dystrofina

2000

16,0

79

* Informacje o genach człowieka są zgromadzone w bazach danych, np. http://www.ensembl.org/index.html; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome.

Wielkość genu może również ulegać pewnym modyfikacjom. W sekwencji nukleotydów genu FMR1, którego defekt prowadzi do jednej z postaci niedorozwoju umysłowego (zespół FraX), można wyróżnić od 6 do 54 powtórzeń trójki nukleotydów CGG. Zmienność ta ma charakter populacyjny, a jej mechanizm nie jest w pełni wyjaśniony.

Na przestrzeni ostatnich kilkunastu lat zmieniały się poglądy co do liczby genów w genomie człowieka. Do końca 1995 r. znane były sekwencje (sekwencje eksonowe i flankujące je sekwencje intronów) około 5000 genów człowieka. Oceniano, że do zakodowania informacji genetycznej o podstawowych białkach potrzeba około 80 tys.genów. Wyniki sekwencjonowania chromosomu 21 i 22 podały w wątpliwość te szacunki. Ekstrapolując „nasycenie” genami stwierdzone dla tych chromosomów, odpowiednio 225 i 545, należało przyjąć, że w genomie człowieka znajduje się łącznie około 40 tys. genów. Dane te byłyby zgodne z wynikami określającymi liczbę genów na podstawie liczby tych fragmentów genomu, które służą jako matryce do wytwarzania RNA. Wydawało się jednak, że chromosomy 21 i 22 charakteryzują się małą liczbą kodowanych genów. Wskazywać na to mogło np. zagęszczenie genów kompleksu MHC na chromosomie 6. Ostatecznie na podstawie ogłoszonych (2001 r.) wyników roboczej wersji sekwencji genomu, uzyskanych w ramach połączonych wysiłków Human Genome Organisation (HUGO) i organizacji prywatnych, przyjmuje się, że całkowita liczba genów kodujących białka wynosi około 25 tys.

Z dogmatów obowiązujących w biologii pozostało niewiele. Nadal uważa się, że informacja o strukturze białek zakodowana jest w kwasach nukleinowych. Kierunek przekazywania informacji odbywa się więc od kwasów nukleinowych do białek, a nie odwrotnie. Trójkowy kod genetyczny jest kodem uniwersalnym, obowiązującym w całym świecie ożywionym. Różnice występują jedynie w zapisie genetycznym. W niektórych organizmach, a także w mitochondriach drożdży i ssaków wykazano bowiem, że określone kodony wyznaczają inne aminokwasy, niż to jest zazwyczaj. Jednak i w tych przypadkach, jak się wydaje, proces redagowania transkryptów przywraca zasady uniwersalnego kodu genetycznego. Uniwersalność kodu genetycznego oznacza, że wszystkie żyjące organizmy pochodzą od wspólnego przodka.

2.1.5. Świat RNA

RNA, od początku gdy tworzyły się podstawy wiedzy o kodowaniu i ekspresji genów, był obecny we wszystkich rozważaniach. Jego rolę ograniczano jednak tylko do pośredniczenia w przekazywaniu informacji. Widziano w nim głównie matrycę do syntezy białka. Już wtedy jednak RNA niekodujący zaznaczył swoją obecność chociażby w postaci tRNA i rRNA.

Z pewnym zaskoczeniem odkryto zdolności katalityczne niektórych cząsteczek RNA. Rybozymy to termin, którym określono RNA wykazujący aktywność enzymatyczną. Może być ona skierowana na własną cząsteczkę (autokataliza) lub na inne cząsteczki RNA. Niekiedy kompleks enzymatyczny jest tworzony łącznie ze specyficznymi białkami. Autokatalityczną aktywność wykazują małe wirusy RNA. Samowycinanie jest cechą pewnej klasy intronów, zachodzi też w czasie redagowania RNA. Funkcje w tworzeniu wiązań peptydowych przypisuje się RNA związanemu z białkami w takim kompleksie, jakim jest rybosom.

Rola, jaką obecnie przypisuje się RNA, a dokładniej ncRNA, odmieniła się radykalnie. ncRNA nie stanowi jednolitej grupy cząsteczek ani pod względem funkcji, ani wielkości, ale udowodniono jego udział w takich procesach jak regulacja transkrypcji, replikacja DNA, składanie RNA jego modyfikacja i edycja, stabilizacja transkryptu oraz w procesach translacji i degradacji białek. RNA odgrywa kluczową rolę także w procesach różnicowania i mechanizmach epigenetycznych. Możliwość komplementacji nici kwasów nukleinowych jest bowiem mechanizmem dużo bardziej precyzyjnym niż oddziaływania kwasy nukleinowe–białka. W tej sytuacji nie dziwi wysoki stopień konserwatywności genomu w części kodującej ncRNA.

Jak wspomniano wcześniej, ncRNA jest wysoce heterogenną klasą cząsteczek zarówno funkcjonalnie, jak i strukturalnie. ncRNA kodowany jest głównie w części genomu nie tak dawno określanej mianem DNA śmieciowego. ncRNA działa z reguły w kompleksie z białkami. Być może było to powodem niedostrzegania roli RNA. Wiele metod umożliwiających zarówno identyfikację, jak i badanie funkcji białek zakłada bowiem na wstępie całkowitą ekstrakcję kwasów nukleinowych. Uczestnicząc u Eukaryota w procesie składania transkryptów (wycinaniu intronów), RNA mógł odegrać rolę w procesach różnicowania sekwencji, a więc i jej ewolucji.

Życie na Ziemi powstało około 3,5 miliarda lat temu. Jak się wydaje, warunkiem jego powstania było uzyskanie przez pierwotne organizmy zdolności do powielania własnej informacji genetycznej. O ile w laboratorium można odtworzyć warunki pradawnej atmosfery ziemskiej i powstawanie w niej określonych związków organicznych, o tyle w dalszym ciągu nie ma przekonujących koncepcji, czym był pierwotny materiał genetyczny i jakie były zasady jego replikacji. Pierwotny system replikacji mógł mieć charakter nieorganiczny. Raczej nie był oparty na białkach, bo nie mają one zdolności do replikacji. Wielu uczonych uważa, że taką pierwotną cząsteczką niosącą informację genetyczną, a jednocześnie mającą funkcje katalityczne był RNA. Zgodnie z tą hipotezą DNA, obecnie powszechnie kodujący informację genetyczną jako cząsteczka stabilniejsza, jest kolejnym, po RNA, etapem w ewolucji informacji genetycznej. Niezależnie jednak od tego, jaki był pierwszy system kodowania i powielania informacji genetycznej, od czasu jego powstania należy datować życie na Ziemi.

2.2. Genom człowieka

Informacja genetyczna człowieka jest zapisana w genomach jądrowym i mitochondrialnym. Genom mitochondrialny jest zamknięty w kolistej cząsteczce DNA, a jego wielkość stanowi około 0,0005% genomu jądrowego. Genom jądrowy liczy ponad 3 miliardy nukleotydów i jest podzielony na 24 chromosomy. Genomy jądrowy i mitochondrialny różnią się umiejscowieniem w komórce, wielkością, liczbą i rodzajem kodowanych genów, podlegają również odmiennym zasadom dziedziczenia. Informacje o genomie mitochondrialnym zamieszczono w rozdziałach opisujących zasady dziedziczenia, choroby mitochondrialne i analizę DNA w medycynie sądowej.

2.2.1. Genomika

Początek lat dziewięćdziesiątych XX wieku przyniósł decyzje dotyczące pełnego poznania genomu człowieka. Ten światowy program był koordynowany przez HUGO. Skalę przedsięwzięcia, na tamte lata, mogą zobrazować następujące informacje. Do końca1997 r. tylko dla kilku bakterii, w tym: M. genitalium (0,58 Mpz), Haemophilus influenzae (1,83 Mpz), Methanococcus jannaschii (2 Mpz), Staphyloccocus aureus (2,8 Mpz), udało się poznać pełną genomową sekwencję nukleotydów. W genomie M. genitalium zidentyfikowano 517 genów, w genomie H. influenzae 1743, a w S. aureus – 2400. W porównaniu z tymi organizmami genom człowieka jest większy o trzy rzędy wielkości (tab. 2.4)[1], a liczbę kodowanych w nim genów szacuje się –jak wspomniano – na około 25 tys.

Tabela 2.4. Liczba genów kodujących białka u różnych organizmów

Gatunek

Wielkość genomu × 106 pz

Liczba chromosomów

Średnia wielkość genu (kpz)

Liczba genów

Escherichia coli

4,63

1

1,2

3025

Saccharomyces cerevisiae

14

16

1,7

6702

Drosophila melanogaster

170

8

11,3

ok. 13 000

Homo sapiens

3000

46

16,3

ok. 25 000

Przyspieszenie prac nad sekwencjonowaniem genomu ludzkiego było związane z zaangażowaniem kapitału prywatnego. Do 1995 r. w ludzkich bankach genów znajdowało się niespełna 12 Mpz sekwencji nukleotydowych, co stanowi około 0,4% całego genomu. Tylko 19 spośród znanych sekwencji DNA miało większą długość niż 50 kpz. Postęp dokonany w ciągu 1996 r. był stosunkowo niewielki. Znana była sekwencja około 1% genomu. W 1999 r. znanych już było 188,9 Mpz, co stanowiło 6,3% całego genomu. W 2000 r. opublikowano prawie pełną sekwencję dwóch najmniejszych chromosomów człowieka: 21 i 22. Zapowiedziano opublikowanie sekwencji DNA chromosomów 5, 16 i 19. Podano również informację o zakończeniu prac nad roboczą wersją genomu.

Ustalony zapis rodzaju i kolejności nukleotydów w cząsteczce ludzkiego DNA miał charakter modelowy. Znamy już zapis sekwencji nukleotydów w genomie dla tysięcy osób. Trwają prace nad identyfikacją różnic między osobami, tj. próby stworzenia mapy wariantów sekwencyjnych. Poznanie rodzaju i zakresu istniejących różnic umożliwi między innymi pełną charakterystykę genomu: określenie dodatkowych markerów genetycznych przydatnych w mapowaniu genów, w badaniach z zakresu patologii molekularnej i w badaniach prognostycznych. W ramach tego typu projektów przewiduje się podjęcie systematycznych badań grup etnicznych i populacji izolowanych.

Rok 2000 zaowocował opublikowaniem sekwencji genomowej 30 organizmów, w tym nicienia Caenorhabditis elegans (97 Mpz) i rzodkiewnika Arabidopsis thaliana (125 Mpz). W 2005 r. poznaliśmy między innymi sekwencję genomu psa i szympansa. W 2010 r. znane już były genomy ponad 200 organizmów (http://www.genomesize.com/), w tym 25 samych tylko różnych gatunków ssaków (http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_sequenced_eukaryotic_genomes). Poznaliśmy również genom neandertalczyka.

Wynikom identyfikacji sekwencji kolejnych genomów towarzyszy napływ olbrzymiej ilości informacji. Częściową odpowiedzią na konieczność przetwarzania napływających danych są zarówno nowe technologie, jak i powstanie odrębnej gałęzi genetyki molekularnej, jaką jest genomika. Genomika porównawcza już obecnie przynosi odpowiedź na wiele podstawowych pytań z zakresu ewolucji genomu, pochodzenia i roli poszczególnych genów. Celem genomiki funkcjonalnej jest badanie nie tyle funkcji danego genu, ile organizacji i kontroli dróg metabolicznych odpowiadających za biochemię i fizjologię komórki. Oznacza to równocześnie badanie ekspresji wielu genów na poziomie tworzonych transkryptów (analiza transkryptomu). Kompleksowymi badaniami ekspresji białek i ich wzajemnych oddziaływań zajmuje się z kolei proteomika. Nie sposób w tym kontekście nie wymienić bioinformatyki, a także badań in silico, które same w sobie stanowią wydzieloną dziedzinę umiejętności.

2.2.2. Struktura genomu

Początkowe trudności w sekwencjonowaniu genomu człowieka odzwierciedlały w pewnym stopniu zróżnicowanie jego struktury (tab. 2.5). Szczególnie poznanie długich powtarzających się sekwencji nukleotydów, niezależnie od przyjętej strategii sekwencjonowania, odwlekło moment opublikowania pierwszego pełnego zapisu informacji genetycznej.

Tabela 2.5. Struktura genomu człowieka

Typ sekwencji

Część genomu (%)

Unikatowe (geny kodujące białka)

~1,5

Geny RNA

~4

Powtórzone

~45

Inne

~50

Sekwencje unikatowe, wśród których znajdują się geny kodujące białka, stanowią jedynie około 1,5% całego genomu. Sekwencje te to swoistego rodzaju wyspy w morzu sekwencji tylko częściowo znanej funkcji. Rzadko spotyka się zgrupowania genów, takich jak np. kodujące rybosomowy RNA. Geny te występują bowiem w blokach w pięciu chromosomach człowieka.

Sekwencje powtórzone, to znaczy występujące w genomie w wielu kopiach, charakteryzują się określoną wielkością, rodzajem i układem nukleotydów. Stanowią one około 40% genomu. Sekwencje te z reguły nie kodują białek. Wyróżnia się wśród nich sekwencje rozproszone i sekwencje tandemowe (ryc. 2.6).

Rycina 2.6. Rodzaje sekwencji powtórzonych

Tabela 2.6. Podstawowe symbole stosowane do opisu kariotypu (ISCN, 2016)

add dodatkowy materiał chromosomowy nieznanego pochodzenia

cen centromer

del delecja

der pochodna przegrupowania chromosomowego

dic chromosom dicentryczny (zawierający dwa
centromery)

dn de novo, aberracja chromosomowa, która nie została odziedziczona

dup duplikacja

fra miejsce łamliwe

h heterochromatyna

i  izochromosom

ins insercja

inv inwersja lub odwrócona duplikacja

mar chromosom markerowy

mat pochodzenie matczyne

mos mozaikowy

p krótkie ramię chromosomu

pat pochodzenie ojcowskie

q długie ramię chromosomu

r chromosom pierścieniowy

rec chromosom zrekombinowany

rob translokacja robertsonowska

s satelity

subtel region subtelomerowy chromosomu

t translokacja

ter terminalny lub telomer

upd disomia jednorodzicielska

var wariant lub zmieniony

+/– przed numerem chromosomu oznacza dodanie
lub utratę całego chromosomu, po numerze
chromosomu oznacza dodanie lub utratę jego części

: złamanie chromosomu

:: złamanie i ponowne połączenie

–> określa opisywany fragment chromosomu „od–do”

Sekwencje rozproszone dzieli się z kolei na sekwencje krótkie i długie. Sekwencje krótkie (ang. short interspersed nuclear element, SINE), o długości 130–300 nukleotydów, są rozproszone w tysiącach kopii w całym genomie. Na przykład sekwencja Alu o długości około 300 nukleotydów jest „porozrzucana” po genomie w 1 milionie kopii. Sekwencja ta, zaliczana niekiedy do transpozonów, czyli elementów zdolnych do przemieszczania się po genomie, stanowi łącznie około 10% całego genomu. Jej występowanie jest charakterystyczne dla naczelnych i, jak się wydaje, może być ona podatna na redagowanie RNA. Sekwencję Alu zlokalizowano również w intronach genów kodujących α- i β-globinę, hormon wzrostu czy apolipoproteinę B. W liczącym 17 kpz genie inhibitora C1 (mutacje tego genu są odpowiedzialne za dziedziczny obrzęk naczynioruchowy) zlokalizowano aż 17 sekwencji Alu.

Długie sekwencje rozproszone (ang. long interspersed nuclear element, LINE), o wielkości około kilku tysięcy nukleotydów, reprezentują, podobnie jak sekwencja Alu, klasę sekwencji pochodzących od transpozonów. Szacuje się, że stanowią one około 20% genomu.

Sekwencje tandemowe, nazywane również satelitarnymi, to zblokowane seryjne powtórzenia krótkiej sekwencji nukleotydów. Dzieli się je na minisatelity i mikrosatelity, które różnią się między sobą liczbą nukleotydów zawartych w powtarzającym się motywie. Nazwa „sekwencje satelitarne” pochodzi od jednorodnej (satelitarnej) frakcji DNA obserwowanej w gradientach gęstości w czasie frakcjonowania genomowego DNA.

Minisatelity to zblokowane, zwielokrotnione kopie, w których powtarzający się motyw zawiera od 10 do 100 nukleotydów. Szacuje się, że w genomie człowieka znajduje się kilka tysięcy loci dla minisatelitów. Występują one w obrębie genów takich jak: gen insuliny, kolagenu typu II, mieliny, apolipoproteiny, α-globiny oraz w specyficznych loci zlokalizowanych poza genami struktury. Niektóre sekwencje powtórzone ulegają transkrypcji, nie ma jednak dowodu na ich ekspresję. Wyjątkiem jest nadzmienny locus MUC1, który koduje wysoce polimorficzną mucynę. Biologiczna funkcja minisatelitarnego DNA nie jest znana. Jedna z hipotez mówi, że ze względu na położenie sekwencje te mogą mieć znaczenie w tworzeniu par chromosomów homologicznych i rekombinacji. Sekwencjom powtórzonym przypisuje się również wpływ na strukturę chromosomów, trwałość transkryptów oraz udział w regulacji ekspresji genów. Spośród sekwencji minisatelitarnych rekrutują się tzw. sondy Jeffreya, wykorzystywane kilkanaście lat temu w badaniu pokrewieństwa członków danej rodziny.

