Projekt okładki i stron tytułowych Lidia Michalak

Ilustracja na okładce Shutterstock/tanewpix

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Redaktor merytoryczny Urszula Pawłowska

Redaktor prowadzący Renata Ziółkowska

Produkcja Mariola Grzywacka

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2018 r., (wyd. III, I w WN PWN)

Warszawa 2018

ISBN 978-83-01-20286-6

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwa Naukowego PWN: Katarzyna Błaszczyk/Woblink

Przedmowa

Chemia analityczna, zajmująca się określaniem składu jakościowego i ilościowego substancji chemicznych, jest jednym z najstarszych działów chemii. Już w starożytności były znane metody identyfikacji niektórych minerałów i metali. Terminy analiza i analit, jako substancji oznaczanej, wprowadził prawdopodobnie brytyjski chemik i fizyk Robert Boyle (1627–1691). W XVIII wieku opracowano podstawy analizy wagowej, a w XIX wieku – analizy miareczkowej i analizy elementarnej. Największy rozwój technik analitycznych, określanych jako metody instrumentalne, nastąpił w 2. połowie XIX wieku, głównie dzięki osiągnięciom fizyki.

Jednym z podstawowych zadań chemii jest rozdzielanie i wydzielanie indywidualnych składników z mieszanin naturalnych, bądź z mieszanin powstających w wyniku reakcji chemicznych. Sedymentacja, strącanie, klarowanie, ekstrakcja to metody wydzielania znane już alchemikom. Klasyczne metody rozdzielania są nieskuteczne w przypadku mieszanin, których składniki mają podobną budowę chemiczną, np. mieszanin barwników, węglowodorów, aminokwasów itp. Skłoniło to chemików analityków do poszukiwania nowych metod rozdzielania, które byłyby bardziej skuteczne. Takimi metodami okazały się metody chromatograficzne i elektromigracyjne. Podstawą tych metod jest różne powinowactwo składników mieszaniny do odpowiednio dobranej cieczy lub ciała stałego, określanych jako fazy stacjonarne. Metody te umożliwiają badanie składu dowolnych mieszanin substancji chemicznych, występujących obok siebie w bardzo różnych ilościach. Można te substancje wykrywać, identyfikować i oznaczać ilościowo. Dodatkową zaletą tych metod jest możliwość wykrywania niektórych substancji na poziomie femtogramowym (10⁻¹⁵ g).

Trudno byłoby znaleźć obecnie laboratorium analityczne, w którym nie ma chromatografu gazowego. Dlatego konieczne jest zapoznawanie się z tą techniką chromatograficzną studentów nie tylko chemii, lecz także innych kierunków studiów, które w jakikolwiek sposób są związane z analizą chemiczną. Dotyczy to na przykład ochrony środowiska, farmacji, biotechnologii, technologii żywności, medycyny, nauk rolniczych i leśnych. Chcielibyśmy, aby niniejszy podręcznik był pomocny w nauczaniu chromatografii gazowej. Mamy nadzieję, że będą z niego korzystali też pracownicy laboratoriów analitycznych w celu przypomnienia sobie o tym, co być może zapomnieli albo w celu zapoznania się z nowościami, które pojawiły się w czasie ich pracy, po studiach.

W analizie chemicznej bardzo ważne jest właściwe pobranie i przygotowanie próbki do analizy, dlatego jeden rozdział został poświęcony tym problemom.

Niniejsza książka jest w pewnym stopniu kontynuacją dwóch wydań „Chromatografii gazowej”, które ukazały się w 2001 i 2009 roku. Jest kontynuacją, ale jednocześnie jest nową książką, napisaną przez nowy zespół autorski. Chromatografia rozwija się bardzo szybko. Poza podstawową, niezmienną wiedzą opisującą istotę tej metody rozdzielania pojawiła się wiedza, o której w 2001 i 2009 roku nie mieliśmy pojęcia. Dlatego powstała potrzeba napisania nowej książki, zawierającej aktualną wiedzę dotyczącą chromatografii gazowej. Książka ma nową treść i nowy tytuł. Nie ma w niej albo pozostała w postaci bardzo okrojonej wiedza, która straciła na aktualności i nie ma takiego znaczenia, jakie miała na początku obecnego wieku. Mamy nadzieję, że niniejsza książka, podobnie jak dwie poprzednie, będzie pożyteczna zarówno dla uczących się chromatografii gazowej, jak i dla tych, którzy korzystają z tej techniki analitycznej w swojej pracy.

Współczesna chromatografia gazowa jest w istocie chromatografią kapilarną. Dlatego niniejsza książka zawiera głównie informacje dotyczące takiej chromatografii. Nie można już łatwo kupić nośników do samodzielnego przygotowania kolumn pakowanych. Kolumny kapilarne, oprócz podstawowych różnic w rozmiarach i sposobie umieszczenia w nich fazy stacjonarnej, mają korzystne właściwości, m.in. sprawność procesu rozdzielania, w porównaniu z kolumnami pakowanymi.

Książka powinna służyć studentom wyższych uczelni do poznania teorii i praktyki chromatografii gazowej jako podstawowej metody rozdzielania składników mieszanin związków organicznych, wykrywania tych związków, ich identyfikacji i oznaczania. Przeznaczona jest także dla wszystkich, którzy chcą poznać tę metodę w związku z zamiarem jej stosowania w swojej pracy zawodowej. Intencją autorów było też dostarczenie niezbędnych informacji dotyczących prawidłowej eksploatacji aparatury chromatograficznej i właściwej interpretacji wyników analiz w trakcie ich wykonywania oraz wskazanie różnorodnych możliwości wykorzystania chromatografii gazowej.

Podczas czytania literatury obcojęzycznej oraz pisania publikacji w obcych językach bardzo przydatny może być słownik pięciojęzyczny „Chromatografia i techniki elektromigracyjne” wydany przez Wydawnictwo Naukowe PWN w 2016 r.

Autorzy

1

Krótka historia chromatografii gazowej

Odkrycie chromatografii jako metody analitycznej, przypisuje się, pochodzącemu z Ukrainy, botanikowi Michaiłowi Semenowiczowi Cwietowi (1872–1919).