Mikrosatelity to sekwencje tandemowe, w których podstawowy motyw zawiera od 1 do 6 nukleotydów i powtarza się w pojedynczym locus od 5 do 100 razy. Mikrosatelity są rozłożone równomiernie co 6–10 kpz, również w obszarach zajmowanych przez geny. Pięć grup powtórzeń mono-, di-, tri- i pentanukleotydowych (A > AC > AAAN > AAN > AG, gdzie N oznacza C, G, T) występuje najczęściej i stanowi 76% znanych sekwencji mikrosatelitarnych. W genach zwykle umiejscowione są w sekwencjach flankujących i intronach, chociaż są spotykane również w sekwencjach kodujących. Badania populacyjne wykazują, że sekwencje mikrosatelitarne charakteryzują się małą częstością mutacji, i to zarówno w komórkach rozrodczych, jak i somatycznych.

Najmniej można obecnie powiedzieć o tej części genomu, którą określono jako „inną”, mimo że, jak się wydaje, to właśnie tam zakodowana jest większość informacji regulacyjnych, decydujących o rozwoju i funkcjonowaniu organizmu.

2.2.3. Kariotyp

Prawidłowa komórka somatyczna człowieka jest diploidalna i zawiera 23 pary chromosomów. Jeden chromosom z każdej pary pochodzi od matki, drugi od ojca. Zestaw chromosomów komórki został podzielony na siedem łatwych do odróżnienia grup, oznaczonych początkowymi literami alfabetu od A do G. W każdej grupie chromosomy mają podobną wielkość i kształt oraz są uszeregowane malejąco (ryc. 2.7). Pary chromosomów od 1 do 22 stanowią tzw. autosomy. Ostatnią, 23. parą, są chromosomy płci – XX u kobiet i XY u mężczyzn. Kariotyp jest opisywany z zastosowaniem symboli uwzględniających liczbę chromosomów, chromosomy płci oraz określenie stwierdzonej nieprawidłowości (tab. 2.6). Zapis 46,XX oznacza prawidłowy kariotyp żeński, a 46,XY prawidłowy kariotyp męski.

Rycina 2.7. Prawidłowy kariotyp męski. Obraz prążków G uzyskany po trawieniu chromosomów trypsyną i barwieniu odczynnikiem Giemsy

Chromosomy występują we wszystkich komórkach jądrzastych, a nazwę swą zawdzięczają zdolności do wybarwiania (gr. chromos – kolorowy, soma – ciało). Każdy gatunek roślin i zwierząt ma charakterystyczny dla siebie zestaw chromosomów nazywany kariotypem. Określenie to jest stosowane także w odniesieniu do zestawu chromosomów typowego dla danego osobnika. Podstawowe zasady klasyfikacji i identyfikacji chromosomów oraz formy przedstawiania kariotypu zostały opracowane podczas trzech konferencji: w Denver (1960), Londynie (1963) i Paryżu (1971). Zestaw chromosomów pojedynczej komórki przedstawiony zgodnie z tymi zasadami nazywa się kariogramem.

Około 30% populacji wykazuje niewielkie dziedziczne różnice w budowie chromosomów (tzw. warianty morfologiczne). Tego rodzaju zmienność osobnicza, określana jako heteromorfizm chromosomów, stanowi przykład polimorfizmu genetycznego. Dotyczy on najczęściej regionów nieaktywnej transkrypcyjnie heterochromatyny długiego ramienia chromosomu Y, przycentromerowych regionów chromosomów 1, 9 i 16 pary oraz wszystkich chromosomów akrocentrycznych (ryc. 2.8). Heteromorfizm jest charakterystyczny także dla regionów organizatorów jąderka i satelitów występujących w chromosomach akrocentrycznych.

2.2.3.1. Struktura chromosomu

Chromosom jest zbudowany z DNA i białek, z których największą masę stanowią histony. Histony odznaczają się zwiększoną, w porównaniu z innymi białkami, liczbą aminokwasów zasadowych, takich jak lizyna i arginina, co ułatwia im wiązanie się z DNA. Spośród pięciu typów histonów cztery mają wysoce konserwatywną budowę. Oznacza to, że skład aminokwasowy tych białek jest zachowywany w procesie ewolucji ze względu na pełnione przez nie funkcje.

Kompleks kwasy nukleinowe–białka jest nazywany chromatyną. Jest ona widoczna w jądrze interfazowym jako substancja wykazująca zróżnicowany stopień zagęszczenia – kondensacji. Chromatyna o dużym stopniu kondensacji jest określana jako heterochromatyna w odróżnieniu od mniej skondensowanej euchromatyny. Chromosomy jako indywidualne struktury są widoczne tylko podczas podziału komórkowego. Stanowią one specyficzną formę wielostopniowej organizacji przestrzennej chromatyny (ryc. 2.9). Podstawową jednostką ich struktury jest nukleosom, na który składają się białka histonowe mocno związane z opasującą je 2 i ¹/₂ razy podwójną helisą DNA. DNA nukleosomu zawiera zawsze tę samą liczbę par nukleotydów. W dalszym etapie organizacji chromatyny nukleosomy łączą się ze sobą w strukturę przypominającą sznur korali. W wyniku pofałdowania i skręcenia struktury nukleosomowej tworzy się następnie włókno chromatynowe, które zwija się w postać tzw. selenoidu. Kolejne poziomy organizacji są poznane dużo słabiej. Przyjmuje się, że chromosom metafazowy, najbardziej skondensowana postać chromatyny, powstaje w wyniku tworzenia się kolejnych skrętów i pętli selenoidu. Chromosom metafazowy wykazuje 10 tys. razy większą kondensację DNA niż chromatyna jądra interfazowego.

Rycina 2.8. Specyficzne barwienie regionów centromerowych chromosomów – prążki C. Chromosomy 1, 9, i 16 mają ciemno wybarwione regiony heterochromatyny konstytucyjnej, a chromosom Y heterochromatynę dystalnej części długiego ramienia

Rycina 2.9. Struktura chromatyny. Kolejne etapy upakowania podwójnej helisy DNA. H2A, H2B, H3 i H4 to oznaczenia dla poszczególnych typów histonów o budowie konserwatywnej

Chromosomy metafazowe są zbudowane z dwóch identycznych (siostrzanych) chromatyd. Miejsce połączenia chromatyd – centromer (tzw. przewężenie pierwotne) dzieli chromosom na dwa ramiona, krótkie i długie. Regiony na końcach obu ramion są nazywane telomerami (gr. telos – koniec). Położenie centromeru decyduje o kształcie chromosomów, różnicując je na chromosomy meta-, submeta- i akrocentryczne (ryc. 2.10). Długość ramion w chromosomach submeta- i akrocentrycznych jest wyraźnie zróżnicowana, w chromosomach metacentrycznych natomiast w przybliżeniu taka sama. Cechą wyróżniającą chromosomy akrocentryczne jest obecność na końcu ramion krótkich grudek chromatyny, zwanych w terminologii cytogenetycznej satelitami. Charakterystyczna jest wielkość i liczba satelitów, a także długość nitki satelitonośnej.

Rycina 2.10. Budowa chromosomu metafazowego

Centromer jest niezbędnym elementem struktury chromosomu zapewniającym właściwą segregację chromosomów w czasie mejotycznego i mitotycznego podziału komórki. W kilkumilionowej sekwencji nukleotydów składającej się na centromer znaleziono jedynie różnego typu sekwencje powtórzone. W większości są to sekwencje satelitarne, ale wyróżniono też wiele sekwencji typu SINE czy LINE. Wśród pięciu typów sekwencji satelitarnych, różniących się długością powtarzanej sekwencji, w centromerach wszystkich chromosomów występuje sekwencja α. Długość powtarzającego się motywu wynosi 171 nukleotydów. W większości badanych centromerów jest obecny również satelita 5-nukleotydowy (GGAAT)n. Pozostałe sekwencje satelitarne są charakterystyczne dla określonych chromosomów. Bloki sekwencji satelitów α i 5-nukleotydowe stanowią podstawę struktury i organizacji centromeru. Budowę centromeru dopełniają specyficzne białka wiążące się między innymi z satelitą α. Wiele tych białek ma strukturę podobną do histonów.

Telomery uniemożliwiają zlepianie się chromosomów i zapewniają im właściwe umiejscowienie wewnątrz jądra komórkowego. Nie zawierają sekwencji kodujących. Zbudowane są z wielokrotnych powtórzeń sekwencji bogatych w GT. U człowieka jest to sekwencja 5´-TTAGGG-3´. W momencie urodzenia długość poszczególnych telomerów wynosi od 6 do 10 tys. nukleotydów. Jak się wydaje, najważniejszą jego funkcją jest ochrona chromosomów przed skracaniem w czasie kolejnych podziałów komórkowych. Problem ten jest szczególnie istotny dla chromosomów w komórkach rozrodczych. Nieograniczone zmniejszanie długości prowadziłoby bowiem z czasem do eliminacji genów położonych na końcach chromosomu. Uzupełnianie skracających się telomerów jest rolą telomerazy. Funkcję katalityczną tego enzymu pełnią łącznie białko i RNA. Sekwencje nukleotydów RNA służą jako matryca do syntezy podstawowej jednostki DNA telomeru. Proces skracania się telomerów nierównoważony przez aktywność telomerazy może prowadzić do śmierci komórki.

Numeracja chromosomów człowieka, od 1 do 22, odpowiada w zasadzie gradacji ich wielkości. Na przykład w chromosomie 1 jest zakodowane 8% całej informacji genetycznej (250 Mpz). W chromosomie 21–1,5%, a w chromosomie 22–1,6% tej informacji. W chromosomie X jest zawarte 5% informacji genetycznej (154 Mpz), a w chromosomie Y – 1,7% (53 Mpz) genomu.

2.2.3.2. Mitoza

Podział komórki somatycznej, w którym z jednej tworzą się dwie identyczne genetycznie komórki, jest nazywany mitozą. W czasie mitozy z chromatyd każdego chromosomu powstają chromosomy potomne, dzięki czemu komórki potomne zachowują taką samą liczbę chromosomów jak komórka macierzysta.

Komórki eukariotyczne dzielą się cyklicznie (ryc. 2.11). Każdy podział komórki poprzedza synteza DNA, podczas której następuje podwojenie jego ilości w komórce (faza S syntezy DNA trwająca około 8  godz.). Okres, w którym cały genom zostaje podwojony, trwa około 4 godzin i jest nazywany fazą G2 (ang. gap). Faza podziału mitotycznego (M) trwa niespełna 1 godzinę, po czym następuje interfaza (G1) wykazująca bardzo zróżnicowaną długość trwania. Komórki, które nie będą się już dzielić, pozostają w fazie G0.

Rycina 2.11. Schemat cyklu komórkowego. G1– faza spoczynkowa, trwają przygotowania do syntezy DNA, S – faza replikacji DNA, G2 – faza spoczynkowa, trwają przygotowania do organizacji materiału genetycznego, M – faza podziałowa

W przebiegu mitozy można wyróżnić cztery fazy (ryc. 2.12). W pierwszej (profaza) w jądrze następuje stopniowa spiralizacja i kondensacja chromatyny, chromosomy stają się widoczne. Każdy z nich jest przyczepiony do określonego miejsca błony jądrowej i składa się z przylegających do siebie chromatyd siostrzanych połączonych w centromerze. Zanika błona jądrowa. W drugiej (metafaza) chromosomy osiągają największy stopień kondensacji, wędrują do płaszczyzny równikowej komórki i formują płytkę metafazową. Powstaje wrzeciono mitotyczne. W tym stadium najłatwiejsza jest analiza liczby i struktury chromosomów, co wykorzystuje się w badaniach cytogenetycznych. W późnej metafazie następuje podział centromerów i oddzielenie od siebie chromatyd siostrzanych chromosomów. W następnej fazie (anafaza) chromatydy wędrują do przeciwległych biegunów komórki, stając się chromosomami potomnymi. W końcowym etapie podziału (telofaza) zostaje odtworzona błona jądrowa. Następuje podział cytoplazmy i powstają dwie komórki potomne zawierające po 46 chromosomów (każdy z nich składa się z jednej chromatydy). W nowo powstałych komórkach zachodzą procesy odwrotne do obserwowanych w czasie profazy. Chromosomy ulegają dekondensacji do interfazowej postaci chromatyny.

Rycina 2.12. Schemat podziału mitotycznego komórki (na przykładzie dwóch par chromosomów). Chromosomy od jednego z rodziców zaznaczono na czarno, od drugiego są jasne

2.2.3.3. Mejoza

Jako mejoza określane są dwa sprzężone ze sobą podziały komórkowe (mejoza I i mejoza II), w których wyniku powstają komórki płciowe – gamety (ryc. 2.13). Różnią ją od mitozy dwa zjawiska o podstawowym znaczeniu biologicznym: redukcja liczby chromosomów i rekombinacja genetyczna.

Rycina 2.13. Schemat podziału mejotycznego komórki (na przykładzie dwóch par chromosomów). Chromosomy od jednego z rodziców zaznaczono na czarno, od drugiego są jasne

W czasie mejozy diploidalna liczba chromosomów, typowa dla komórek somatycznych (2n = 46), zostaje zredukowana do haploidalnej (n = 23). Zapewnia to zachowanie stałej, charakterystycznej dla gatunku liczby chromosomów, która zostaje odtworzona po połączeniu gamety męskiej i żeńskiej w zygotę. Każda komórka organizmu rozwijającego się z zygoty ma więc dwa zestawy chromosomów, jeden pochodzący od matki, drugi od ojca. Odpowiadające sobie chromosomy tworzą pary. Chromosomy jednej pary są nazywane homologicznymi.

Rekombinacja stanowiąca wynik wymiany fragmentów chromosomów homologicznych zapewnia genetyczną zmienność i niepowtarzalność genotypu gamet, a zatem i rozwijającego się z zygoty nowego organizmu. Oba te zjawiska, redukcja liczby chromosomów i rekombinacja, zachodzą w I podziale mejotycznym. Pierwsze z nich realizuje się dzięki temu, że dwóm podziałom komórkowym towarzyszy tylko jedna runda replikacji DNA, poprzedzająca mejozę I. Druga zachodzi w czasie profazy tego podziału.

Mejoza I

Rozpoczyna się od długo trwającej profazy, w której wyróżnia się kilka następujących po sobie stadiów. Chromosomy homologiczne, widoczne początkowo jako długie, cienkie nici (leptoten), przylegają do siebie, tworząc biwalenty (zygoten), po czym ulegają kondensacji (pachyten). W tym czasie w każdym z chromosomów można wyróżnić dwie chromatydy (biwalent składa się więc z czterech chromatyd). Następuje wymiana fragmentów chromatyd chromosomów homologicznych, tzw. crossing-over. Warunkiem tej wymiany jest powstanie połączeń chromatyd (chiazm) widocznych w czasie rozdzielania się biwalentów (diploten). Stopniowemu rozdzielaniu się biwalentów towarzyszy terminalizacja chiazm (w diakinezie pozostają one jedynie na końcach chromosomów). Chromosomy, w których nastąpił crossing-over, nazywane są zrekombinowanymi. Zawierają one mieszaninę materiału genetycznego obecnego pierwotnie w chromosomach homologicznych, a więc mieszaninę informacji genetycznej matki i ojca.

W dalszym przebiegu mejozy I chromosomy homologiczne gromadzą się w płaszczyźnie równikowej komórki (metafaza I), a następnie wędrują do jej przeciwległych biegunów (anafaza I). Powstają dwie komórki potomne zawierające po 23 chromosomy (po jednym chromosomie homologicznym z każdej pary).

Mejoza II

Następuje bezpośrednio po zakończeniu pierwszej. Nie poprzedza jej interfaza ani synteza DNA. Mechanizm i przebieg tego podziału jest taki sam jak podziału mitotycznego. Powstają komórki potomne identyczne pod względem liczby chromosomów i zawartej w nich informacji genetycznej.

U mężczyzn gamety są wytwarzane w procesie spermatogenezy, a u kobiet oogenezy. W podziale mejotycznym z diploidalnego spermatogonium powstają cztery spermatozoa. W gonadach żeńskich natomiast, w wyniku nierównego podziału cytoplazmy w obu podziałach mejotycznych, powstaje jeden oocyt i jedno ciałko kierunkowe, które następnie ulega degradacji. Tak więc ostatecznym wynikiem mejozy jest powstanie tylko jednej gamety żeńskiej – dojrzałego oocytu.

2.3. Zmienność i dziedziczność

Obserwowana na co dzień zmienność i różnorodność świata żywego ma podłoże zarówno dziedziczne, jak i uwarunkowane czynnikami środowiskowymi. W zależności od warunków zewnętrznych organizmy o identycznym genotypie mogą niekiedy znacznie się różnić między sobą fenotypowo. Zmiany w środowisku mogą bowiem warunkować sytuacje, w których cecha dziedziczona z pokolenia na pokolenie się nie ujawnia. Na zmienność fenotypową składa się również wiele cech, które organizmy (rośliny, zwierzęta czy ludzie) nabywają w trakcie życia osobniczego. Nie są to jednak cechy przekazywane potomstwu. Podstawą zmienności są mechanizmy, które prowadzą do utrwalonych zmian w obrębie kwasów nukleinowych. W organizmach jednokomórkowych wszystkie zmiany w DNA są dziedziczne. U organizmów wielokomórkowych przekazywane z pokolenia na pokolenie są tylko zmiany następujące w DNA komórek, z których powstają gamety.

Zmienność dziedziczna jest kształtowana w procesach rekombinacji DNA i mutacji. Rekombinacja, czyli wymiana między nićmi DNA lub fragmentami chromosomów, zachodzi w procesach podziału komórek i prowadzi do powstania różnych kombinacji genów oraz ich alleli. Ma to szczególne znaczenie dla genotypu gamet, a w konsekwencji dla ujawniania się określonych cech fenotypowych u osobników potomnych. Gamety danego osobnika, mimo posiadania pełnej informacji genetycznej, nie są bowiem genetycznie identyczne.

2.3.1. Mutacje

Za tworzenie się nowych alleli danego genu, czy też nowych genów, są odpowiedzialne mutacje. To właśnie zmienność mutacyjna jest podstawą procesów ewolucyjnych. Nie wszystkie jednak mutacje są dziedziczne. Mutacje komórek somatycznych, a także mutacje letalne nie są dziedziczone z pokolenia na pokolenie. Mutacje mogą dotyczyć sekwencji nukleotydów w cząsteczce DNA oraz struktury i liczby chromosomów. Powstają spontanicznie lub też na skutek działania czynników mutagennych, takich jak promieniowanie jonizujące czy niektóre związki chemiczne. Mutacjom może podlegać każdy nukleotyd w cząsteczce kwasu nukleinowego. Znane są jednak obszary chromosomu, w których częstość mutacji jest dużo większa niż w innych odcinkach.

Mutacją punktową jest zamiana jednego nukleotydu na inny. Może nią być również ubytek lub wstawienie pojedynczego nukleotydu. Wśród mutacji punktowych wyróżnia się mutacje w części kodującej, zmieniające bezpośrednio sens informacji genetycznej, oraz mutacje w obszarach regulacyjnych genu czy np. w intronach. W takich przypadkach można się spodziewać zmian w ekspresji genu lub błędnego składania RNA.

Gdy mutacja punktowa następuje w sekwencji kodującej genu, jej skutkiem może być zamiana nukleotydu i utworzenie trójki nukleotydów kodującej inny aminokwas (ang. missens). Może też powstać mutacja nonsens, gdy w wyniku zamiany nukleotydów zostaje utworzony jeden z kodonów stop. W przypadku delecji lub wstawienia nukleotydu powstaje mutacja zmiany ramki odczytu (ang. frameshift) w sekwencji kodującej informację genetyczną. Skutkiem mutacji punktowej może być zmiana lub utrata funkcji kodowanego białka. Obserwowany w przypadku powstania mutacji nonsens, a bardzo często i „frameshift” częściowy lub całkowity brak kodowanego białka jest wynikiem przedwczesnej terminacji translacji. Mutacje punktowe mogą również prowadzić do utraty przyłączania białek opiekuńczych do danej sekwencji nukleotydów, a w rezultacie braku właściwego fałdowania się polipeptydu.

W postaci klasycznej terminem „mutacja polimorficzna” określa się natomiast te punktowe zmiany w genie, które nie prowadzą do zmiany aminokwasu w cząsteczce kodowanego białka. Sytuacje takie występują wtedy, gdy dany aminokwas jest wyznaczany przez kilka różnych kodonów – tzw. degeneracja kodu genetycznego.

Obok mutacji punktowych wyróżnia się też delecje, wstawianie czy inwersję większych fragmentów genu. Mutacją genową jest więc też delecja całego genu DMD (2,3 Mpz), kodującego dystrofinę. Gen ten stanowi 1,5% chromosomu X, a delecja tego genu jest dobrze widoczna w badaniu cytogenetycznym i mogłaby być klasyfikowana jako aberracja chromosomowa.

Mutacja nie musi się ujawniać w momencie powstania. Efekty działania mutacji uwidaczniają się dopiero wtedy, gdy zaistnieją warunki fenotypowej ekspresji zmutowanego genu. Przykładem relacji mutacja i środowisko mogą być mutacje klasyfikowane niekiedy jako tzw. zmiany ekogenetyczne. Dziedzicznie uwarunkowana zdolność do wyczuwania cyjanowodoru czy fenylotiomocznika ujawnia się tylko wtedy, gdy cyjanowodór pojawi się w powietrzu lub też gdy dana osoba poliże bibułę nasyconą fenylotiomocznikiem. Osoby z akatalazją charakteryzują się brakiem katalazy. Cecha ta ujawni się jedynie wtedy, gdy krew zabarwi się na brunatno w czasie przemywania skaleczenia lub krwawiącej rany wodą utlenioną. U osób z xeroderma pigmentosum (defekt w genie kodującym jedną z helikaz uczestniczących w procesie naprawy DNA) zmiany skórne występują tylko wtedy, gdy osoby te są wystawione na promieniowanie słoneczne.

W literaturze można spotkać różne klasyfikacje mutacji. Jedną z nich jest bardzo przydatny podział pod względem skutków na poziomie genu. Wyróżnia się między innymi mutacje utraty funkcji (ang. loss-of-function) i mutacje uzyskania funkcji (ang. gain-of-function).

2.3.1.1. Mutacje dynamiczne

Odmiennym typem mutacji są zmiany opisane po raz pierwszy w genie FMR1, którego defekt jest odpowiedzialny za występowanie zespołu łamliwego chromosomu X (FraX). Zmiany te polegają na zwielokrotnieniu liczby trójnukleotydowego motywu w sekwencji genu. U osób zdrowych liczba kopii trójki CGG w nieulegającej translacji części pierwszego eksonu FMR1 nie przekracza 54. U bezobjawowych nosicieli zespołu FraX dochodzi do 200 (premutacja). U osób chorych liczba kopii może przekraczać 1000 powtórzeń. Ten typ zmian nazwano mutacją dynamiczną. Cechą charakterystyczną wielu chorób powodowanych mutacjami dynamicznymi jest występowanie zjawiska antycypacji.

Mutacje dynamiczne występują w części kodującej lub niekodującej odpowiedniego genu. Klasyfikacja zależy od roli, jaką mutacje te odgrywają w patogenezie poszczególnych chorób. Pierwszą grupę stanowiłyby choroby takie jak zespół FraX i ataksja Friedreicha, w których brak białka lub jego bardzo małe stężenie spowodowane jest zaburzeniem prawidłowego przebiegu transkrypcji. W zespole FraX jest to np. spowodowane hipermetylacją powtórzeń CGG na końcu 5’. Do drugiej grupy zalicza się choroby, w których produkt białkowy jest obecny, ale został zmieniony w wyniku obecności ciągów glutamin (efekt wielokrotnych powtórzeń motywu CAG w sekwencji genu). Takie białko z reguły nabywa nową, szkodliwą dla organizmu funkcję, a mutacja jest dominująca. Brak charakterystycznego dominującego dziedziczenia w przypadku rdzeniowo-opuszkowego zaniku mięśni (defekt genu AR zlokalizowanego na chromosomie X), jest prawdopodobnie wynikiem zjawiska losowej inaktywacji chromosomu X. Trzecią grupę stanowią choroby powodowane powieleniem trójnukleotydowego motywu w niekodujących fragmentach genu, w których efekt dominacji wywołany jest nabyciem nowej funkcji przez RNA. Ta nowa funkcja jest wynikiem pojawienia się w cząsteczce RNA powielonych trójnukleotydowych motywów. „Toksyczny” RNA, np. w przypadku dystrofii miotonicznej typu 1, poprzez sekwestrację[2] białek wiążących ciągi (CUG) w mRNA zaburza prawidłowy przebieg procesu składania różnych transkryptów, co powoduje plejotropowość zmian fenotypowych charakterystycznych dla tej choroby. Podobny patomechanizm sugeruje się dla zespołu drżenia/ataksji związanej z łamliwym X (FXTAS). Do trzeciej grupy zalicza się też ataksje rdzeniowo-móżdżkowe typu 8, 10, 12, a także chorobę podobną do choroby Huntingtona.

Do końca 2010 r. opisano jeszcze kilkadziesiąt innych chorób genetycznych spowodowanych ekspansją powtórzeń trójnukleotydowych (tab. 2.7). Opisano także takie choroby, jak dystrofia miotoniczna typu 2, gdzie wykazano zwielokrotnienie motywu czteronukleotydowego (CCTG), oraz ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typu 10, z powielonym wielokrotnie motywem pięcionukleotydowym (ATTCT).

Tabela 2.7. Choroby dziedziczne warunkowane mutacjami dynamicznymi w obszarach powtórzeń sekwencji trójnukleotydowych (podział ze względu na lokalizację mutacji)

Choroba

Gen

Locus

Rodzaj powtórzeń

Antycypacja¹

Dziedziczenie²

Lokalizacja w genie³

Patomechanizm⁴

Typ choroby⁵

Mutacje w części kodującej genów

Choroba Huntingtona (HD)

IT15

4p16.3

CAG

O

AD

ORF

ZF/UF

ND

Choroba podobna do HD typ 2 (HDL-2)

JPH3

16q24.3

CAG/CTG

?

ZF

Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typ 1 (SCA1)

ATXN1

6p23

CAG

O

Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typ 2 (SCA2)

ATXN2

12q24

Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typ 3 (SCA3) [Choroba Machado-Josepha (MJD)]

ATXN3

14q24.3-q31

Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typ 6 (SCA6)

ACNA1A

19p13

n.o.

Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typ 7 (SCA7)

ATXN7

3p21.1-p12

O

Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typ 17 (SCA17)

TBP

6q27

CAG/CAA

O/M*

Zanik jąder zębatych, czerwiennych, gałek bladych i ciał podwzgórzowych Luysa (DRPLA)

DRPLA

12p13.31

CAG

O 

Rdzeniowo-opuszkowy zanik mięśni związany z chromosomem X (SMAX1)

AR

Xq13-21

n.o.

XR

Mutacje w części niekodującej genów

Zespół łamliwego chromosomu X (FXS, FraX)
Zespół drżenia/ataksji związany z łamliwym chromosomem X (FXTAS)

FMR1

Xq27.3

CGG

M
–

XD

5´ UTR

UF

RNA ZF

ZW

Upośledzenie umysłowe związane z FRAXE (FXE MR)

FMR2

Xq28

GCC

n.o.

XD (?)

5´ UTR

UF

ZW

Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typ 8 (SCA8)⁶

TXN8/ATXN8OS

13q21

CTG/CAG

M

AD

3´ UTR/ORF

n.z.

ND

Dystrofia miotoniczna typ 1 (DM 1)

DMPK

19q13

CTG

M

3´ UTR

RNA ZF

ZW

Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typ 12 (SCA12)

PP2R2B

5q31-q33

CAG

?

5´ UTR

n.z.

ND

Ataksja Friedreicha typ 1 (FRDA)

FRDA

9q13-21.1

GAA

M

AR

intron

UF

ZW

Wg D. Hoffman-Zacharskiej, Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, porównaj także: www.neuro.wustl.edu/neuromuscular

n.o. – nie określono

n.z. – mechanizm nieznany

¹ Antycypacja zazwyczaj w dziedziczeniu: O – odojcowskim; M – odmatczynym; * – zależna od konfiguracji powtórzeń CAG/CAA.

² Dziedziczenie: XD – dominujące sprzężone z płcią; XR – recesywne sprzężone z płcią, AD – autosomalne dominujące.

³ ORF – otwarta ramka odczytu; UTR – region nieulegający translacji (ang. untranslated region).

⁴ ZF – zmiana/zaburzenie funkcji białka; UF – utrata funkcji białka; RNA ZF – zaburzenie oddziaływań RNA.

⁵ ND – choroba zwyrodnieniowa ośrodkowego układu nerwowego, ZW – zespół wieloukładowy.

⁶ Mutacja warunkująca SCA8 dotyczy dwóch zachodzących na siebie genów ulegających ekspresji w odwrotnej orientacji ATXN8OS (CTG w regionie 3´ UTR) i ATXN8 (CAG w ORF).

2.3.2. Aberracje chromosomowe

Pojęcie „aberracja chromosomowa” odnosi się do wszelkich nieprawidłowości chromosomów. Zgodnie z klasyczną definicją określa ono mutację tak dużą, że staje się ona widoczna w mikroskopie świetlnym. Wielkość najmniejszej widocznej w mikroskopie mutacji, np. delecji, oceniana jest na 2–4 × 106 par zasad. Aberracje chromosomowe powstają w komórkach somatycznych lub w gametach. Mogą powstawać de novo lub być dziedziczone od rodziców. Wyróżnia się aberracje liczbowe i strukturalne.

Aberracje liczbowe

Wśród nieprawidłowości liczbowych chromosomów wyróżnia się poliploidię i aneuploidię. Komórki, w których liczba chromosomów stanowi wielokrotność liczby haploidalnej większą niż 2n (u człowieka np. 3n = 69,XXY lub 4n = 92,XXYY), nazywane są poliploidalnymi. Zestaw chromosomów, w którym ich liczba nie stanowi prostej wielokrotności liczby haploidalnej, np. 47,XXX, określany jest jako aneuploidalny.

Poliploidia – u człowieka jest zazwyczaj cechą letalną. Najczęściej występującą postacią poliploidii jest triploidia oraz tetraploidia. Triploidia powstaje zazwyczaj w wyniku zapłodnienia oocytu przez dwa plemniki lub przez połączenie dwóch gamet, z których jedna jest nieprawidłowa, diploidalna. Tetraploidia jest skutkiem braku pierwszego podziału zygoty, powodującego podwojenie liczby chromosomów bezpośrednio po zapłodnieniu.

Aneuploidia – należy do najczęściej występujących aberracji chromosomowych (1/250 noworodków) (tab. 2.8). Najczęstszą jej postacią jest trisomia (obecność dodatkowego chromosomu, tzn. trzech zamiast dwóch kopii danego chromosomu). Wśród stwierdzanych trisomii 50% stanowią trisomie autosomów (21, 13, 18), drugą połowę zaś trisomie chromosomów płci (XXY, XXX i XYY). Brak jednego chromosomu w diploidalnym zestawie, określany jako monosomia, jest zazwyczaj cechą letalną. Wyjątek stanowi obecność jednego chromosomu X (45,X) odpowiedzialna za występowanie zespołu Turnera.

Tabela 2.8. Częstość występowania chorób dziedzicznych spowodowanych aberracjami liczbowymi chromosomów

Choroba

Częstość występowania (urodzeń)

nieprawidłowości chromosomów autosomowych

Trisomia 21 (zespół Downa)

1 na 650

Trisomia 18

1 na 5000

Trisomia 13

1 na 8000

nieprawidłowości chromosomów płci

Zespół Klinefeltera (47,XXY)

1 na 1000 (chłopców)

Zespół XYY (47,XYY)

1 na 800 (chłopców)

Zespół Turnera (45,X lub 45,X/46,XX lub 45,X/46,XY lub izochromosom Xq)

1 na 2500 (dziewczynek)

Aneuploidia powstaje w wyniku nieprawidłowego rozdzielenia się chromosomów homologicznych (jednej pary) lub chromatyd siostrzanych chromosomu w czasie podziału komórkowego. Najczęściej jest to nierozdzielenie się (nondysjunkcja) chromosomów (ryc. 2.14). Nondysjunkcja może nastąpić podczas mejozy (w momencie powstawania gamet) lub w trakcie podziałów mitotycznych zygoty. Nondysjunkcja występuje częściej w oogenezie niż w spermatogenezie.

W wyniku nondysjunkcji mejotycznej powstają gamety disomiczne lub nullisomiczne w odniesieniu do specyficznego chromosomu. Połączenie z gametą prawidłową prowadzi do powstania zygoty trisomicznej lub monosomicznej. Wszystkie komórki rozwijającego się organizmu mają wówczas tę samą nieprawidłową liczbę chromosomów.