Dokonał on swojego odkrycia w Warszawie, gdzie pracował przez wiele lat na Uniwersytecie Warszawskim i na Politechnice Warszawskiej, prowadząc badania wydzielania i identyfikacji barwników roślin. Umieszczając wyekstrahowane z roślin pigmenty na górze pionowej, szklanej kolumny wypełnionej materiałem adsorpcyjnym (węglanem wapnia) i przemywając złoże różnymi rozpuszczalnikami organicznymi, udało mu się rozdzielić chlorofil i ksantofil, a tym samym wykazać, że chlorofil – uważany wcześniej za pojedynczą substancję chemiczną – jest mieszaniną kilku związków chemicznych. Na rysunku 1.1 przedstawiono schematy pierwszych urządzeń stosowanych przez Cwieta do rozdzielania ekstraktów roślinnych.

Chromatografia, którą odkrył Cwiet, była chromatografią cieczową. Informację o rozdzieleniu chlorofili za jej pomocą przedstawił 21 marca 1903 r., podobno o godz. 12.00, podczas zebrania Warszawskiego Towarzystwa Przyrodniczego. Odkrycie dokonane przez Cwieta spotkało się początkowo ze sceptycyzmem i nieufnością, szczególnie przez botaników, którzy uważali, że chlorofil jest jednoskładnikową substancją. Po okresie małego zainteresowania pracami Cwieta, dopiero w 1931 roku niemiecki chemik Richard Kuhn i jego uczeń, francuski chemik Edgar Lederer, opisali zastosowanie tej techniki do oznaczania wielu biologicznie ważnych substancji, m.in. karotenoidów.

Istotny impuls, który spowodował, że chromatografia z mało znanej techniki stała się jedną z najbardziej znanych metod analitycznych, nastąpił w latach czterdziestych XX wieku po opublikowaniu prac, przedstawiających podstawy teoretyczne procesu rozdzielania, przez dwóch brytyjskich chemików Archera J.P. Martina i Richarda L.M. Synga. Zwrócili oni uwagę na to, że chromatografia, oprócz cieczowej, może być też chromatografią gazową. W publikacji z 1941 r. Martin i Synge napisali: „Bardzo dobre rozdzielenie lotnych substancji powinno być możliwe w kolumnie, w której obojętny gaz przepływa nad żelem impregnowanym nielotnym rozpuszczalnikiem” [1].

Rys. 1.1. Schematy urządzeń stosowanych przez Cwieta i widok rozdzielonych składników ekstraktu roślinnego: a) zestaw do chromatografii Cwieta – do małych próbek; b) zestaw do chromatografii – do większych próbek; c) uzyskane rozdzielenie barwników z roślin, eluent – rozpuszczalnik, faza stacjonarna – węglan wapnia

Za twórców praktycznej chromatografii gazowej są uznawani A.T. James i A.P. Martin, którzy 20 października 1950 r., podczas zebrania Towarzystwa Biochemicznego, przedstawili nową technikę rozdzielania (analizy) składników mieszanin. W 1952 roku ukazała się ich pierwsza publikacja na ten temat [2]. W tym samym roku we wrześniu zaprezentowali oni swoje odkrycie, nazwane chromatografią podziałową, podczas wykładu wygłoszonego na zebraniu Towarzystwa Przemysłu Chemicznego w Oksfordzie. Ich osiągnięcie, uhonorowane Nagrodą Nobla, polegało na rozdzieleniu lotnych kwasów tłuszczowych na fazie stacjonarnej, w postaci mieszaniny oleju silikonowego i kwasu stearynowego, osadzonej na ziemi okrzemkowej, przy zastosowaniu azotu jako fazy ruchomej.

Niezależnie od powstania podziałowej chromatografii gazowej, w latach 40. i 50. XX wieku, opracowano podstawy adsorpcyjnej chromatografii gazowej. Mieli w tym udział m.in.: G. Hesse, E. Cremer i C.S.G. Philips.

Szybki rozwój chromatografii gazowej w latach 50. był związany z rozwojem przemysłu petrochemicznego i koniecznością analizy produktów tego przemysłu. Do popularyzacji techniki przyczynili się również producenci aparatury chromatograficznej. W następnych latach była ona coraz częściej wykorzystywana do analiz biochemicznych, np. aminokwasów i sterydów oraz do analizy żywności. Dość szybko chromatografię gazową zaczęto stosować w badaniach fizykochemicznych, np. do badania kinetyki reakcji chemicznych. Obecnie za pomocą chromatografii gazowej analizuje się organiczne i nieorganiczne związki chemiczne o masach cząsteczkowych do ok. 1000 Da. Za pomocą pirolitycznej chromatografii gazowej można analizować związki chemiczne o jeszcze większych masach cząsteczkowych, analizuje się nawet bakterie.

Pierwszy chromatograf gazowy, z detektorem cieplno-przewodnościowym, pojawił się na rynku w 1955 r. Od tego czasu nastąpił szybki rozwój aparatury chromatograficznej. Skonstruowano detektory jonizacyjne – płomieniowo-jonizacyjny i wychwytu elektronów, połączono chromatograf gazowy ze spektrometrem mas, wprowadzono do użytku mikrostrzykawki i zastosowano programowanie temperatury.

Ważnym krokiem w rozwoju chromatografii gazowej były prace Marcela J.E. Golaya, który w 1957 r. stwierdził, że bardzo długie kolumny, o małej średnicy, ze ściankami pokrytymi cienką warstwą cieczy, umożliwiały dobre rozdzielenie złożonych mieszanin. Kapilary albo kolumny Golaya, zwane kolumnami kapilarnymi, charakteryzują się tym, że mają pustą przestrzeń (ang. open tubular column) i wewnętrzną średnicę mniejszą od 1 mm. Dzięki wprowadzeniu tych kolumn do praktyki analitycznej, rozdzielenie mieszanin zawierających setki składników stało się możliwe w pojedynczym eksperymencie. W tym samym czasie stały się dostępne detektory charakteryzujące się bardzo niską granicą wykrywalności, które umożliwiały wykrywanie małych ilości składników próbek, rozdzielanych za pomocą kolumn kapilarnych.