Nondysjunkcja mitotyczna prowadzi do powstania mozaikowości chromosomowej. Oznacza to wystąpienie w organizmie rozwijającym się z zygoty dwóch lub więcej subpopulacji komórkowych różniących się zestawem chromosomów (np. mozaikowość 45,X/47,XXX).

Przyczyną monosomii może być również wyeliminowanie jednego chromosomu z komórki wskutek opóźniania jego ruchu podczas anafazy podziału mitotycznego. Przyjmuje się, że opóźnianie się chromosomu Y podczas mejozy stanowi najczęstszą przyczynę monosomii chromosomu X w zespole Turnera.

Aberracje strukturalne

Ten typ aberracji powstaje w wyniku złamania jednego lub kilku chromosomów i nieprawidłowego połączenia się (w nową konfigurację) powstałych „lepkich” końców. Może temu towarzyszyć przegrupowanie się fragmentów chromosomów. W klasyfikacji cytologicznej tych aberracji wyróżnia się: translokacje, inwersje, izochromosomy, delecje, duplikacje, chromosomy pierścieniowe i dicentryczne (ryc. 2.15). W odniesieniu do ich skutków fenotypowych można je podzielić na zrównoważone i niezrównoważone. Do zrównoważonych zaliczane są te aberracje, w czasie powstawania których nie doszło do utraty lub zwiększenia ilości materiału chromosomowego. Nie mają one na ogół wpływu na cechy fenotypu ich nosiciela, są natomiast przyczyną powstawania w czasie mejozy gamet z nieprawidłowym zestawem chromosomów. Aberracje niezrównoważone cechuje zmniejszenie lub zwiększenie, w stosunku do stanu prawidłowego, ilości materiału chromosomowego. Powstają w wyniku mejotycznej segregacji aberracji zrównoważonych, ale mogą też powstać de novo.

Rycina 2.14. Nondysjunkcja mejotyczna pary chromosomów i jej skutki

Rycina 2.15. Aberracje strukturalne chromosomów

Translokacje należą do najczęściej występujących aberracji strukturalnych chromosomów. Powstają w wyniku złamania chromosomów i przegrupowania (najczęściej wzajemnej wymiany) fragmentów między dwoma chromosomami. Są to tzw. translokacje wzajemne. Poza nimi wśród translokacji wyróżnia się fuzje centryczne oraz insercje.

Fuzje centryczne, określane też jako translokacje robertsonowskie, dotyczą zawsze chromosomów akrocentrycznych (13–15, 21 i 22), w których złamanie następuje w centromerze lub blisko niego. W wyniku połączenia dwóch chromosomów akrocentrycznych tworzy się jeden, często zawierający oba centromery chromosomów, z których powstał. Krótkie ramiona chromosomów uczestniczących w fuzji są najczęściej eliminowane z komórki. Translokacje tego typu są zrównoważone, ponieważ krótkie ramiona chromosomów akrocentrycznych są zbudowane z nieczynnej genetycznie heterochromatyny. Fuzje centryczne chromosomów 13 i 14 oraz 14 i 21 są najczęściej występującymi translokacjami u człowieka.
Insercje powstają w wyniku trzech złamań w dwóch chromosomach. Fragment chromosomu powstały między dwoma złamaniami w jednym chromosomie zostaje przeniesiony do drugiego chromosomu i połączony z nim w miejscu złamania.

W przypadku translokacji wzajemnej w pierwszym podziale mejotycznym podczas łączenia się chromosomów homologicznych w pary każdy z prawidłowych chromosomów danej pary łączy się ze swoim nieprawidłowym homologiem (produktem translokacji). Równocześnie homologiczne fragmenty obu chromosomów uczestniczących w translokacji też łączą się w parę, w wyniku czego powstaje czteroramienna konfiguracja chromosomów (ryc. 2.16). Po rozłączeniu się tej struktury w anafazie dochodzi do rozdzielenia dwóch chromosomów do jednej i dwóch do drugiej komórki potomnej (segregacja 2:2) lub też, co zdarza się rzadziej, trzech chromosomów do jednej komórki i jednego do drugiej (segregacja 3:1).

Wyróżnia się trzy typy rozdziału chromosomów. W rezultacie rozdziału naprzemiennego jedna komórka potomna (gameta) otrzymuje zrównoważoną translokację, druga zaś prawidłowe homologi chromosomów uczestniczących w translokacji. W przypadku rozdziału przyległego typów 1 i 2 wszystkie gamety są nieprawidłowe i zawierają duplikacje oraz delecje przegrupowanych fragmentów chromosomów, a zygoty mają tzw. częściowe trisomie i monosomie (patrz ryc. 2.16). W przypadku translokacji robertsonowskich w wyniku segregacji chromosomów mogą powstać gamety nullisomiczne i disomiczne względem danego chromosomu. Zygoty natomiast będą zawierały trisomie lub monosomie całych chromosomów (ryc. 2.17).

Inwersja jest to odwrócenie fragmentu chromatyny między dwoma miejscami złamań w chromosomie. Inwersja fragmentu jednego ramienia chromosomu jest określana jako paracentryczna. Gdy odwrócony fragment zawiera centromer (punkty złamań znajdują się w obu ramionach chromosomu), mówimy o inwersji pericentrycznej. Obecność inwersji zakłóca łączenie się w pary chromosomów homologicznych podczas mejozy. Odwrócony fragment chromosomu tworzy pętlę umożliwiającą kontakt między odpowiadającymi sobie (homologicznymi) regionami. W przypadku inwersji pericentrycznych crossing-over w obrębie pętli prowadzi do powstania chromosomów z duplikacjami i delecjami dystalnych (zewnętrznych) fragmentów chromosomu w stosunku do miejsc złamań. Rekombinacja w obrębie pętli utworzonej przez inwersję paracentryczną powoduje powstanie niestabilnych chromosomów dicentrycznych i acentrycznych (z dwoma centromerami lub bez centromeru) zawierających duplikacje i delecje (ryc. 2.18).

Izochromosomy to chromosomy składające się z dwóch identycznych (długich lub krótkich) ramion. Tworzą się w wyniku duplikacji jednego i delecji drugiego ramienia chromosomu. Mogą powstawać wskutek nieprawidłowego, poprzecznego podziału chromosomu w obrębie centromeru. U człowieka najczęściej stwierdza się izochromosom długich ramion chromosomu X występujący w zespole Turnera. Izochromosomy większości autosomów (z nielicznymi wyjątkami, jak izochromosomy krótkich ramion chromosomów 9, 12 oraz chromosomów akrocentrycznych) są letalne.

Delecja jest to utrata fragmentu chromosomu w wyniku jednego (terminalna) lub dwóch (interstycjalna) złamań chromosomu. Jak wspomniano wcześniej, aberracje te mogą powstać w rezultacie segregacji rodzinnej inwersji lub translokacji chromosomowej. Delecje występujące w określonych regionach chromosomów, odpowiedzialne za tzw. zespoły mikrodelecji, mają stałą lokalizację w obrębie tych regionów. Powstają w wyniku
nieprawidłowej rekombinacji DNA podczas mejozy – nieallelicznej rekombinacji homologicznej określanej też jako nierówny crossing-over. Uwarunkowana jest ona specyficzną architekturą genomu regionów zawierających tzw. LCR (ang. low copy repeats) o podobieństwie sekwencji > 95–97%. Produktem nieprawidłowej rekombinacji jest delecja i wzajemna duplikacja fragmentu genomu między dwiema sekwencjami LCR zorientowanymi w tym samym kierunku lub inwersja, gdy duplikony są ułożone w kierunku przeciwnym. Zespoły kliniczne uwarunkowane powstającymi w ten sposób rearanżacjami genomu są określane mianem chorób genomowych.

Duplikacja oznacza obecność dwóch kopii fragmentu chromosomu powstających najczęściej w wyniku translokacji, inwersji lub utworzenia izochromosomu. Duplikacje powstają także jako efekt nierównego crossing-over podczas mejozy. Występują jako powtórzenia proste (duplikacje tandemowe) lub odwrócone względem siebie (duplikacje odwrócone).

Rycina 2.16. Segregacja chromosomów z translokacją wzajemną w czasie I podziału mejotycznego

Rycina 2.17. Segregacja translokacji robertsonowskiej w czasie I podziału mejotycznego

Rycina 2.18. Konsekwencje crossing-over w inwersji paracentrycznej. Chromosom z inwersją tworzący pętlę oznaczono grubą kreską

Chromosomy pierścieniowe powstają w wyniku połączenia dwóch złamanych końców jednego lub kilku chromosomów. Towarzyszy temu powstanie delecji fragmentów chromosomu dystalnych w stosunku do miejsc złamań. Chromosomy pierścieniowe są niestabilne (ryc. 2.19). W czasie podziału mitotycznego, w wyniku wymiany między chromatydami siostrzanymi chromosomu pierścieniowego, powstaje dwukrotnie większy chromosom pierścieniowy dicentryczny. W anafazie ulega on najczęściej rozerwaniu lub wędruje w całości do jednego bieguna komórki. Następuje nierówne rozdzielenie materiału chromosomowego między komórki potomne.

Rycina 2.19. Zachowanie się chromosomu pierścieniowego podczas podziału mitotycznego komórki

Chromosomy dicentryczne zawierają dwa centromery i podobnie jak chromosomy pierścieniowe są niestabilne podczas podziału komórkowego. Powstają wskutek translokacji, inwersji, a także wymiany chromatyd siostrzanych lub chromatyd chromosomów homologicznych.

Inne aberracje

Chromosomy markerowe. Określenie to obejmuje wszystkie chromosomy, których pochodzenie i mechanizm powstania są nieznane. Chromosomy markerowe występujące konstytucyjnie są małe (przeważnie mniejsze niż chromosom 22) i występują zazwyczaj jako chromosomy dodatkowe. Mogą to być chromosomy meta- lub akrocentryczne, czasami mają strukturę pierścienia. Zawierają jeden lub dwa centromery, często wykazują obecność satelitów. Niestabilność mitotyczna chromosomów markerowych jest przyczyną stosunkowo częstego ich występowania w formie mozaikowej. Zawartość hetero- i euchromatyny decyduje o wpływie tych chromosomów na cechy fenotypu nosiciela.

Miejsca łamliwe. Są to miejsca w chromosomach, które wykazują zwiększoną częstość złamań i przerw (niebarwiących się miejsc) w warunkach częściowego zahamowania replikacji DNA. Opisano ponad 100 miejsc łamliwych, wśród których wyróżnia się, zależnie od częstości występowania w populacji, dwa podstawowe typy: pospolite (ang. common) i rzadko występujące (ang. rare). Każdą z tych grup dzieli się na klasy zależnie od warunków, które muszą być spełnione do ich cytogenetycznej ekspresji. Pełna lista miejsc łamliwych chromosomów człowieka znajduje się w Human Genome Database (GDB) (http://www.gdb.org/).

Wśród 31 rzadko występujących miejsc łamliwych tylko dwa zlokalizowane w chromosomie X, FRAXA w Xq27.3 i FRAXE w Xq28, mają w pełni udokumentowany związek z patologią (niepełnosprawnością intelektualną). Należą one do klasy folianowrażliwych miejsc łamliwych, tzn. takich, których warunkiem ekspresji cytogenetycznej jest niedobór kwasu foliowego i tymidyny w podłożu hodowlanym komórek (ryc. 2.20). Podłożem molekularnym łamliwości tych miejsc jest wydłużenie niestabilnych, trójnukleotydowych sekwencji DNA w obrębie genów odpowiedzialnych za chorobę (por. mutacje dynamiczne). W większości przypadków za wystąpienie zespołu łamliwego chromosomu X jest odpowiedzialne wydłużenie niestabilnej sekwencji (CGG)n w pierwszym eksonie genu FMR1 i metylacja pobliskiej wyspy CpG. Miejsce łamliwe FRAXA jest cytogenetycznym przejawem tego typu mutacji. Obecnie przypuszcza się także, że pospolite miejsca łamliwe, jako regiony szczególnie wrażliwe na zaburzenia replikacji DNA, uczestniczą w rozwoju procesu nowotworowego i niestabilności genomu w komórkach nowotworowych. Utrata heterozygotyczności i duże delecje w obrębie tych miejsc łamliwych [np. FRA3B (3p14.2) i FRA16D (16q23.2)] skutkują inaktywacją mapujących się w nich genów supresorowych (FHIT czy WWOX). Stwierdzano to w wielu typach nowotworów (płuc, nerek, przewodu pokarmowego, piersi, prostaty i innych).

Rycina 2.20. Obraz łamliwego chromosomu Xq27.3. Po lewej stronie chromosomy są wybarwione odczynnikiem Giemsy, natomiast po prawej techniką prążkowego barwienia GTG umożliwiającą identyfikację chromosomu X

Aberracje chromatydowe. Stanowią odrębną grupę aberracji, które z definicji, w odróżnieniu od aberracji typu chromosomowego, dotyczą uszkodzeń i zmian w pojedynczych chromatydach chromosomów. Powstają w czasie replikacji DNA lub po replikacji, tzn. w fazie S lub G2 cyklu komórkowego. W następnym cyklu (w komórkach potomnych) aberracje chromatydowe stają się aberracjami chromosomowymi. Wśród aberracji chromatydowych wyróżnia się miejsca niebarwiące się, tzw. przerwy chromatydowe (ang. gap) oraz złamania i wymiany chromatydowe (ryc. 2.21). Nie wchodząc w szczegółowe omawianie rozmaitych typów wymian, ogólnie można je podzielić na takie, które powstają między dwiema chromatydami jednego chromosomu, lub takie, które dotyczą chromatyd dwóch lub kilku chromosomów. Wymiany chromatyd między kilkoma chromosomami powodują powstanie charakterystycznych trójramiennych, czteroramiennych lub bardziej złożonych konfiguracji chromosomów. Jeśli dwa złamania prowadzące do wymiany powstaną w tym samym locus na obu chromatydach jednego chromosomu, są to wymiany chromatyd siostrzanych (ang. sister chromatid exchange, SCE). Mogą być one uwidocznione pod mikroskopem tylko po zastosowaniu specyficznych technik zróżnicowanego wybarwiania chromatyd siostrzanych chromosomu (ryc. 2.22).

Rycina 2.21. Przerwy, złamania i wymiany chromatydowe. Wymiany są widoczne jako specyficzne konfiguracje chromosomów. Aberracje chromatydowe zostały wywołane mitomycyną C w hodowli in vitro komórek chorego z zespołem Fanconiego

Rycina 2.22. Wymiany chromatyd siostrzanych (SCE)

Aberracje chromatydowe, w odróżnieniu od konstytucyjnych aberracji chromosomowych, należą do nabytych. Mogą powstawać pod wpływem różnych czynników mutagennych (np. promieniowania jonizującego, mutagenów chemicznych czy infekcji wirusowych). Stanowią też przedmiot badań cytogenetycznych w diagnostyce zespołów o genetycznie uwarunkowanej niestabilności chromosomów.

2.3.3. Polimorfizm

Wzajemne występowanie wykluczających się form strukturalnych jednego lub kilku chromosomów jest określane jako polimorfizm chromosomów. Na poziomie genu zmianami polimorficznymi określa się jednoczesne występowanie w populacji różnych form allelicznych danego genotypu. W świetle dzisiejszej wiedzy zmian polimorficznych nie pomija się przy rozpatrywaniu znaczenia klinicznego. Arbitralnie przyjęło się uważać za zmianę polimorficzną taki wariant, który w populacji występuje częściej niż w 1%. Polimorfizm może dotyczyć pojedynczego nukleotydu, powtarzającego się motywu sekwencji, a także liczby kopii fragmentu DNA.

Polimorfizm pojedynczego nukleotydu w sekwencji DNA określa się jako SNP (ang. single-nucleotide polymorphism). SNP najprościej wykrywa się, sekwencjonując DNA. Może być identyfikowany również z wykorzystaniem technik przesiewowych, takich jak SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), DGGE (ang. denaturing gradient gel electrophoresis) czy HRM (ang. high resolution melt). W szczególnych przypadkach, gdy SNP zlokalizowany jest w sekwencjach rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne, enzymy te mogą zostać zastosowane w jego wykrywaniu. Taki typ polimorfizmu jest określany jako zmienność długości fragmentów restrykcyjnych, RFLP[3] (ang. restriction fragment length polymorphism). Polimorfizm sekwencji minisatelitarnych oznacza się skrótem VNTR (ang. variable number of tandem repeats), a sekwencji mikrosatelitarnych SSLP lub STRP (ang. single sequence length polymorphism lub short tandem repeat polymorphism).

Polimorfizmy wszystkich typów są wykorzystywane jako fizyczne markery genetyczne. W genomie człowieka najmniejszą rozdzielczością charakteryzuje się RFLP. Wynika to ze stosunkowo niewielkiej liczby miejsc rozpoznawanych w cząsteczce ludzkiego DNA przez enzymy restrykcyjne. Polimorfizm ten jest dwualleliczny. Analiza RFLP znalazła stałe miejsce w badaniach molekularnych. W określonych przypadkach umożliwia różnicowanie sekwencji prawidłowych i zmienionych na skutek mutacji.

Duża zmienność liczby powtarzających się motywów powoduje, że minisatelity i mikrosatelity są doskonałymi markerami genetycznymi. Duża liczba alleli występujących w danym locus predysponuje ten typ polimorfizmu do analizy sposobu dziedziczenia się badanych genów.

Największe nadzieje w praktycznym wykorzystaniu markerów polimorficznych wiąże się z analizą SNP. Powodem tego jest liczba miejsc zmiennych w całym genomie, a nie, jak w przypadku mini- czy mikrosatelitów, liczba alleli w danym locus. Najczęściej spotykany jest polimorfizm dwualleliczny, rzadko trójalleliczny, natomiast prawdopodobieństwo wystąpienia czwartego allela w danym locus jest bliskie zera. Szacuje się, że w genomie człowieka jest około 3 milionów markerów typu SNP, co stanowi około 90% wszystkich różnic w sekwencji. Ocenia się, że ten typ polimorfizmu DNA jest mutacyjnie stabilniejszy niż polimorfizm sekwencji satelitarnych. Średnio SNP występuje 1 na 300–1000 pz. Gęstość i nasycenie SNP nie są jednak identyczne dla całego genomu. Obszarem, gdzie obserwuje się największe zagęszczenie, jest locus HLA na chromosomie 6. Z drugiej strony na chromosomie X zidentyfikowano „pustynie SNP”, tj. fragmenty, z których największy miał około 1,7 Mpz, gdzie nie wykryto żadnego SNP. Założeniem wykorzystania analizy SNP w badaniach jest równoczesna identyfikacja wielu tych markerów w dużych częściach lub wręcz w całym genomie, co umożliwia technologia oparta na mikromacierzach DNA. Planuje się np. wykorzystanie typowania SNP w prognozowaniu wystąpienia kompleksowych chorób cywilizacyjnych, takich jak astma, cukrzyca, migrena czy choroby serca. Zmiany genetyczne, w tym zmiany prowadzące do występowania chorób, zachodzą w określonym „tle genetycznym”. Jak wspomniano, analiza SNP umożliwia opisanie tego „tła”. Diagnostyka molekularna będzie w takich przypadkach polegać na określeniu osobistego, indywidualnego dla badanej osoby wzoru SNP i porównaniu go ze znanym wzorem SNP charakterystycznym dla danej choroby. Wiele tego typu informacji przynoszą badania populacyjne określane w literaturze anglosaskiej jako GWAS (ang. genome-wide association studies).

Wynik analizy SNP może w przyszłości stać się podstawą tworzenia genetycznych „wizytówek” człowieka (por. http://snp.cshl.org).

Nasza wiedza o organizacji genomu poszerzyła się o polimorfizm zmiennej liczby kopii fragmentów DNA. CNV (ang. copy number variation) obejmuje delecje i duplikacje fragmentów chromosomów. W genomie człowieka zidentyfikowano ponad 1500 regionów CNV i szacuje się, że stanowi to około 12% jego wielkości. Przypuszcza się też, że częstość występowania większości opisanych CNV w populacji nie przekracza kilku procent. Rozmieszczenie CNV w genomie nie wydaje się całkowicie przypadkowe i jest związane z jego strukturą. CNV, podobnie jak SNP i inne typy polimorfizmów sekwencji nukleotydowych, stanowi o osobniczym charakterze danego genomu (danej osoby), a niekiedy i grupy etnicznej. CNV może być dziedziczony z pokolenia na pokolenie, mieć charakter zmian somatycznych – tkankowo zależnych, może powstawać de novo. Polimorfizmowi typu CNV przypisuje się znaczenie w procesie ewolucji genomu w dużo większym stopniu niż np. mutacjom pojedynczych nukleotydów.

Wykazano, że CNV dotyczy około 15% genów, których mutacje mają znaczenie w patologii molekularnej znanych chorób genetycznie uwarunkowanych. Znanych jest obecnie szereg chorób „wrażliwych” na dawkę genu. Duplikacja genu LMNB1 jest odpowiedzialna za występowanie autosomalnie dominującej postaci leukodystrofii (ADLD), a przewlekłe zapalenie trzustki może być powodowane mutacją punktową w genie PRSS1 lub triplikacją tego genu. Rolę CNV wykazano w chorobie Charcota–Mariego–Tootha typu 1A, neurofibromatozie typu 1 czy w podatności na zakażenie wirusem HIV (liczba kopii genu CCL3L1 warunkuje stopień podatności na zakażenie). Wpływ CNV na obraz kliniczny choroby jest z kolei dobrze widoczny w przebiegu rdzeniowego zaniku mięśni (ang. spinal muscular atrophy, SMA). Choroba warunkowana jest najczęściej homozygotyczną delecją eksonu 7 genu SMN1. Modyfikatorem fenotypu SMA jest gen SMN2, którego liczba kopii w populacji kształtuje się od zera do sześciu. Im większa liczba genów SMN2, tym fenotyp SMA jest łagodniejszy (gen SMN2 odpowiada za około 15% aktywnego białka SMN). Wykazano również, że w populacjach, gdzie tradycyjnie dieta oparta jest (była) w dużym stopniu na spożyciu skrobi, liczba genów AMY1 obecną w ślinie α-amylazę jest średnio większa, niż w populacjach wykorzystujących inne składniki odżywcze. Występowanie CNV okazało się też charakterystyczne dla fragmentów subtelomerowych wielu chromosomów. W regionach tych mapuje się wiele rearanżacji mających znaczenie kliniczne.

Wydaje się, że często obserwowana asocjacja między występowaniem CNV i SNP a wariantami ekspresji danego genu może być modelowa dla chorób kompleksowych, takich jak schizofrenia, autyzm, choroba Parkinsona czy Alzheimera.

2.3.4. Relacje genotyp–fenotyp

Występowanie chorób dziedzicznych jest spowodowane mutacjami genu (genów). Na obraz kliniczny choroby składają się dodatkowo tok dziedziczenia, typ mutacji odpowiedzialnej za defekt genu, funkcja kodowanego przez gen polipeptydu, wzajemne relacje między białkami oraz wpływ genetycznych i środowiskowych modyfikatorów funkcji genu (ryc. 2.23).

Rycina 2.23. Zależność genotyp–fenotyp w ekspresji cech dziedzicznych

Przykłady zależności między rodzajem i lokalizacją mutacji w danym genie a obserwowanym fenotypem klinicznym można znaleźć w dystrofii typu Duchenne’a i Beckera. Większość mutacji w genie DMD ma charakter delecji. Gdy mutacje te są zlokalizowane na początku genu, obserwuje się występowanie dystrofii mięśniowej o bardzo ciężkim przebiegu (typu Duchenne’a). Delecje obejmujące końcowe odcinki genu DMD są odpowiedzialne za postać dystrofii przebiegającej znacznie łagodniej (typu Beckera).

Różnorodność cech fenotypowych obserwowanych w wielu chorobach uwarunkowanych genetycznie może być powodowana również funkcją danego genu zależną od tkanki, w której ulega on ekspresji. Taki mechanizm prawdopodobnie jest przyczyną występowania z jednej strony dziedzicznej choroby Hirschsprunga (defekt unerwienia odcinka jelita grubego), z drugiej zaś wielu zmian nowotworowych. W obu przypadkach pierwotny defekt jest umiejscowiony w tym samym genie RET (tab. 2.9).

Tabela 2.9. Przykłady różnych chorób dziedzicznych wywoływanych mutacjami w tym samym genie

Gen

Lokalizacja

Choroba

PAX3

2q35

– zespół Waardenburga

– mięśniak mięśni prążkowanych

RET

10q11.2

– rdzeniasty rak tarczycy typu 2A i 2B

– choroba Hirschsprunga

– postać rodzinna rdzeniastego raka tarczycy

SCN4A

17q23.1-q25.3

– paramiotonia wrodzona

– porażenie napadowe hipokaliemiczne

– miotonia wrodzona

PRNP

20p12-pter

– choroba Creutzfeldta-Jakoba

– śmiertelna rodzinna bezsenność

GNAS1

20q13.2

– osteodystrofia Albrighta

– zespół McCune’a-Albrighta

AR

Xcen-q22

– zespół niewrażliwości na androgeny

– choroba Kennedy’ego

Obserwowany obraz kliniczny określonej choroby dziedzicznej może być też funkcją mutacji różnych genów. Często towarzyszy temu szerszy aniżeli w chorobach jednogenowych zakres zmian klinicznych. Mutacje w wielotorbielowatości nerek mapują się w genie PKD1 umiejscowionym w chromosomie 16 i w genie PKD2 z chromosomu 4. Mniej więcej połowa przypadków rodzinnej postaci stwardnienia guzowatego jest sprzężona z genem TSC1 (9q34), a druga połowa z genem TSC2 umiejscowionym blisko genu PKD1. Podobnie zmienność objawów klinicznych w różnych postaciach kardiomiopatii przerostowej znajduje wytłumaczenie w występowaniu charakterystycznych dla tej choroby mutacji w kilku różnych loci (tab. 2.10).

Tabela 2.10. Niektóre geny, których mutacje prowadzą do kardiomiopatii przerostowej

Nazwa
genu

Kodowany
produkt

Lokalizacja
genu

Częstość przypadków
kardiomiopatii (%)

CMH1

łańcuch ciężki

β-miozyny

14q11

30

CMH2

troponina T

1q3

15

CMH3

α-tropomiozyna

15q2

3

CMH4

sercowe białko C

11p11.2

15

CMH7

troponina I

19p13.2-q13.2

< 1

Wg S.L. Chojnowskiej, Klinika Kardiologii Ogólnej Instytutu Kardiologii, Warszawa.

Heterogenność objawów klinicznych sprawia, że nomenklatura molekularna często nie odpowiada nazewnictwu przyjętemu w medycynie. Wykazano np., że defekt genu CFTR, charakterystyczny dla mukowiscydozy, stwierdza się także w niezależnie dotychczas klasyfikowanych chorobach, takich jak: obu- i jednostronna niedrożność przewodów nasiennych, przewlekłe zapalenie oskrzeli, rozstrzenie oskrzeli, przewlekłe zapalenie zatok obocznych nosa z polipowatością, kropidlakowe alergiczne odoskrzelowe zapalenie płuc. Infekcje bakteryjne, wiele schorzeń układu oddechowego czy też niedrożność przewodów nasiennych u mężczyzn są klasycznymi objawami mukowiscydozy. Wydaje się więc, że w opisanych przypadkach wielość objawów chorobowych jest przejawem zmienności na poziomie genu, a wymienione schorzenia należałoby klasyfikować raczej jako łagodne postaci mukowiscydozy lub choroby CFTR-zależne.

W niektórych chorobach dziedziczonych jako cecha autosomalna recesywna obserwuje się niekiedy pewne odstępstwa od tego kanonu dziedziczenia. Zaobserwowano bowiem występowanie cech klinicznych choroby również u nosicieli zmutowanego genu. U obligatoryjnych nosicieli mutacji w genie GALT czy GALK stwierdza się czasem występowanie zaćmy. U nosicieli braku α-1-antytrypsyny częściej niż w populacji ogólnej obserwuje się występowanie chorób płuc, a u niektórych nosicieli cystationurii obecność kamieni nerkowych. Być może za obserwowane zjawiska odpowiada zredukowanie u heterozygot ilości wytwarzanego białka. Wiadomo jednak, że np. w mukowiscydozie niespełna 10% prawidłowego mRNA jest zdolne do supresji defektu genu CFTR. Jak się wydaje, większość opisanych przypadków jest cechą osobniczą i wynika z nałożenia się zmian w innych genach, tzw. modyfikatorach. Ważną zmienną jest też wpływ środowiska. U nosicieli braku α-1-antytrypsyny występowanie niektórych objawów chorobowych ze strony układu oddechowego jest uzależnione np. od palenia papierosów.

Wpływ genów modyfikatorów często uwidacznia się dużą rozpiętością skali objawów klinicznych. Mukowiscydoza dziedziczy się jako cecha monogenowa, ale oddziaływania oligogenowe modyfikują obserwowany fenotyp choroby (ryc. 2.24).

Rycina 2.24. Schemat obrazujący możliwy wpływ drugorzędowych czynników genetycznych położonych poza genem CFTR, tzw. modyfikatorów, na obraz kliniczny mukowiscydozy. Współwystępowanie patogennych mutacji genu CFTR oraz poszczególnych wariantów molekularnych w obrębie genów modyfikatorów jest jednym z ważniejszych czynników odpowiedzialnych za znaczącą różnorodność przebiegu choroby, także u pacjentów z tym samym genotypem CFTR. Heterogenność fenotypowa dotyczy zarówno stopnia nasilenia zmian klinicznych i ich progresji w czasie, jak też różnych postaci choroby związanych z uszkodzeniem poszczególnych narządów i układów. Tekstem pochyłym zaznaczono nazwy genów. (Wg K. Czerskiej, Zakład Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka)

Do niedawna w rozważaniach genotyp–fenotyp tylko w niewielkim stopniu uwzględniano rolę, jaką może w nich odgrywać ncRNA. Jak się wydaje, defekty obejmujące tę klasę RNA, w przypadku ekspresji pewnej klasy genów, mogą mieć znaczenie decydujące (por. wyciszanie ekspresji genów).

2.3.4.1. Recesywność i dominacja

Wprowadzenie rozróżnienia cech na recesywne i dominujące zawdzięczamy Mendlowi. Gdy allele genu różnią się między sobą i jeden z nich dominuje, to on określa fenotyp. Taki układ alleli jest nazywany heterozygotycznym. Układ, w którym spotykają się dwa identyczne allele, określa się jako homozygotyczny, niezależnie od tego, czy tworzą go dwa allele dominujące (homozygota dominująca), czy dwa allele recesywne (homozygota recesywna, ryc. 2.25).

Rycina 2.25. Schemat zależności między dominacją alleli a fenotypem osobnika. (Wg A.O.M. Wilkie, J. Med. Genet. 1994, 91, 89)

Zjawisko recesywności/dominacji zakłada ekspresję dwóch alleli tego samego genu. Jak się obecnie szacuje, około 90% wszystkich znanych mutacji to mutacje odpowiedzialne za powstanie alleli recesywnych. Powstający w takim przypadku produkt zmutowanego genu ma z reguły charakter neutralny, jest nieaktywny, lub też brak go częściowo bądź całkowicie. Konsekwencją odziedziczenia zmutowanych alleli recesywnych danego genu (jednego od ojca, drugiego od matki) jest wystąpienie choroby dziedziczącej się w sposób recesywny. Wyjątkiem jest ujawnianie się alleli recesywnych u osób płci męskiej, gdy gen jest położony w chromosomie X (tzw. hemizygota).

Mutacje dominujące rzadko występują w stanie homozygotycznym. Prawdopodobnie taki genotyp jest najczęściej letalny dla organizmu. Do nielicznych wyjątków należy hipercholesterolemia rodzinna.

Dominująca jest mutacja prowadząca do zwiększenia dawki genu, jak to występuje podczas zmiany liczby kopii z 2 na 3 w zespole Downa czy w innych trisomiach u człowieka. Efekt dominujący może mieć niekiedy także redukcja dawki genu. Przykładem są sytuacje, w których produkt danego genu jest w dużej ilości niezbędny dla organizmu, jak np. w syntezie kolagenu, globiny czy receptora LDL. Wystąpienie choroby jest w tym przypadku efektem obniżenia się poziomu białka poniżej pewnej niezbędnej dla organizmu dawki progowej.

Gdy białko funkcjonuje jako multimer, zmiana nawet jednej podjednostki może prowadzić do zmiany funkcji całego kompleksu. Efekt dominacji obserwuje się także, gdy zmutowane białko jest toksyczne dla organizmu, czy też uzyskuje nową funkcję, jak np. w jednej z mutacji w genie kodującym α-1-antytrypsynę. Mutacja ta przez zmianę miejsca katalitycznego nadaje białku aktywność antytrombiny. Innym przykładem jest powstanie nowego białka na skutek translokacji chromosomów 9 i 22 i utworzenie genu fuzyjnego ABL-BCR.

Obserwowanym niekiedy zjawiskiem jest brak jednoznacznej dominacji jednego z alleli. Efektem tego jest współdziałanie w tworzeniu nowego fenotypu równocześnie obu alleli, czyli kodominacja.

Poznanie mechanizmu dominacji (recesywności) danej cechy na poziomie molekularnym jest ważne dla zrozumienia ekspresji klinicznej choroby, a także z punktu widzenia ewentualnej terapii genowej. Inne sposoby postępowania przewiduje się w leczeniu chorób o dziedziczeniu dominującym, a inne – recesywnym.