W latach sześćdziesiątych ubiegłego wieku wprowadzono do użytku stalowe kolumny kapilarne, lampy elektronowe w chromatografach zastąpiono tranzystorami, zastosowano halogenki rubidu w detektorach termojonowych, wprowadzono i udoskonalono detektor płomieniowo-fotometryczny oraz impulsowy detektor wychwytu elektronów. W latach siedemdziesiątych XX wieku w chromatografach zastosowano mikroprocesory i wprowadzono do użytku szklane kolumny kapilarne. W 1979 roku opublikowano pracę R.D. Dandeneau i E.H. Zerennera, dotyczącą kapilarnych kolumn kwarcowych. Kolumny te, po pokonaniu początkowych problemów technicznych związanych z ich produkcją, stały się wkrótce powszechnie dostępne i stosowane w praktyce.

Lata osiemdziesiąte XX wieku są okresem dalszego doskonalenia chromatografii gazowej. W tym czasie wprowadzono immobilizację ciekłych faz stacjonarnych, kolumny kapilarne z grubymi filmami faz stacjonarnych, kolumny kapilarne o dużych średnicach, bezpośrednie dozowanie do kolumn kapilarnych i nowe dozowniki, w tym automatyczne, oraz integratory ułatwiające rejestrację i opracowywanie wyników analizy.

Lata dziewięćdziesiąte XX wieku to czas wprowadzenia komputerów jako integralnych części chromatografów z coraz doskonalszymi programami do sterowania ich pracą i opracowywania wyników analiz. W wyniku tego chromatograf stał się „czarną skrzynką”, a dostęp do niego i wykorzystanie jego możliwości zależy od jakości oprogramowania komputera. Zastosowanie komputerów umożliwiło wykorzystanie metod spektralnych – spektroskopii emisji atomowej (AES), spektrometrii mas (MS), spektrometrii ruchliwości jonów (IMS) i spektroskopii w podczerwieni (FTIR), sprzężonych z chromatografią gazową.

Obecny okres rozwoju chromatografii gazowej jest związany z wprowadzaniem do praktyki laboratoryjnej szybkiej i dwuwymiarowej chromatografii gazowej oraz chromatografii gazowej ze sprzężonymi z nią automatycznymi urządzeniami do przygotowania próbek do analizy. Widać też tendencję do miniaturyzacji chromatografów i do coraz szerszego stosowania chromatografów mobilnych – przewoźnych i przenośnych.

Z okazji 60. rocznicy swojego istnienia The Chromatographic Society dokonało zestawienia największych osiągnięć w rozwoju chromatografii. W zakresie chromatografii gazowej są to: wprowadzenie kolumn kapilarnych, połączenie chromatografu ze spektrometrem mas, wprowadzenie pełnej dwuwymiarowej chromatografii.

Początki i rozwój chromatografii w Polsce są związane z działalnością profesorów: Andrzeja Waksmundzkiego, Jana Głogoczowskiego, Rafała Staszewskiego, Zdzisława Suprynowicza, Edwarda Soczewińskiego i Jerzego Kowalczyka. Byli oni propagatorami tej techniki analitycznej, stosowali ją w praktyce i uczyli chromatografistów z całej Polski. Czterej pierwsi profesorowie zajmowali się głównie chromatografią gazową, a prof. Soczewiński i prof. Kowalczyk chromatografią cieczową.

Prof. Andrzej Waksmundzki (1910–98) był pierwszym, który w Polsce zajmował się chromatografią. Był pracownikiem Akademii Medycznej oraz Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie. W 1957 roku ukazała się monografia poświęcona chromatografii, której był jednym z trzech redaktorów oraz autorem opisu teorii i metodyki chromatografii. Był twórcą „Lubelskiej Szkoły Chromatografii” i nazywano go profesorem profesorów, którzy byli i są wybitnymi chromatografistami. Organizował studia podyplomowe, kursy i sympozja o zasięgu ogólnopolskim. Duże znaczenie dla rozwoju chromatografii w Polsce miało długoletnie przewodniczenie przez niego Komisji Analizy Chromatograficznej Komitetu Chemii Analitycznej PAN.

Życiu i działalności prof. Waksmundzkiego poświęcona jest książka A. Wróbla i J. Kotulskiej „Pitagoras z Waksmunda”. Jako Pitagorasa uwiecznił go ks. prof. Józef Tischner w książce „Historia filozofii po góralsku”.

Prof. Jan Głogoczowski (1914–78) pracował w Instytucie Naftowym (obecnie Instytut Górnictwa Naftowego i Gazownictwa). Wśród jego licznych zainteresowań naukowych była analiza chemiczna ze szczególnym zastosowaniem chromatografii gazowej. Opracowywał procedury jej wykorzystania w analizie produktów petrochemicznych. W 1961 roku zorganizował w Krakowie Pierwszą Krajową Konferencję Chromatografii Gazowej, a następnie kursy chromatograficzne w Krakowie i w Gdańsku. Chromatografią zajmował się także w Komitecie Chemii Analitycznej PAN.

Prof. Edward Soczewiński (1928–2016) pracował w Akademii Medycznej w Lublinie. W wyniku swoich prac badawczych Profesor wniósł znaczny wkład w rozwój teorii i praktyki chromatografii cieczowej, zarówno kolumnowej, jak i cienkowarstwowej. Znane są jego konstrukcje komór do chromatografii cienkowarstwowej. Szczególne znaczenie mają jednak prace dotyczące zależności między składem mieszanej ciekłej fazy ruchomej a retencją chromatografowanych substancji. Zależności te w literaturze światowej są znane jako równanie Soczewińskiego–Wachtmeistera i Snydera–Soczewińskiego. Są to jedne z podstawowych zależności opisujących mechanizm rozdzielania chromatograficznego, służą one do optymalizacji warunków rozdzielania składników mieszanin przy użyciu różnych technik chromatograficznych, podziałowych i adsorpcyjnych.

Dorobek publikacyjny profesora Soczewińskiego, dotyczący teorii i praktyki rozdzielania chromatograficznego, jest ogromny. Trzy jego prace ukazały się w czasopiśmie Nature. W uznaniu osiągnięć naukowych Profesora powołano go do komitetów redakcyjnych czasopism Journal of Liquid Chromatography, Journal of Planar Chromatography i Acta Chromatographica. Za osiągnięcia w pracy naukowej otrzymał medale Cwieta, Kemuli i Waksmundzkiego.

Profesor Soczewiński hobbistycznie zajmował się numizmatyką. Także w tej dziedzinie miał duże osiągnięcia, za które został uhonorowany medalem „Za zasługi dla numizmatyki”.

W 2007 roku ukazała się książka A. Wróbla i J. Chomickiej „Mały, wielki człowiek, czyli życie i pasje profesora Edwarda Soczewińskiego”.

Prof. Zdzisław Suprynowicz (1930–99) był związany zawodowo z Uniwersytetem Marii Curie-Skłodowskiej i współpracował z prof. Waksmundzkim. Jest jednym z współtwórców „Lubelskiej Szkoły Chromatografii”. Przez 20 lat kierował Zakładem Fizyki Chemicznej i Fizykochemicznych Metod Rozdzielania. Zbudował pierwszy w Polsce chromatograf gazowy. Zajmował się teorią i praktyką chromatografii gazowej, w tym analizą zanieczyszczeń środowiska i analizą substancji biologicznie aktywnych. Organizował kursy i studia podyplomowe z chromatografii oraz cykl seminariów „Nauka-Przemysł”. Był członkiem Komitetu Chemii Analitycznej PAN. Poza pracą zajmował się żeglarstwem, wędkarstwem i fotografiką.

Prof. Rafał Staszewski (1921–2013) pracował w Politechnice Gdańskiej. Stworzył tam zespół badawczy, który opracowywał procedury oznaczania zanieczyszczeń środowiska oraz związków siarkoorganicznych w produktach naftowych. Zespół prof. Staszewskiego zajmował się również konstrukcją detektorów do chromatografii gazowej, desorberów termicznych i urządzeń do analizy fazy nadpowierzchniowej. Prof. Staszewski był organizatorem ogólnopolskich kursów chromatografii gazowej, pierwszego w 1964 roku. Przez wiele lat uczestniczyło w nich łącznie ponad 1000 osób, zarówno z uczelni, jak i z przemysłu.

Prof. Jerzy Kowalczyk (1923–2006) i jego zespół badawczy jako jedni z pierwszych na świecie skonstruowali w Politechnice Gdańskiej wysokociśnieniowy chromatograf cieczowy i opracowali nowe procedury zastosowania chromatografii cieczowej w chemii analitycznej. Aparatura do analitycznej, semipreparatywnej i preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej opracowana przez zespół prof. Kowalczyka była produkowana w niewielkich seriach w latach 1975–1989.

Literatura

1. Martin A.J.P., Synge R.L.M., Biochem. J., 1941, 35, 1358.

2. James A.T., Martin A.J.P., Biochem. J., 1952, 50, 679.

2

Znaczenie chromatografii gazowej

Chromatografia jest bardzo ważną metodą analizy związków organicznych, a chromatograf gazowy jest jednym z najczęściej spotykanych przyrządów w laboratoriach analitycznych na świecie. Zakres zastosowań chromatografii gazowej jest bardzo szeroki. Za pomocą tej techniki chromatograficznej można analizować ok. 20% związków chemicznych spośród ponad 100 mln związków chemicznych zarejestrowanych w bazie Chemical Abstracts Service. Te związki chemiczne są badane m.in. w laboratoriach ochrony środowiska, przemysłu chemicznego, farmaceutycznego, kosmetycznego, spożywczego i w laboratoriach medycznych. Próbki mogą być dostarczane do laboratoriów albo analizowane w miejscu ich występowania, za pomocą przyrządów przenośnych lub przewoźnych, w tym na ciałach niebieskich innych niż Ziemia.

O dużym znaczeniu chromatografii dla ludzkości mówiono podczas obchodów 60-lecia The Chromatographic Society 22 marca 2016 r. w Londynie. Wśród dziedzin życia i nauki, dla których chromatografia ma bardzo duże znaczenie, wymieniono m.in.: badanie kosmosu, analizę żywności, badanie leków, diagnostykę medyczną, kryminalistykę i kontrolę antydopingową.

Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne uznało odkrycie chromatografii za jedno z najważniejszych odkryć w dziedzinie chemii i ufundowało tablicę upamiętniającą to wydarzenie. Tablica została podarowana Uniwersytetowi Warszawskiemu, na którym Cwiet odkrył chromatografię i jest eksponowana w gmachu Centrum Nauk Biologiczno-Chemicznych Uniwersytetu – rys. 2.1.

O dużym znaczeniu chromatografii w analizie chemicznej świadczy także to, że w zbiorze Polskich Norm znajduje się ok. 430 norm, w których wykorzystuje się chromatografię.

Jeżeli jakąś mieszaninę można analizować za pomocą chromatografii gazowej i cieczowej, to zwykle korzystniejsze jest wykonanie analizy za pomocą chromatografii gazowej. Przemawia za tym mniejszy koszt analizy i często łatwiejsze uzyskanie lepszego rozdzielenia składników mieszaniny w krótszym czasie. Duże znaczenie ma przy tym szybka chromatografia gazowa, umożliwiająca wykonywanie rozdziału składników mieszanin w ciągu pojedynczych sekund. Stosuje się w tym przypadku kolumny kapilarne o małych średnicach, w tym mikrokapilarne i wielokapilarne.

Rys. 2.1. Zdjęcie tablicy ofiarowanej Uniwersytetowi Warszawskiemu przez Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne w uznaniu odkrycia chromatografii na tym Uniwersytecie

Szczególnie dobre właściwości mają przyrządy hybrydowe, stanowiące połączenie chromatografów ze spektrometrami. Najbardziej rozpowszechnione są przyrządy w postaci chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem mas (GC/MS). Coraz powszechniejsze ich stosowanie wynika z tego, że dobre rozdzielenie złożonych mieszanin jest uzupełnione bardzo dobrą wykrywalnością analitów oraz możliwością ich identyfikacji z dużą pewnością. Istnieje przy tym różnorodność rodzajów spektrometrów łączonych z chromatografami, a także łączenie więcej niż jednego spektrometru.