2.3.4.2. Antycypacja

Antycypacja lub wyprzedzenie to zjawisko cięższego (ostrzejszego) przebiegu chorób, z wcześniejszymi objawami, w kolejnych pokoleniach. Zjawisko to opisano na początku XX wieku, do niedawna jednak nie uważano za związane z podłożem genetycznym chorób, w których je obserwowano, lecz jedynie za wynik zmian środowiskowych lub selekcji sprzyjającej nielosowemu doborowi badanych przypadków. Zjawisko to trudno wytłumaczyć na gruncie klasycznej genetyki mendlowskiej, jednakże dobrze tłumaczy je obserwowana niestabilność sekwencji mikrosatelitarnych, stanowiąca jego podłoże molekularne.

Antycypację opisano w dziedziczeniu większości chorób neurogenetycznych powodowanych mutacjami dynamicznymi. Charakterystyczne jest, że występowanie ostrzejszych postaci schorzeń jest uzależnione od tego, od którego z rodziców mutacja dynamiczna została odziedziczona. W przypadku chorób powodowanych niestabilnymi sekwencjami (CAG)n w otwartej ramce odczytu, jak np. w chorobie Huntingtona, antycypacja prowadząca do postaci młodzieńczej/dziecięcej występuje wówczas, gdy choroba jest przekazywana przez ojca. Jest to wynikiem dużej niestabilności tych sekwencji w spermatogenezie.

W przypadku chorób powodowanych niestabilnymi sekwencjami położonymi poza otwartą ramką odczytu, np. (CTG)n w 3´ UTR genu w dystrofii miotonicznej, antycypacja prowadząca w formie najostrzejszej do wrodzonej postaci DM występuje w dziedziczeniu mutacji od matki. W przypadku dziedziczenia odojcowskiego w DM i SCA8 stwierdza się natomiast zjawisko kontrakcji – wyraźnego zmniejszenia, w pewnych przypadkach, liczby powtórzeń chorobotwórczych. Jest to najprawdopodobniej wynikiem negatywnej selekcji silnie wydłużonych sekwencji na etapie spermatogenezy.

Zjawisko antycypacji obserwuje się również w chorobach Parkinsona, Alzheimera, zespole Blaua, raku okrężnicy, raku piersi, gośćcu stawowym i wielu innych (tab. 2.11). Wykluczono, aby za antycypację w schizofrenii była odpowiedzialna ekspansja trójnukleotydowych powtórzeń. Wydaje się jednak prawdopodobne, że antycypacja w tym przypadku może być powodowana niestabilnością innego typu sekwencji nukleotydowej. Przykładem tego typu zmian może być defekt w genie CSTB kodującym cystationinę B, odpowiedzialny za występowanie padaczki mioklonicznej (EPM1). U chorych z tym zespołem wykazano w nieulegającym translacji rejonie 5’ ekspansję 12-nukleotydowej sekwencji CCCCGCCCCGCG.

Tabela 2.11. Przykłady antycypacji w chorobach genetycznie uwarunkowanych

Nazwa choroby

Wiek pojawienia się objawów klinicznych (w latach)

Liczba badanych przypadków

rodzice

dzieci

różnica wieku

Dystrofia miotoniczna

38

15

23

51

Choroba Huntingtona

41

32

9

153

Choroby psychiczne (łącznie)

50

34

16

1728

Choroba Charcota-Mariego-Tootha

24

19

5

86

Jaskra dziedziczna

42

30

12

113

C. Stern, Podstawy genetyki człowieka, PZWL, Warszawa 1967.

2.3.5. Priony

Choroby prionowe zalicza się do dużej grupy tzw. chorób konformacyjnych. W skład tej grupy wchodzą również takie choroby jak choroba Alzheimera, Parkinsona czy Huntigtona, a także inne choroby neurodegeneracyjne ujawniające się w późnym okresie życia. Ich wspólną cechą jest zaburzenie w zwijaniu białek, co na terenie komórki przejawia się tendencją do tworzenia agregatów.

Choroby wywoływane przez priony (ang. proteinaceous infectious particles, prion) charakteryzują się zmianami degeneracyjnymi w obrębie ośrodkowego układu nerwowego. Ze względu na widoczne ubytki w tkance mózgowej często są określane jako encefalopatie gąbczaste. Przyczyną chorób jest defekt w glikoproteinie błonowej występującej głównie w tkance nerwowej, tzw. białku prionowym. Choroby wywołane przez priony są równocześnie zakaźne i dziedziczne. Ta dwoista natura oraz to, że w materiale zakaźnym nie znajdowano kwasów nukleinowych mimo sugestii, iż priony mogą być czynnikiem infekcyjnym podobnym do wirusów, długo pozostawały niewyjaśnione.

Dziedziczne postacie chorób prionowych stanowią około 10–15% wszystkich zachorowań tego typu. Wywołane są mutacjami w genie PRNP. Do chwili obecnej zidentyfikowano kilkadziesiąt różnych mutacji. Gen PRNP jest umiejscowiony w chromosomie 20 i koduje białko o wysoce konserwatywnej strukturze, złożone z około 250 aminokwasów. Funkcja białka nie jest znana. Sugeruje się jego udział w stabilizacji komórek mózgowych oraz w regulacji rytmu snu i czuwania. Nowsze badania wskazują na rolę ochronną osłonek neuronów. Wydaje się, że przejście białka kodowanego w genie PRNP w formę prionu wiąże się głównie ze zmianą jego konformacji. Zmiana ta nie musi być koniecznie wynikiem mutacji. Cechą białka prionowego jest przekształcanie, na swoje podobieństwo, białek powstałych w wyniku ekspresji genu PRNP. Mamy tu więc do czynienia ze swoistym efektem domina. Wystarczy pojedyncza cząsteczka prionu, aby pozostałe białka PRNP przyjęły z czasem konformację prionu. Nie wiadomo, w jaki sposób priony powodują uszkodzenie mózgu. Obserwuje się jedynie ich formowanie i odkładanie w postaci płytek, podobnie jak w chorobie Alzheimera.

Opisano cztery choroby prionowe człowieka: kuru, chorobę Creutzfeldta-Jakoba (CJD), zespół Gerstmanna-
-Strausslera-Scheinkera i śmiertelną rodzinną bezsenność. Są to choroby występujące niezwykle rzadko. Kuru stwierdzono jedynie w Nowej Gwinei. Jej „poziome” przekazywanie wśród członków plemienia Fore kojarzone jest z rytualnym kanibalizmem. CJD występuje z częstością 1 na milion. Większą częstość zachorowań stwierdza się jedynie wśród Żydów libijskich. Znany jest natomiast we Francji przypadek nieumyślnego przeniesienia tej choroby na dzieci leczone hormonem wzrostu otrzymanym z przysadek mózgowych osób zmarłych na CJD. Zespół Gerstmana-Stausslera-Scheinkera zidentyfikowano w kilkudziesięciu rodzinach na świecie, a śmiertelną dziedziczną bezsenność w kilku. Wszystkie choroby prionowe dziedziczą się w sposób dominujący. Są nieuleczalne.

Choroby prionowe występują również u zwierząt. Najwcześniej opisaną chorobą (1732 r.) jest scrapie występująca u owiec i kóz. Zakażenia międzygatunkowe są tym łatwiejsze, im większe jest podobieństwo w sekwencji aminokwasów białka prionowego.

Na przełomie lat osiemdziesiątych i dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku w Wielkiej Brytanii stwierdzono kilkanaście przypadków zachorowań na nowy, nieznany do tej pory wariant choroby CJD. Uważa się, że jest on ludzką odmianą tzw. choroby wściekłych krów (ang. bovine spongiform encephalopathy, BSE) i został przeniesiony na człowieka w wyniku spożywania mięsa (przetworów mięsnych) krów z BSE. Przypadki BSE wykryto w wielu krajach europejskich. Choroba wściekłych krów jest chorobą prionową. Źródła zachorowań poszukuje się w skarmianiu bydła mączką mięsno-kostną wytwarzaną między innymi z owiec chorych na scrapie. Zaskoczeniem było pokonanie bariery międzygatunkowej przez niewielkie, jak się sądzi, dawki prionów. W Wielkiej Brytanii w latach 1995–2008 na odzwierzęcą postać CJD zmarło ponad 160 osób. Średni wiek zachorowania wynosił 27 lat. Spośród testowanych wszyscy mieli identyczne zmiany w pozycji 129 genu PRNP. Czy przypadki zachorowań będą się pojawiać w kolejnych latach, czy też miały charakter lokalny, trudno obecnie powiedzieć. Badanie i poznanie chorób prionowych oraz ewentualnych czynników (tło genetyczne) sprzyjających ich powstawaniu jest metodycznie trudne i wyników nie można się spodziewać zbyt szybko.

Piśmiennictwo uzupełniające

Bereta J., Koj A, Zarys biochemii, Seria Wydawnictwa Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2009.

Brown T.A, Genomy, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009.

Epstein R.J., Biologia molekularna człowieka, Wydawnictwo Czelej, Lublin 2006.

Genetyka molekularna, red. nauk. P. Węgleński, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2008.

Klug W.S., Cummings M.R., Spencer C.A., Essential of genetics, wyd. 6, Person, Prentice Hall 2007.

Krebs J.E., Goldstein E.S., Kilpatrick S.T., Lewin’s Genes X, Oxford University Press, Oxford–New York–Tokyo 2010.

Miller O.J., Therman E., Human chromosomes, Springer Verlag, New York 2001.

Passarqe E., Genetyka. Ilustrowany przewodnik, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2004.

Prusiner S.B., Biology and genetics of prions causincy neurodegeneration, Annu. Rev. Genet. 2013, 47: 601–623.

The 1000 genomes project consortium. A global reference for human genetic variation, Nature 2015, 526: 68–74.

Strachan T., Read A.P., Human molecular genetics, wyd. 5, Garland Sciences 2018.

Turner P.C., McLennan A.G., Bates A.D., White M.R.H., Krótkie wykłady. Biologia molekularna, wyd. 2, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2004.

Watson J.D., Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R., Molecular Biology of the Gene, wyd. 5, Benjamin Cummings/Cold Spring Harbor Laboratory Press 2004.

Wilson J., Hunt T., Molecular biology of the cell, wyd. 5, Garland Science, Taylor and Francis Group 2005.

3 Uwarunkowanie genetyczne chorób dziedzicznych Jerzy Bal, Tadeusz Mazurczak

O chorobach dziedzicznych mówi się wtedy, gdy choroba spowodowana przez mutację jednego bądź więcej genów lub też aberrację chromosomową jest przekazywana w rodzinie w kolejnym pokoleniu. Swoistym wyjątkiem są mutacje powstające de novo, odpowiedzialne za wystąpienie choroby, które nie są przekazywane następnym pokoleniom ze względu na letalność lub uniemożliwienie prokreacji. Zmiany w DNA zostają wniesione wraz z gametami rodziców bądź też (jako mutacje) następują we wczesnych podziałach zygoty.

Przyjmuje się, że częstość występowania w populacji określonej choroby dziedzicznej zależy od częstości występowania mutacji odpowiedzialnej za tę chorobę i statusu jej dziedziczenia (tab. 3.1). Szacuje się np., że co 23. osoba w Polsce jest nosicielem zmutowanego allela genu CFTR, którego mutacje w obu allelach warunkują wystąpienie mukowiscydozy. Natomiast częstość występowania tej choroby w populacji wynosi około 1 na 2500 żywo urodzonych.

Niekiedy ryzyko wystąpienia choroby uwarunkowanej genetycznie jest większe od populacyjnego. W pierwszym rzędzie dotyczy to tzw. rodzin ryzyka genetycznego, to znaczy rodzin, w których poprzednio zanotowano wystąpienie określonej choroby dziedzicznej, a także małżeństw między krewnymi. W przypadku niektórych defektów genetycznych wzrost częstości ich występowania jest zależny od wieku rodziców, głównie matki (np. zespół Downa).

Zwiększonej częstości schorzeń genetycznych należy również oczekiwać w sytuacjach, gdy przyszli rodzice są narażeni na wpływ identycznych lub podobnych czynników mutagennych.

W pewnych populacjach niektóre choroby genetycznie uwarunkowane występują częściej niż w innych (tab. 3.2). Odrębność takiej populacji może niekiedy wynikać z barier geograficznych lub też być spowodowana izolacją danej społeczności ze względu na odmienność etniczną, kulturową lub religijną.

Problemy wczesnej diagnostyki chorób genetycznych, a także poszukiwanie metod skutecznej ich terapii stanowią jedno z ważniejszych zagadnień współczesnej medycyny. W szczególny sposób dotyczą one pediatrii, ponieważ ogromna większość, bo blisko 90%, chorób jednogenowych ujawnia się klinicznie przed okresem dojrzewania płciowego. To lekarz pediatra jest zazwyczaj tym specjalistą, który pierwszy rozpoznaje lub podejrzewa chorobę genetyczną u dziecka, identyfikując tym samym rodzinę ryzyka.

Mimo że choroby dziedziczące się jednogenowo są chorobami stosunkowo rzadko rozpoznawanymi, dotyczą one jednak około 1% noworodków żywo urodzonych i są odpowiedzialne za około 7% martwych urodzeń i zgonów w okresie okołoporodowym (tab. 3.3). Stanowią też ponad 70% przyczyn hospitalizacji w szpitalach dziecięcych, przy czym znakomita ich większość to choroby przewlekłe, których leczenie pochłania około 80% środków finansowych szpitala. Stwierdza się także na przestrzeni ostatnich dziesięcioleci istotny wzrost udziału chorób dziedziczących się jednogenowo w kształtowaniu wskaźnika zgonów niemowląt. Wynosił on 2% na początku stulecia, a w latach pięćdziesiątych osiągnął 12%. Wzrost ten jest spowodowany przede wszystkim zmniejszeniem odsetka zgonów niemowląt z powodu chorób infekcyjnych oraz lepszą wykrywalnością chorób dziedzicznych, a nie rzeczywistym wzrostem częstości ich występowania.

Tabela 3.1. Przykłady uwarunkowanych genetycznie chorób jednogenowych

Choroba

Częstość na 1000 urodzeń

Główne objawy kliniczne

dziedziczenie autosomalne recesywne

Mukowiscydoza

0,5

przewlekła choroba płuc (infekcje), zaburzenia łaknienia, wyniszczenie

Fenyloketonuria

0,2

niepełnosprawność intelektualna

Brak α-1-antytrypsyny

0,11

upośledzenie funkcji wątroby, rozedma płuc

Galaktozemia

0,02

upośledzenie rozwoju psychoruchowego oraz funkcji wątroby

Choroba Taya-Sachsa

0,004

upośledzenie umysłowe, ślepota

dziedziczenie autosomalne dominujące

Hipercholesterolemia rodzinna

2,0

choroba niedokrwienna serca, zawał serca w młodym wieku, wczesny zgon

Wielotorbielowatość nerek

0,8

powiększenie nerek, objawy postępującej niewydolności nerek

Choroba Huntingtona

0,1

ruchy pląsawicze, postępująca degradacja intelektualna

Achondroplazja

0,2

karłowatość nieproporcjonalna, skrócenie kończyn, duża głowa

dziedziczenie sprzężone z płcią

Dystrofia Duchenne’a i Beckera

0,14 (chłopcy)

postępujące upośledzenie funkcji ruchowych mięśni, kaczkowaty chód, trudności w podnoszeniu się z pozycji leżącej i w chodzeniu po schodach

Hemofilia A 

0,1 (chłopcy)

epizody krwawienia

Zespół FraX

0,5 (chłopcy)

0,3 (dziewczynki)

niepełnosprawność intelektualna, cechy dysmorfii twarzy, makroorchidyzm u mężczyzn po okresie dojrzewania

Tabela 3.2. Choroby genetycznie uwarunkowane charakterystyczne dla grupy etnicznej

Grupa etniczna

Nazwa choroby

Afrykańczycy (czarni)

hemoglobinopatie HbSC, α- i β-talasemia, brak dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej

Żydzi aszkenazyjscy

choroba Taya-Sachsa, choroba Gauchera, choroba Niemanna-Picka, zespół Blooma, zespół Canavana, rodzinna dyzautonomia

Chińczycy

α-talasemia, brak dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej

Eskimosi

wrodzony przerost nadnerczy

Finowie

nerczyca wrodzona

Kanadyjczycy pochodzenia francuskiego

tyrozynemia typu I, choroba Taya-Sachsa

Europejczycy (biali)

mukowiscydoza, fenyloketonuria

Tabela 3.3. Szacunkowe częstości występowania chorób genetycznych

Rodzaj uwarunkowania

Liczba chorób

Częstość na 1000 żywych urodzeń

Chromosomowe

> 600

9

Jednogenowe

autosomalne dominujące

autosomalne recesywne

sprzężone z X recesywne

4458

1730

412

20

2

2

Wieloczynnikowe

wady rozwojowe

choroby przewlekłe dorosłych

> 50

> 50

6

10

Mitochondrialne

59

rzadkie

Mutacje komórek somatycznych*

>100

250

Wg J.M. Connora, M.A. Ferguson-Smitha, Podstawy genetyki medycznej. PZWL, Warszawa 1991, 1998 oraz uzupełnienia. Por. rozdz. 15 Epidemiologia chorób genetycznie uwarunkowanych.