Chromatograf gazowy sprzężony ze spektrometrem mas (GC/MS) i chromatograf sprzężony ze spektrometrem emisji atomowej (GC/AES) umożliwiają bardzo pewną identyfikację analizowanych substancji, ponieważ spektrometry te pozwalają na rozpoznawanie substancji chemicznych na podstawie widm masowych (MS) lub analizy elementarnej rozdzielonych składników mieszanin (AES).

W ostatnich latach coraz większego znaczenia nabierają chromatografy mobilne. Oprócz takich chromatografów wyposażonych w zwykłe detektory coraz bardziej popularne są chromatografy połączone ze spektrometrami mas oraz ze spektrometrami ruchliwości jonów.

Chromatografy gazowe do swojego działania nie potrzebują rozpuszczalników organicznych, dlatego są bardziej przyjazne środowisku niż chromatografy cieczowe.

Inną zaletą chromatografii gazowej jest to, że przy jej użyciu można wykonywać analizy szybciej niż za pomocą chromatografii cieczowej i nadkrytycznej. To, że szybkość analizy za pomocą chromatografii gazowej jest większa niż za pomocą chromatografii cieczowej wykazał już w 1965 r. Giddings. Jest tak też obecnie. Nie zmienił tego ogromny rozwój obu tych rodzajów chromatografii, w wyniku którego analizy przy ich wykorzystaniu wykonuje się znacznie szybciej niż w 1965 r. W chromatografii gazowej nie stosuje się rozpuszczalników i analizy są szybkie, więc koszt wykonywania analiz tą techniką analityczną jest mniejszy.

Chromatografia gazowa, podobnie jak inne rodzaje chromatografii, jest przede wszystkim metodą analityczną. Oprócz tego może ona być wykorzystywana także do innych celów, np. do preparatywnego wydzielania wybranych składników mieszaniny. Otrzymane w taki sposób związki chemiczne mogą być wykorzystywane jako wzorce analityczne (także w chromatografii) albo jako substancje stosowane w innych badaniach naukowych, technice, farmakologii, biotechnologii, medycynie lub w przemyśle spożywczym.

Doskonałość techniczna i precyzja działania aparatury chromatograficznej stwarza możliwości prowadzenia przy jej użyciu różnorodnych badań fizykochemicznych. Możliwe jest wyznaczanie niektórych wielkości termodynamicznych związanych z procesami adsorpcji i absorpcji (rozpuszczania) związków chemicznych w cieczach, a także pomiary właściwości fizykochemicznych porowatych ciał stałych i polimerów. Właściwości te obejmują m.in. entalpie adsorpcji i rozpuszczania, wielkości powierzchni właściwej i strukturę porów oraz temperatury przemian fazowych. Technika chromatograficzna stosowana w badaniach fizykochemicznych nosi nazwę odwróconej (inwersyjnej) chromatografii gazowej. Ta dynamiczna metoda badawcza umożliwia uzyskiwanie dobrych wyników w czasie znacznie krótszym niż za pomocą metod statycznych.

3

Istota rozdzielania chromatograficznego

Chromatografia jest fizykochemiczną metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku ich różnego podziału między dwie fazy układu chromatograficznego: nieruchomą, zwaną również stacjonarną, i ruchomą, poruszającą się wzdłuż fazy stacjonarnej. Składniki próbki w różny sposób dzielą się pomiędzy obie fazy i tym samym są przenoszone przez fazę ruchomą z różną prędkością. Decydującą rolę w procesie rozdzielania chromatograficznego odgrywa różne oddziaływanie poszczególnych składników mieszaniny z fazą stacjonarną i fazą ruchomą. Ciągła wymiana składników próbki pomiędzy obiema fazami jest spowodowana kinetycznym ruchem cząsteczek. Cząsteczki substancji chromatografowanych znajdujące się w fazie ruchomej są przez nią przenoszone wzdłuż fazy stacjonarnej. Natomiast te cząsteczki, które w tym czasie znajdują się w fazie stacjonarnej, nie przemieszczają się wzdłuż fazy stacjonarnej. Składniki próbki, które wykazują większe powinowactwo do fazy stacjonarnej, później opuszczają układ chromatograficzny niż składniki, które mają mniejsze powinowactwo. Rozdzielenie składników próbki zachodzi wskutek różnych szybkości migracji tych składników w układzie chromatograficznym. Uwzględniając główne procesy zachodzące w układzie chromatograficznym (wymiana masy i związana z nią dyfuzja), którym podlegają składniki rozdzielanej mieszaniny, można stwierdzić, że rozdzielenie jest funkcją efektów termodynamicznych i kinetycznych.

W chromatografii gazowej fazą ruchomą jest gaz, a fazą stacjonarną, umieszczoną w kolumnie chromatograficznej (rozdział 8), ciało stałe (chromatografia gazowa adsorpcyjna) lub ciecz (chromatografia gazowa podziałowa). Udział oddziaływań gazu (fazy ruchomej) z substancjami chromatografowanymi jest mały, praktycznie aktywna jest tylko faza stacjonarna. W klasycznej chromatografii gazowej wypełnienie kolumny pakowanej (ang. packed column), o stosunkowo dużej średnicy wewnętrznej (1–5 mm), stanowią zarówno ciało stałe, zwane adsorbentem, jak i ciecz naniesiona na nieaktywny nośnik, umieszczane w całej objętości kolumny. Nośnik pełni tylko funkcję mechaniczną – podłoża dla fazy ciekłej, w celu umożliwienia wprowadzenia jej do kolumny w dogodnej formie. W przypadku kolumn kapilarnych, o mniejszych średnicach (< 0,6 mm), wypełnienie w postaci ziaren adsorbenta lub cienkiej warstwy cieczy jest naniesione na wewnętrzną ściankę kolumny o przekroju otwartym (ang. open tubular column).

W chromatografii gazowej składniki mieszaniny są wprowadzane do kolumny chromatograficznej po odparowaniu w umieszczonym przed nią dozowniku (rozdział 7). Następnie składniki te zaczynają przemieszczać się w postaci gazowej wzdłuż kolumny chromatograficznej, w strumieniu nieprzerwanie płynącego gazu. Szybkość tego przemieszczania jest różna, zależna od oddziaływań składników z fazą stacjonarną.

W podziałowej chromatografii gazowej jako wypełnienie kolumny stosuje się ciecz. Proces rozdzielania zachodzi wtedy przez wielokrotne procesy rozpuszczania się poszczególnych składników w kolejnych fragmentach wypełnienia (absorpcja) i ich powrotu do kolejnych porcji gazu nośnego (desorpcja), co w mikroskali można określić jako dochodzenie do kolejnych stanów równowagi. Parametrem opisującym taki układ równowagi jest stała podziału (K) definiowana jako stosunek masy związku chemicznego w jednostce objętości ciekłej fazy stacjonarnej do masy tego związku w jednostce objętości fazy ruchomej w danych warunkach temperatury i równowagi termodynamicznej. Stała ta wyraża stosunek stężeń chromatografowanej substancji w ciekłej fazie stacjonarnej cL i gazowej cG:

gdzie: cL – stężenie substancji w fazie ciekłej, cG – stężenie substancji w fazie gazowej,

Termodynamiczna stała równowagi K zależy tylko od badanej substancji, fazy ciekłej i temperatury.

Siłą napędową migrującej substancji jest poruszający się gaz nośny, a siłą hamującą jest powinowactwo do fazy stacjonarnej. Kombinacja obu sił, kontrolowana przez analityka, prowadzi do rozdzielenia składników mieszaniny na poszczególne składniki. Transport substancji wzdłuż kolumny odbywa się tylko w nieustannie poruszającym się z tą samą szybkością gazie nośnym. Jeżeli wartości K są różne dla poszczególnych składników mieszaniny, to następuje ich rozdzielenie w wyniku różnych szybkości migracji tych składników wzdłuż wypełnienia kolumny. W celu rozdzielenia wszystkich składników mieszaniny (np. A i B), analityk musi tak dobrać warunki chromatografowania, aby wartości stałych podziału tych składników były różne (KA ≠ KB). Sprowadza się to przede wszystkim do wyboru odpowiedniej fazy stacjonarnej i doboru odpowiedniej temperatury kolumny (rozdział 10).

W podobny sposób można wytłumaczyć mechanizm adsorpcyjnej chromatografii gazowej. W tym przypadku zamiast zjawiska rozpuszczania substancji w nielotnej cieczy zachodzi adsorpcja gazów lub par analizowanych związków na bardzo rozwiniętej powierzchni ciała stałego – adsorbencie. Adsorbentami są substancje porowate charakteryzujące się tym, że niewysycone siły powierzchniowe powodują lokalne zatrzymanie na powierzchni części cząsteczek gazu lub pary. W układzie ustala się równowaga między stężeniem substancji chromatografowanej na powierzchni adsorbenta i jej stężeniem w otoczeniu. Równowagę tę, podobnie jak w chromatografii podziałowej, można scharakteryzować stałą podziału, zależną od izotermy adsorpcji. Zjawiska związane z migracją i rozdzielaniem składników mieszaniny w chromatografii adsorpcyjnej są analogiczne do zjawisk w chromatografii podziałowej.

Rozpatrzmy proces chromatograficzny dla dwóch składników mieszaniny 1 i 2, których stałe podziału wynoszą odpowiednio K₁ i K₂, przy czym K₁ > K₂. Mieszanina jest wprowadzana na początek kolumny w strumieniu gazu nośnego w postaci wspólnego pasma w czasie t₀. Każdy składnik jest zatrzymywany przez fazę stacjonarną w różny sposób i dla każdego ze składników ustala się równowaga, określana ich wartościami stałej podziału. Przepływ gazu nośnego powoduje, że pasma obu składników przesuwają się z różną prędkością, aż do całkowitego ich rozdzielenia. Najpierw opuszcza kolumnę składnik 2, a następnie składnik 1 (rys. 3.1).

Na efektywność procesu chromatograficznego, charakteryzującą się szerokością pasma chromatograficznego, ma wpływ czas przechodzenia substancji z fazy ruchomej do fazy stacjonarnej i odwrotnie. W układach doskonałych przejście to następuje natychmiastowo i proces jest termodynamicznie odwracalny. Nie następuje wtedy poszerzenie pasma chromatograficznego. W układach rzeczywistych procesy wymiany nie są nieskończenie szybkie, a więc nie są też termodynamicznie odwracalne. Wolniejsza wymiana masy między fazami powoduje poszerzanie pasma danej substancji. Jeżeli wartość K jest stała w całym przedziale stężeń, to substancja migruje ze stałą prędkością i pasmo chromatograficzne jest symetryczne. Natomiast jeśli wartość K zmienia się w zależności od stężenia, to mogą powstawać pasma niesymetryczne.

Rys. 3.1. Schemat rozdzielania chromatograficznego mieszaniny dwuskładnikowej

Ostateczny profil rozkładu stężeń pasm chromatograficznych opuszczających kolumnę chromatograficzną znajduje odzwierciedlenie we wskazaniach detektora, ważnego elementu chromatografu (rozdział 11), którego rolą jest rejestracja zmian w składzie fazy ruchomej. Wykres zmian sygnału detektora w funkcji czasu analizy nazywa się chromatogramem. Na rysunku 3.2 pokazano przykładowy chromatogram czteroskładnikowej mieszaniny po jej rozdzieleniu w kolumnie chromatograficznej.