* Choroby uwarunkowane mutacjami komórek somatycznych powstają po urodzeniu i występują u około 25% osób dorosłych.

Diagnostyka biochemiczna chorób genetycznie uwarunkowanych obejmowała do niedawna tylko tę część chorób dziedziczących się jednogenowo, w których jest znany produkt genu. W praktyce dotyczyła diagnostyki, w tym także prenatalnej, ponad 100 wrodzonych błędów metabolicznych. Nie miała więc zastosowania w większości chorób, w których diagnostyka jest oparta wyłącznie na obrazie klinicznym, a prawdopodobieństwo defektu genu określa się przez analizę rodowodu, znajomość dziedziczenia choroby oraz częstość jej występowania w populacji. W przypadku badań prenatalnych diagnostyka biochemiczna ograniczała się do możliwości stwierdzenia bloku metabolicznego w hodowli amniocytów lub analizy poziomu białek, które przeniknęły do płynu owodniowego.

Obserwowany od połowy lat siedemdziesiątych ubiegłego wieku szybki rozwój biologii molekularnej przyczynił się w istotnym stopniu do lepszego zrozumienia patomechanizmu wielu chorób uwarunkowanych genetycznie. Metody analizy DNA znajdują praktyczne zastosowanie w diagnostyce klinicznej licznych chorób genetycznych, a możliwości ich wykorzystywania są jednym z głównych elementów określających poziom nowoczesności diagnostycznej ośrodków klinicznych.

Zastosowanie metod cytogenetycznych i molekularnych w diagnostyce klinicznej umożliwia, pośrednio lub bezpośrednio, wykazanie obecnościnieprawidłowego genu u chorego i członków jego rodziny. Bardzo często istnieje również możliwość identyfikacji mutacji odpowiedzialnych za defekt genu. Lista chorób, które można już obecnie rozpoznawać, wykorzystując techniki analizy DNA, obejmuje ponad 3000 jednostek chorobowych (http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php). Wśród nich można wymienić takie jak: niedobór α-1-antytrypsyny, jeden z typów zespołu Ehlersa-Danlosa, dystrofię mięśniową typu Duchenne’a i Beckera, niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, hemofilie A i B, chorobę Huntingtona, fenyloketonurię, niedokrwistość sierpowatokrwinkową, talasemię, mukowiscydozę, rdzeniowy zanik mięśni, dziedziczne postaci głuchoty.

Zakres zastosowań metod analizy DNA obejmuje te obszary zainteresowań klinicysty, w których współczesne metody diagnostyczne oparte na klasycznych technikach, takich jak analiza enzymatyczna lub immunologiczna produktu genu, nie rozwiązują wszystkich problemów związanych z procesem diagnostycznym. Stała się też możliwa identyfikacja bezobjawowych klinicznie nosicieli zmutowanego genu. Omawiany typ diagnostyki obejmuje swoim zakresem także takie schorzenia jak choroba Huntingtona, której objawy ujawniają się dopiero u osób dorosłych. Analiza DNA dla wielu chorób genetycznie uwarunkowanych stała się już obecnie postępowaniem diagnostycznym z wyboru.

W najbliższych latach diagnostyka molekularna będzie się koncentrować na określaniu predyspozycji genetycznych. Identyfikowane będą „zapisane” w genach predyspozycje do zapadalności na choroby serca, choroby neurologiczne, chorobę Alzheimera czy wręcz dane o procesie starzenia się. Uzyskiwane informacje umożliwią także świadomą eliminację tych czynników ryzyka, które przynajmniej częściowo są odpowiedzialne za ujawnianie się określonych fenotypów (nieodpowiednia dieta, rodzaj aktywności zawodowej, palenie papierosów, picie alkoholu itp.). Poznanie pełnej sekwencji nukleotydów genomu jądrowego człowieka przyspieszyło, poza diagnostyką chorób dziedzicznych, wykrywanie również takich zmian w DNA, które mogą być pomocne w ocenie wczesnego ryzyka wystąpienia określonej choroby genetycznej, a także kontrolę członków rodzin ryzyka genetycznego. Analiza markerów molekularnych daje też szansę prognozowania przebiegu chorób, a niekiedy umożliwia wybór odpowiedniej ich terapii. Największe nadzieje towarzyszą jednak możliwości wprowadzenia somatycznej terapii genowej.

Możliwości skutecznego leczenia chorób genetycznych są ograniczone i dotyczą tylko nielicznych jednostek chorobowych. Stwierdzane w większości przypadków objawy upośledzenia rozwoju fizycznego i umysłowego określają nie tylko medyczną, lecz także społeczną skalę problemu.

Istotnym zagadnieniem jest problem poradnictwa genetycznego w rodzinach, w których wystąpiła choroba zależna od mutacji genowej dziedziczącej się zgodnie z prawami Mendla. Niestety, nie zawsze rodziny te uzyskują odpowiednią informację o wielkości ryzyka genetycznego w ośrodkach medycznych ustalających rozpoznanie choroby. Z powyższych względów zagadnienie wczesnej i precyzyjnej diagnostyki choroby staje się problemem o istotnym znaczeniu zarówno dla lekarzy, organizatorów służby zdrowia, jak i rodzin ryzyka genetycznego.

Zasady dziedziczenia

Sformułowane w 1866 r. przez Grzegorza Mendla dwa prawa określają podstawowe, obowiązujące w genetyce zasady dziedziczenia się cech. Swoje doświadczenia Mendel prowadził na grochu, roślinie diploidalnej, dlatego badane przez niego cechy, jak u większości organizmów eukariotycznych, były warunkowane przez pary alleli.

Pierwsze prawo Mendla stwierdza, że do tworzącej się gamety trafia po jednym allelu z danej pary. Drugie prawo określa sposób dziedziczenia się alleli wielu genów i zgodnie z nim segregacja alleli takich genów jest niezależna od siebie. Tworzące się w gametach kombinacje alleli różnych genów są zatem przypadkowe, ale z danej pary do gamety może trafić tylko jeden allel.

Swoje osiągnięcia Mendel zawdzięcza między innymi temu, że do badań wybrał cechy warunkowane allelami tej samej pary genów, a także to, że obserwował przekazywanie odmiennych cech dziedziczonych w sposób niezależny jedna od drugiej. Klasycznym przykładem odstępstwa od mendlowskiej zasady niezależnej segregacji jest sprzężenie genów. Wyjątkami są również dziedziczenie związane z chromosomem X oraz dziedziczenie wieloczynnikowe. Odmienne od mendlowskiego jest dziedziczenie cech warunkowanych mutacjami w DNA mitochondrialnym, a także zakaźny sposób przekazywania chorób prionowych, jeden z dwóch mechanizmów odpowiedzialnych za występowanie tych chorób. Opisano także liczną grupę chorób genetycznie uwarunkowanych, w których ekspresja fenotypowa danej cechy, chociaż dziedziczy się w sposób mendlowski, zależy od matczynego lub ojcowskiego pochodzenia danego genu (rodzicielskie piętno genomowe). Nadinterpretacją jest jednak zaliczenie tych ostatnich przypadków do wyjątków od praw dziedziczenia.

Sposób dziedziczenia danej cechy jest uzależniony od położenia genu, który ją warunkuje. Gdy gen jest umiejscowiony w jednym z autosomów, mówimy o dziedziczeniu autosomalnym, gdy w chromosomie X – o dziedziczeniu sprzężonym z płcią. W dziedziczeniu wieloczynnikowym bierze udział wiele loci, które mogą być położone w różnych chromosomach. O dziedziczeniu mitochondrialnym mówimy wtedy, gdy dany gen jest umiejscowiony w genomie mitochondrialnym.

Przyjęty w książce zapis symboli genetycznych jest powszechnie stosowany w piśmiennictwie z tego zakresu (ryc. 3.1).

Rycina 3.1. Symbole stosowane w konstrukcji rodowodów. Pokolenia oznacza się cyframi rzymskimi, osoby w danym pokoleniu – arabskimi

3.1. Dziedziczenie autosomalne recesywne

W dziedziczeniu autosomalnym recesywnym choroba lub cecha ujawnia się tylko u homozygot. Zmutowany allel recesywny nie ujawnia się w obecności prawidłowego dominującego allela. Szacuje się, że każda zdrowa osoba jest nosicielem co najmniej kilku lub kilkunastu zmutowanych alleli recesywnych, nieujawniających się fenotypowo.

Wiele cech jest charakterystycznych dla chorób dziedziczących się autosomalnie recesywnie (tab. 3.4, ryc. 3.2).

Tabela 3.4. Cechy dziedziczenia autosomalnego recesywnego

Objawy choroby ujawniają się u osób obojga płci

Oboje rodzice chorego dziecka są bezobjawowymi klinicznie heterozygotami (nosicielami) pod względem zmutowanego genu

Ryzyko ponownego urodzenia chorego dziecka jest zawsze duże i wynosi ¹/₄ (25%). Jest ono stałe, niezależne od liczby posiadanych już przez to małżeństwo zdrowych i/lub chorych dzieci

Prawdopodobieństwo, że każde ze zdrowego rodzeństwa chorego dziecka jest heterozygotą (nosicielem mutacji) wynosi ²/₃

Jeśli choroba (lub cecha) występuje w populacji rzadko, istnieje duże prawdopodobieństwo pokrewieństwa między rodzicami chorego

Defekt alleli danego genu, osoby chorej, może być spowodowany mutacjami tego samego lub różnego typu

Wszystkie dzieci osoby chorej będą nosicielami mutacji genowej (heterozygotami)

Rycina 3.2. Rodowód ilustrujący sposób dziedziczenia autosomalny recesywny

Ponieważ choroby o tym typie dziedziczenia występują zazwyczaj wśród rodzeństwa, a bardzo rzadko u innych członków rodziny, mówimy o „poziomym rozkładzie chorych” w rodowodach rodzin obciążonych chorobami autosomalnymi recesywnymi.

W coraz liczniejszej grupie chorób heterozygoty mogą być identyfikowane na podstawie specjalistycznych testów diagnostycznych.

3.2. Dziedziczenie autosomalne dominujące

Większość chorób o typie dziedziczenia autosomalnym dominującym jest wynikiem świeżej mutacji i żadne z rodziców chorego dziecka nie wykazuje objawów choroby (tab. 3.5, ryc. 3.3). Jeśli zmutowany gen jest odziedziczony od jednego z rodziców, to rodzic ten jest zawsze (lub prawie zawsze) chory.

Tabela 3.5. Cechy dziedziczenia autosomalnego dominującego

Choroba ujawnia się u heterozygot. Stan homozygotyczności dla genu dominującego występuje bardzo rzadko; zazwyczaj jest to wtedy bardzo ciężka lub wręcz śmiertelna postać choroby

Prawdopodobieństwo przekazania nieprawidłowego genu potomstwu wynosi ¹/₂ (50%). Duże ryzyko przekazania choroby jest stałe i nie zależy od liczby posiadanych już zdrowych i/lub chorych dzieci

Rycina 3.3. Rodowód ilustrujący autosomalny dominujący sposób dziedziczenia

Do cech specyficznych występujących w chorobach autosomalnych dominujących należą:

– zmienna ekspresja (chorzy w tej samej rodzinie wykazują różne nasilenie objawów choroby);

– niepełna penetracja (cechy fenotypowe choroby mogą być nieobecne, mimo że osoba jest nosicielem mutacji genowej);

– mozaikowość germinalna (obecność zmutowanych genów tylko w części komórek gonad jednego z rodziców; efektem tego może być urodzenie się kolejnych chorych dzieci z małżeństwa klinicznie zdrowych osób).

3.3. Dziedziczenie sprzężone z chromosomem X

W patologii człowieka choroby dominujące sprzężone z chromosomem X występują rzadko. Cechy charakterystyczne dla dziedziczenia się tej grupychorób podano w tabeli 3.6.

Tabela 3.6. Cechy charakterystyczne dla dziedziczenia sprzężonego z chromosomem X

Dziedziczenie dominujące sprzężone z chromosomem X

Nosiciele zmutowanego genu umiejscowionego w chromosomie X, zarówno mężczyźni, jak i kobiety, wykazują objawy choroby (ryc. 3.4). Chorzy mężczyźni są hemizygotami (mają jeden chromosom X), natomiast chore kobiety mają prawidłowy allel
na drugim chromosomie X, więc choroba u mężczyzn ma znacznie cięższy przebieg i często jest śmiertelna

Heterozygotyczne kobiety mają 50% szans przekazania zmutowanego genu zarówno córce, jak i synowi

Hemizygotyczni chorzy mężczyźni przekazują zmutowany gen wszystkim córkom, nigdy synom

Częstość występowania mutacji genowej wśród kobiet jest dwukrotnie większa niż wśród mężczyzn

Dziedziczenie recesywne sprzężone z chromosomem X

Tylko mężczyźni (nosiciele mutacji genowej) wykazują objawy choroby (ryc. 3.5)

Kobiety, nosicielki mutacji genowej, w zasadzie nie wykazują cech choroby

Heterozygotyczne kobiety mają 50% szans przekazania zmutowanego genu swemu potomstwu, zarówno synom, jak i córkom

Hemizygotyczny chory mężczyzna przekazuje zmutowany gen wszystkim córkom, lecz nigdy synom, więc jego wszystkie córki będą nosicielkami mutacji

Częstość występowania mutacji genowej wśród kobiet jest dwukrotnie większa niż wśród mężczyzn

Rycina 3.4. Rodowód ilustrujący sposób dziedziczenia dominujący sprzężony z chromosomem X

Rycina 3.5. Rodowód ilustrujący sposób dziedziczenia recesywny sprzężony z chromosomem X

3.4. Dziedziczenie wieloczynnikowe

Wśród chorób dziedzicznych najliczniejsze są choroby dziedziczone wieloczynnikowo (kompleksowe), w których etiologii istotną rolę odgrywają zarówno predyspozycja genetyczna, jak i czynniki środowiskowe (tab. 3.7). Predyspozycja genetyczna jest uwarunkowana istnieniem zmienności genowej i zależy nie od jednego, ale od licznych genów i zmian polimorficznych. Istnieje wiele cech, takich jak wzrost, masa ciała, inteligencja czy ciśnienie krwi, determinowanych wielogenowo. Wszystkie te cechy wykazują zarówno zmienność populacyjną, jak i wewnątrzrodzinną. Istotne znaczenie dla kształtowania się wymienionych cech mają też czynniki środowiskowe. Podobnie jest ze skłonnością do ujawniania się pewnych chorób i wad wrodzonych. Wykazując zmienność populacyjną, skłonność sama przez się nie decyduje o wystąpieniu choroby, wady lub cechy. Dopiero oddziaływanie określonych czynników środowiskowych na tle zmian genomowych definiujących predyspozycje genetyczne może się przejawić wystąpieniem objawów choroby lub wadą (ryc. 3.6). Dowodów na istnienie genetycznej predyspozycji dostarczają wyniki badań rodzinnych oraz badań bliźniąt. Jeśli więc w badaniach bliźniąt stwierdza się, że choroba w dużym stopniu jest uwarunkowana genetycznie, a u jej podstaw nie leży zmiana pojedynczego genu (lub aberracja chromosomowa), to z dużym prawdopodobieństwem można przyjąć, że ujawnienie się choroby lub wady zależy od wielu loci genowych, kształtujących skłonność do niej. Skłonność ta, jak już wspomniano, jest z kolei „wyzwalana” przez działanie czynników środowiskowych i ujawnia się w postaci choroby. Im czynnik (czynniki) środowiskowy jest silniejszy, tym u większej liczby osób (także tych z mniejszą skłonnością) ujawnią się objawy choroby (por. rozdz. 9.3).

Tabela 3.7. Szacunkowa częstość występowania niektórych chorób kompleksowych

Choroba

Częstość występowania w populacji (%)

Ryzyko wystąpienia u krewnych pierwszego stopnia (%)

Wady serca

0,4–0,9

4,0–6,0

Rozszczep wargi i/lub podniebienia

0,14

4,0

Stopy końsko-szpotawe

0,01

2,0–5,0*

Wrodzone zwichnięcie stawów biodrowych

0,07

3,0

Choroba Hirschsprunga

0,02

0,6–18,2*

Choroba Perthesa

0,07

0,6–2,8

Wady ośrodkowego układu nerwowego – bezczaszkowie, przepukliny rdzeniowe

0,2–0,5

4,0

Wrodzone zwężenie odźwiernika

0,3

2,0

Inne:

atopia

łuszczyca

schizofrenia

choroba afektywna dwubiegunowa

padaczka

2,0–3,0

1,0–2,0

1,0–3,0

1,0

1,0

2,6–4,4

10,0

10,0

15,0

5,0

* Ryzyko zróżnicowane, zależne od płci probanta i ciężkości wady.