Rys. 3.2. Chromatogram czteroskładnikowej mieszaniny

Każdy z czterech składników tej mieszaniny jest przedstawiony w postaci krzywej, którą w chromatografii nazywa się pikiem. Pik chromatograficzny teoretycznie powinien mieć kształt krzywej Gaussa, a proces chromatograficzny określa się w takim przypadku jako chromatografię idealną. W praktyce piki chromatograficzne zazwyczaj mają kształt zbliżony do krzywej Gaussa, nie są one doskonale symetryczne, a taki proces chromatograficzny określa się jako chromatografię nieidealną. Substancje opuszczające kolumnę, których piki nie są symetryczne, opuszczają ją w różnym czasie, zależnym od wielkości próbki. Zwykle pik ma rozciągniętą (rozmytą) linię schodzenia (tzw. ogonowanie piku), rzadziej występuje rozmycie linii wznoszenia (tzw. czołowanie piku). W pierwszym przypadku ze wzrostem wielkości próbki czas przebywania substancji w kolumnie maleje, a w drugim przypadku ze wzrostem wielkości próbki ten czas wzrasta. Przyczyną asymetrii pików może być np. zbyt niska temperatura dozownika i zbyt duża wielkość zadozowanej próbki (przeładowanie kolumny). Niesymetryczne piki mogą dawać czasem bardzo polarne substancje – zależy to od rodzaju fazy stacjonarnej (rys. 3.3).

Właściwością chromatogramu jest to, że piki odpowiadające składnikom dłużej przebywającym w kolumnie są szersze niż odpowiadające składnikom przebywającym krócej w kolumnie. Składniki 1 i 4 na rys. 3.2 są całkowicie oddzielone od dwóch pozostałych (2 i 3), częściowo nakładających się na siebie, nierozdzielonych całkowicie. Zaznaczona na wykresie linia kropkowana nazywa się liną podstawową chromatogramu. Jest to interpolowany wykres sygnału detektora, przez który przepływa tylko gaz nośny.

Rys. 3.3. Zależność kształtu piku chromatograficznego od izotermy sorpcji; a) liniowa izoterma sorpcji – pik symetryczny, położenie maksimum piku stałe; b) wypukła izoterma sorpcji – pik ogonujący, rozciągnięta linia schodzenia, położenie maksimum piku uzależnione od wielkości próbki; c) wklęsła izoterma sorpcji – pik czołujący, rozciągnięta linia wznoszenia, położenie maksimum piku uzależnione od wielkości próbki

Chromatogram, który jest zbiorem pików poszczególnych substancji, jest podstawą otrzymywania jakościowych i ilościowych wyników analizy chromatograficznej. Do analizy jakościowej wykorzystuje się wartości czasów migracji składników próbki przez złoże chromatograficzne, czyli położenie pików na chromatogramie (rozdziały 4 i 15), natomiast podstawą obliczeń ilościowych są wielkości powierzchni pików chromatograficznych lub ich wysokości (rozdział 16).

4

Podstawowe wielkości retencyjne i termodynamiczne

Składniki próbki wprowadzonej do układu chromatograficznego ulegają podziałowi pomiędzy fazę ruchomą i stacjonarną, ale migrują (w układzie) wyłącznie w fazie ruchomej. W konsekwencji, składniki substancji mające większą tendencję do przebywania w fazie ruchomej poruszają się przez układ szybciej niż te, które mają większą tendencję do przebywania w fazie stacjonarnej, są silniej zatrzymywane przez fazę stacjonarną. Zatrzymywanie, określane retencją, jest spowodowane oddziaływaniem składników próbki siłami międzycząsteczkowymi (dyspersyjnymi, polarnymi i jonowymi) z fazą stacjonarną. Siły te są większe niż siły oddziaływania międzycząsteczkowego między składnikami próbki a fazą ruchomą.

Retencja może być określana w różny sposób. Są dwie podstawowe grupy parametrów retencyjnych. Pierwsza jest związana z czasem, który składniki spędzają w układzie chromatograficznym (czasy retencji). Druga grupa parametrów retencyjnych jest związana z objętością fazy ruchomej przepływającej przez kolumnę podczas przebywania w niej składników próbki (objętości retencji). Retencję charakteryzuje też parametr wyrażający stosunek czasu, który składniki spędzają w fazie nieruchomej, do czasu, który spędzają w fazie ruchomej (współczynnik retencji).

Każdy proces chromatograficzny jest procesem termodynamicznym. Z istoty tego procesu (rozdział 3) wynika, że podczas analizy chromatograficznej nie uzyskuje się wprawdzie pełnej równowagi podziału wszystkich substancji między fazę ruchomą i nieruchomą, ale w większości przypadków osiąga się stan bardzo zbliżony do stanu równowagi. Stała podziału (K) jako podstawowa wielkość termodynamiczna określająca stan równowagi procesu chromatograficznego zależy od temperatury, w której prowadzi się proces chromatograficzny, od lotności chromatografowanych substancji oraz charakteru ich oddziaływań z fazą stacjonarną. Wartość stałej podziału określa szybkość migracji pasma chromatograficznego przez złoże sorbentu, a zatem wpływa na czas przebywania substancji chromatografowanej w kolumnie, parametry retencyjne są z nią ściśle powiązane.

Na czas przebywania substancji chromatografowanych w kolumnie chromatograficznej wpływają następujące czynniki:

Polarność fazy stacjonarnej i polarność substancji chromatografowanych; ich podobne polarności sprzyjają dłuższemu pobytowi substancji chromatografowanych w kolumnie.

Wartości temperatury wrzenia substancji chromatografowanych; substancje o niższych wartościach temperatury wrzenia są bardziej lotne niż substancje o wyższych wartościach temperatury wrzenia i krócej przebywają w kolumnie.

Temperatura kolumny; im wyższa, tym krócej zatrzymują się w kolumnie substancje chromatografowane i jednocześnie są one gorzej rozdzielone niż wtedy, gdy temperatura jest niższa.

Przepływ gazu nośnego; im większy, tym krócej przebywają w kolumnie chromatografowane substancje. Szybkość przepływu gazu nośnego bardzo wpływa na rozdzielanie składników mieszanin. Opisuje to równanie van Deemtera i ilustruje wykres van Deemtera (rozdział 9).

Długość kolumny; substancje chromatografowane, w takich samych warunkach, są tym dłużej zatrzymywane w kolumnie, im jest ona dłuższa. Można wtedy otrzymać lepsze rozdzielenie składników mieszaniny, ale im dłużej substancje chromatografowane są w kolumnie, tym większe jest rozmycie ich pików, które może niwelować efekt lepszego rozdzielenia w dłuższej kolumnie.