Rycina 3.6. Model dziedziczenia wieloczynnikowego. A – dla populacji, B – dla krewnych pierwszego stopnia osób chorych (wg Falconera)

Wystąpienie choroby uwarunkowanej wieloczynnikowo jest więc biologicznym dowodem istnienia w rodzinie zwiększonej predyspozycji do danego schorzenia. Zostało to udokumentowane empirycznie wynikami badań rodzinnych dotyczących wielu chorób i wad, takich jak: wrodzone zwichnięcie stawów biodrowych, rozszczep wargi i/lub podniebienia, izolowane wady serca, wady cewy nerwowej, zwężenie odźwiernika, atopia, wrzód trawienny żołądka, padaczka, nadciśnienie samoistne itp.

3.5. Dziedziczenie mitochondrialne

Przykładem dziedziczenia, w którym informacja genetyczna jest przekazywana wyłącznie od matki (dziedziczenie matczyne), jest dziedziczenie mitochondrialne (patrz rozdz. 9.5). Rozwijający się zarodek otrzymuje mitochondria wyłącznie od matki, ponieważ stanowią one składnik cytoplazmy komórki jajowej. Do niej, po zapłodnieniu, plemnik wnosi jedynie materiał genetyczny zawarty w jego jądrze.

Do podstawowych cech dziedziczenia mitochondrialnego można zaliczyć specyficzność tkankową i nasilanie się objawów chorobowych wraz z wiekiem. W komórce znajduje się kilkaset mitochondriów i kilka tysięcy cząsteczek mtDNA. Objawy kliniczne niektórych chorób mitochondrialnych ujawnią się dopiero, gdy około 85% cząsteczek mtDNA zawiera zmutowaną sekwencję. Jest więc kwestią czasu (rund replikacji mtDNA), kiedy taki stan zostanie w komórce osiągnięty.

Piśmiennictwo uzupełniające

Ciechanowicz A., Januszewicz A., Januszewicz W. i in., Genetyka chorób układu krążenia, Medycyna Praktyczna 2002.

Friedman J.M., Dill F.J., Hayden M.R. i in., Genetyka. wyd. 1 polskie pod red. J. Limona, Urban & Partner, Wrocław 1997.

Gajewski W., Genetyka ogólna i molekularna, PWN, Warszawa 1987.

Genetyka molekularna w chorobach wewnętrznych. Zagadnienia wybrane, red. nauk. A. Ciechanowicz, F. Kokot, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2009.

Jorde L.B., Carey J.C., Bamshad M.J. i in., Genetyka medyczna, Wydawnictwo Czelej, Lublin 2000.

Khoury M.J., Burke W., Thomson E.J., Genetic and public health in 21st century. Using genetic information to improve health and prevent disease, Oxford University Press, Oxford 2000.

Klug W.S., Cummings M.R., Spencer C.A., Concepts of genetics, wyd. 8, Pearson Education International 2006.

Korf B.R., Genetyka człowieka. Rozwiązywanie problemów medycznych, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003.

Pietrzyk J., Postępy w genetyce klinicznej w 2009 roku, Medycyna Praktyczna 2010, 5, 22–27.

Winter P.C., Hickey G.I., Fletcher H.L., Krótkie wykłady. Genetyka, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003.

4 Genetyczna różnorodność współczesnych populacji ludzkich Ewa Ziętkiewicz, Patrycja Daca-Roszak

Podstawą międzyosobniczej zmienności w populacjach ludzkich są molekularne różnice w genetycznej informacji poszczególnych osobników. Zmiany sekwencji DNA w regionach kodujących lub regulatorowych genów mogą zmieniać strukturę białek, modyfikować aktywność enzymów, wpływać na ekspresję informacji genetycznej albo oddziaływać na mechanizmy kontrolne biorące udział w podziale i rozwoju komórki. Zmiany takie, powodujące zauważalne efekty fenotypowe (w tym efekty patogenne), są jednak zaledwie niewielką częścią różnorodności genetycznej populacji. Zgodnie z przedstawioną w roku 1983 teorią Motoo Kimury przeważającą część zmienności genomu tworzą polimorfizmy neutralne, selekcyjnie obojętne. Jest to zrozumiałe, gdyż regiony kodujące i regulatorowe genów stanowią zaledwie kilka procent genomu; pozostała część to introny, pseudogeny, elementy powtarzalne, regiony międzygenowe, heterochromatyna. Zmiany w tych odcinkach genomu nie podlegają z reguły doborowi naturalnemu, a zaobserwowanie ich jest możliwe jedynie przez analizę sekwencji DNA. To samo dotyczy części zmian w sekwencjach kodujących, np. w trzeciej pozycji większości kodonów. Mimo braku bezpośredniego przełożenia na efekt fenotypowy zmienność neutralna jest niezwykle ważnym źródłem informacji zarówno w naukach podstawowych (np. badaniach ewolucji genomu i gatunku), jak i stosowanych (genetyce medycznej, sądowej itp.).

Różnorodność genetyczna współczesnych populacji, stanowiąca obraz trwającego nieustannie procesu zmienności, jest wypadkową szybkości mutacji oraz działania dryfu genetycznego i – w przypadku zmian funkcjonalnych – selekcji. Mutacja, dryf i selekcja nie są jednak jedynymi czynnikami wpływającymi na kształtowanie różnorodności populacji; jej obecny profil jest również odzwierciedleniem historycznych czynników i procesów demograficznych, takich jak wielkość i struktura populacji, migracje i przepływ genów między populacjami. Zależności te sprawiają, że poznanie współczesnej różnorodności genetycznej populacji ludzkich, prowadzące do pełniejszego zrozumienia mechanizmów powstawania i utrzymywania się zmienności genetycznej, pozwala równocześnie na badanie genetycznej historii gatunku i odtworzenie wzajemnych zależności między jego elementami, jakimi są populacje i tworzące je osobniki. Z drugiej strony znajomość różnorodności genetycznej populacji ludzkich znajduje szerokie zastosowanie praktyczne, będąc niezbędnym elementem rozwoju szeroko pojętej genetyki medycznej, od diagnostyki przez mapowanie genów w chorobach złożonych do określania przynależności populacyjnej/pochodzenia czy identyfikacji osób.

4.1. Mechanizmy powstawania różnorodności genetycznej w populacji

4.1.1. Mutacje i rodzaje markerów

Dla uniknięcia nieporozumień związanych z terminologią należy wyjaśnić, że termin „mutacja” może być stosowany dla określenia: procesu (mutacja = powstanie zmiany w materiale genetycznym); stanu (mutacja = nowy allel, allel zmieniony w stosunku do stanu wyjściowego, jakim jest allel macierzysty); efektu (mutacja = zmiana wywołująca efekt fenotypowy, najczęściej patogenny). Termin „polimorfizm” oznacza równoczesne występowanie, w populacji lub gatunku, różnych alleli. W praktyce polimorfizmem nazywa się najczęściej zmianę o arbitralnie przyjętej populacyjnej częstości rzadszego allelu >1% (rzadsze zmiany określane są mianem wariantów); w omawianych poniżej zagadnieniach takie rozróżnienie nie jest stosowane. Termin „marker” jest pojęciem stosowanym dla określenia polimorfizmu o określonym charakterze (położenie w genomie, rodzaj zmiany itp.). Polimorfizmy to najczęściej zmiany selekcyjnie obojętne, niektóre jednak mogą mieć charakter funkcjonalny. Dodatkowo obojętne polimorfizmy mogą podlegać „oportunistycznej” selekcji wynikającej z bliskiego sprzężenia ze zmianą funkcjonalną.

Wynikiem procesu mutacji jest powstanie nowego allelu. Częstość nowego allelu w populacji, początkowo niska, ulega zmianom (patrz: dryf genetyczny). Z biegiem czasu niektóre z nowych alleli ulegają utrwaleniu (100% osobników w populacji ma zmienioną informację) i wchodzą w zakres różnic między gatunkami. W rezultacie genom współczesnego gatunku jest zapisem zmian, jakie zachodziły w prowadzącej do niego linii ewolucyjnej. Dzięki temu można, na podstawie porównania sekwencji DNA, określić genetyczną odległość (dywergencję) między gatunkami, a także szybkość mutacji w danej linii ewolucyjnej (ryc. 4.1). Na przykład sekwencje człowieka i szympansa różnią się od siebie w 1,2% pozycji, co oznacza, że dywergencja tych gatunków wynosi 1,2%.

Rycina 4.1. Polimorfizm i zmiana utrwalona. Po lewej fragment sekwencji DNA różnych osobników trzech gatunków; kropki oznaczają identyczność z sekwencją wspólnego przodka, litery zmiany typowe dla gatunku, litery w prostokątnych ramkach – polimorfizmy wewnątrzgatunkowe. Po prawej drzewo filogenetyczne tej sekwencji, na którym mutacje typowe dla gatunku zaznaczono literami odpowiadającymi zmianom w sekwencjach. Regiony genomu, w których sekwencja pozostaje niezmieniona między gatunkami, to miejsca zakonserwowane ewolucyjnie (często związane z ważną funkcją)

Szybkość mutacji zależy od rodzaju badanego markera oraz od jego lokalizacji w genomie. W przypadku mutacji punktowych (substytucji oraz małych wstawek i delecji) oblicza się ją z porównania z ortologicznymi (pochodzącymi od wspólnego przodka) sekwencjami blisko spokrewnionych gatunków, np. człowieka i szympansa (ryc. 4.1). Zakładając istnienie zegara molekularnego, czyli stałej szybkości akumulacji mutacji we wszystkich liniach ewolucyjnych, szybkość mutacji µ ocenia się, dzieląc liczbę utrwalonych różnic przez długość badanego segmentu DNA i przez łączny czas trwania linii ewolucyjnych gatunków po ich rozdzieleniu. W genomie jądrowym naczelnych średnia szybkość mutacji punktowych wynosi ~1–4 × 10–9 na nukleotyd na rok lub 2–8 × 10–8 na nukleotyd na pokolenie (pokolenie ~20 lat). Mutacje punktowe prowadzą do powstania markerów typu SNP (ang. simple nucleotide polymorphism). W formalnej analizie takich polimorfizmów jest stosowany model „nieskończonej liczby mutujących miejsc”, który zakłada, że każda nowa zmiana powstaje w innym miejscu (pozycji nukleotydowej) genomu. W populacji występują jedynie dwa allele: pierwotny i nowy, przy czym wszystkie nowe allele w populacji są „spadkobiercami” jednej mutacji, jaka zaszła u wspólnego przodka. Ustalenie, który z alleli SNP jest starszy ewolucyjnie (pierwotny), wymaga porównania z ortologicznym fragmentem genomu u bliskiego ewolucyjnie gatunku, w którym dana pozycja nie jest polimorficzna; w przypadku SNP w genomie człowieka allelem pierwotnym jest zwykle allel obecny u szympansa lub goryla. Nie dotyczy to tzw. gorących miejsc mutacji, np. dinukleotydów CpG, w których szybkość mutacji w kierunku TpG lub CpA (związana z deaminacją metylowanych reszt cytozyny) jest około 10 razy większa niż średnia genomowa.

Szybkość mutacji punktowych w genomie mitochondrialnym (mtDNA) jest dużo większa niż w jądrowym, a do tego bardzo heterogenna – od ~10–8 na nukleotyd na rok do ~10–7 do –6 w regionach hiperzmiennych. Wymiana alleli jest tam szybsza niż czas ich utrwalania, a powtarzające się mutacje powodują, że w populacji występują allele, które, choć identyczne, nie mają wspólnej historii (homoplazja).

Ważną klasą markerów są rozproszone w genomie insercje sekwencji powtarzalnych, retropozonów typu SINE i LINE. Do najczęściej badanych SINE należą tzw. elementy Alu, o długości około 300 pz, stanowiące najliczniejszą rodzinę sekwencji powtarzalnych u człowieka (około 1 miliona kopii w genomie). Około 5 tys. spośród tych kopii pojawiło się stosunkowo niedawno, w linii ewolucyjnej prowadzącej bezpośrednio do człowieka. Około 1/4 z tych insercji nie uległa dotąd utrwaleniu i jest w ludzkiej populacji polimorficzna. Polimorficzne Alu przypominają SNP w tym, że są to markery dwualleliczne; allelem pierwotnym jest brak insercji.

Mutacje markerów mikrosatelitarnych polegają na zwiększaniu lub zmniejszaniu liczby powtórzeń prostego motywu sekwencji (2–6 pz) i są wynikiem poślizgu polimerazy podczas replikacji łańcucha DNA. Mutacje te zachodzą nieporównanie szybciej niż mutacje punktowe (~10–5 do –2/marker/pokolenie); szybkość mutacji zależy od liczby powtórzeń i jest w związku z tym niejednorodna. W populacji występują liczne allele danego markera; ustalenie, który z nich jest allelem pierwotnym, jest trudne, zwłaszcza jeżeli ortologiczny locus w innych gatunkach jest również polimorficzny.

Jeszcze innym typem markera jest haplotyp, czyli układ wielu polimorficznych pozycji w danym chromosomie. Analiza haplotypu umożliwia badanie zmienności odzwierciedlającej szybkość zarówno mutacji, jak i rekombinacji. W przypadku haplotypu złożonego z autosomalnych SNP analiza wymaga ustalenia „fazy” występowania tworzących go alleli w określonym chromosomie z pary; mtDNA oraz nierekombinująca części chromosomu Y (NRY) reprezentują „gotowe” haplotypy charakteryzujące, odpowiednio, żeńskie i męskie linie genealogiczne. Analiza różnorodności haplotypów pozwala na prześledzenie genealogii sekwencji i ustalenie kolejności pojawiania się nowych alleli w poszczególnych pozycjach haplotypu. Połączenie haplotypów zbudowanych z wolno mutujących markerów SNP z występującą na ich tle szybką zmiennością mikrosatelitarną dostarcza dodatkowej informacji na temat wieku i pokrewieństwa haplotypów.

Różnice w mechanizmach powstawania zmienności genomu, u której podłoża leżą różne typy mutacji, są podstawą różnej informatywności markerów w zastosowaniu do badania określonych aspektów genetyki ewolucyjnej i populacyjnej. Rekonstrukcja ewolucyjnej historii człowieka na przestrzeni ostatnich kilkuset tysięcy do miliona lat wymaga użycia stabilnych, czyli wolno mutujących markerów (takich jak SNP czy sekwencje Alu w genomie jądrowym), odzwierciedlających różnorodność macierzystej populacji wspólnej dla wszystkich obecnych grup ludzkich. Z kolei w badaniu stosunkowo niedawnych (zachodzących na przestrzeni ostatnich tysięcy lat) procesów demo-genetycznych dużo większą informatywnością charakteryzują się szybko mutujące, wieloalleliczne markery mikrosatelitarne, a także sekwencje w hiperzmiennych regionach genomu mitochondrialnego. Podobnie haplotypy złożone z markerów SNP nadają się do badania odległych zdarzeń ewolucyjnych, a w badaniach historii młodych populacji bardziej informatywne są systemy zawierające szybko mutujące mikrosatelity występujące na tle stabilniejszych ewolucyjnie haplotypów SNP. W analizach opartych na badaniu nierównowagi sprzężeń (ang. linkage disequilibrium, LD) im dłuższy jest badany haplotyp, tym większa szansa rekombinacji między wchodzącymi w jego skład markerami, a więc tym większa informatywność w badaniach dotyczących krótszej perspektywy historycznej.

Dużą część zmienności genomu ludzkiego stanowi odkryta przed kilkoma laty klasa polimorfizmów związanych z różną liczbą kopii długich odcinków genomu (ang. copy number variation, CNV). Niektóre z aspektów występowania i rozkładu CNV w populacjach ludzkich są podobne jak w przypadku innych wymienionych markerów, jednak ze względu na to, że CNV nie należą do typowych polimorfizmów sekwencji, nie zostały ujęte w niniejszym opracowaniu.

Przypisy

Rozdział 1

[1] Do końca 2022 r. było znanych blisko 8000 chorób genetycznie uwarunkowanych powiązanych z defektem określonego genu.

Rozdział 2

[1] Pierwszym genomem, jaki w pełni zsekwencjonowano, był liczący 5386 pz chromosom bakteriofaga Φ X174 (1977 r.), kolejnym złożony z 48 502 pz genom bakteriofaga λ (1982 r.).

[2] Sekwestracja – tu włączanie białek w strukturę agregatów tworzonych przez nieprawidłowo zwinięte białko.

[3] Terminem RFLP powszechnie określa się również rodzaj analizy DNA, w której są wykorzystywane enzymy restrykcyjne.