Czas przebywania składników mieszaniny w kolumnie chromatograficznej, liczony od chwili wprowadzenia tej mieszaniny do dozownika aż do osiągnięcia maksimum stężenia poszczególnych składników w detektorze (szczyt piku chromatograficznego), nazywa się całkowitym czasem retencji tR.

Całkowity czas retencji odczytuje się z chromatogramu (rys. 4.1).

Rys. 4.1. Sposób wyznaczania czasów retencji z chromatogramu

Na całkowity czas retencji składa się czas przebywania substancji w obu fazach uczestniczących w procesie chromatograficznym. Z punktu widzenia oddziaływania fazy stacjonarnej na substancję chromatografowaną bardziej interesujący jest czas retencji „netto”, tj. czas przebywania substancji w fazie nieruchomej t′R, zwany zredukowanym czasem retencji. Można go wyznaczyć eksperymentalnie, odejmując od całkowitego czasu retencji tR czas retencji substancji (gazu) nie zatrzymywanej przez fazę stacjonarną (czas ten był dawniej nazywany czasem martwym) tM

Do wyznaczenia wartości tM stosuje się najczęściej niskocząsteczkowe gazy: w chromatografii podziałowej powietrze albo metan, a w chromatografii adsorpcyjnej – gaz słabo się sorbujący, np. wodór albo hel. Dozuje się je do kolumny chromatograficznej za pomocą strzykawki do gazów.

Zredukowany czas retencji jest proporcjonalny do wartości stałej podziału K. Jego wartość zależy jednak nie tylko od rodzaju fazy stacjonarnej i ruchomej, lecz także od wielu innych warunków chromatografowania, takich jak: temperatura kolumny, objętościowa szybkość przepływu gazu nośnego przez kolumnę, wymiary kolumny, masa fazy stacjonarnej w kolumnie, spadek ciśnienia gazu w kolumnie. Aby choć częściowo uniezależnić się od wpływu tych warunków, wprowadzono pojęcia retencyjne związane z objętością gazu nośnego zużywanego do elucji danego składnika z kolumny, czyli objętości retencji. Jeżeli chromatografowanie prowadzi się przy stałej wartości objętościowego natężenia przepływu gazu nośnego na wylocie z kolumny Fc [ml/min], to całkowitą objętość retencji można obliczyć ze wzoru

a zredukowaną objętość retencji ze wzoru

Należy przy tym zwrócić uwagę na to, że objętościowa szybkość przepływu gazu nośnego musi być sprowadzona do warunków ciśnienia i temperatury panujących u wylotu kolumny chromatograficznej. Gdy objętościową szybkość przepływu gazu nośnego mierzy się fleometrem pęcherzykowym na wylocie kolumny w temperaturze otoczenia (Fp), to konieczne jest uwzględnienie w pomiarach poprawki temperaturowej i prężności pary wodnej obecnej w komorze fleometru

gdzie: Tc – temperatura bezwzględna kolumny, Tp – temperatura bezwzględna fleometru, pw – prężność pary wodnej nasyconej w temperaturze Tp, b – ciśnienie barometryczne.

Aby pokonać opór, jaki wypełnienie kolumny stawia przepływowi gazu nośnego, jego ciśnienie na wlocie kolumny (pi) musi być większe niż na wylocie (po). W celu wyeliminowania wpływu spadku ciśnienia gazu nośnego w kolumnie na wartości retencji stosuje się tzw. współczynnik korekcyjny ściśliwości fazy ruchomej (j) obliczany wg wzoru:

Uwzględniając tę poprawkę, można obliczyć tzw. skorygowaną objętość retencji VRo, która jest niezależna od ciśnienia gazu nośnego w kolumnie

oraz absolutną (normalną) objętość retencji VN

Skorygowana objętość retencji sprowadzona do temp. 273 K i przeliczona na jednostkę masy fazy stacjonarnej obecnej w kolumnie nazywa się właściwą objętością retencji (Vgo) w temp. 0°C

gdzie: Tc – temperatura kolumny [K], WS – masa fazy stacjonarnej w kolumnie. Właściwa objętość retencji, podobnie jak stała podziału, zależy od temperatury i natury oddziaływań między substancją chromatografowaną a fazą stacjonarną. Nie zależy natomiast od wszystkich innych wspomnianych wyżej parametrów chromatografowania. Nosi więc w sobie cechy uniwersalnej wielkości retencyjnej. Okazuje się jednak, że jej przydatność do jakościowej interpretacji chromatogramów jest niewielka, ponieważ – jak wynika z podanego wyżej wzoru – do jej wyznaczenia niezbędna jest znajomość dokładnej wartości masy fazy stacjonarnej w kolumnie. W praktyce wyznaczenie tej masy nie jest łatwe, a ponadto w chromatografii podziałowej ulega ona stałemu zmniejszaniu się w miarę eksploatacji kolumny, zwłaszcza podczas pracy w wysokiej temperaturze.

Można wyprowadzić bezpośrednią zależność między wielkością retencji a wartością stałej podziału. Z definicji stałej podziału wynika, że

gdzie: NS – liczba moli substancji chromatografowanej w fazie nieruchomej, NG – liczba moli tej samej substancji chromatografowanej w fazie ruchomej podczas procesu chromatograficznego, VS i VG – objętości faz, odpowiednio: stacjonarnej i ruchomej, w kolumnie chromatograficznej.

Po uporządkowaniu powyższego wzoru można napisać

Stosunek NS/NG nazywa się współczynnikiem retencji. Jego wartość wyraża stosunek czasu przebywania substancji chromatografowanej w fazie nieruchomej do czasu jej przebywania w fazie ruchomej

Przy stałej szybkości przepływu gazu nośnego przez kolumnę stosunek czasów retencji można zastąpić odpowiednim stosunkiem objętości retencji

gdzie VM – objętość retencji substancji niezatrzymywanej przez fazę stacjonarną. Uwzględniając powyższe wyrażenia w równaniu na stałą podziału, otrzymuje się wzór

Ponieważ VG = VM · j, to