Tytuł oryginału: Stem Cells: A Very Short Introduction

Rada Naukowa serii Krótkie Wprowadzenie

Jerzy Gajdka, Ewa Gajewska, Krystyna Kujawińska Courtney Aneta Pawłowska, Piotr Stalmaszczyk

Redaktorzy inicjujący serii Krótkie Wprowadzenie

Urszula Dzieciątkowska, Agnieszka Kałowska

Tłumaczenie

Janusz Błasiak, Paulina Tokarz

Redakcja

Aurelia Hołubowska

Skład i łamanie

Munda – Maciej Torz

Projekt typograficzny serii

Tomasz Przybył

Stem Cells: A Very Short Introduction was originally published in English in 2012 This translation is published by arrangement with Oxford University Press Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego is solely responsible for this translation from the original work and Oxford University Press shall have no liability for any errors, omissions or inaccuracies or ambiguities in such translation or for any losses caused by reliance thereon

© Copyright by J. M. W. Slack 2012

© Copyright for this edition by Uniwersytet Łódzki, Łódź 2017

© Copyright for Polish translation by Jausz Błasiak and Paulina Tokarz, Łódź 2017

Publikacja sfinansowana ze środków Wydawnictwa Uniwersytetu Łódzkiego

Wydane przez Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego

Wydanie I. W.07541.16.0.M

Ark. wyd. 6,4; ark. druk. 9,75

Paperback ISBN Oxford University Press: 978-0-19-960338-1

ISBN 978-83-8088-616-2

e-ISBN 978-83-8088-617-9

Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego

90-131 Łódź, ul. Lindleya 8

www.wydawnictwo.uni.lodz.pl

e-mail: ksiegarnia@uni.lodz.pl

tel. (42) 665 58 63

Spis ilustracji

1 Koncepcja komórki macierzystej

Reprodukcja ryc. 13.5 z J.M.W. Slack, 2005, Essential Developmental Biology, 2nd edn, Blackwell, Oxford

2 Komórki rosnące w hodowli tkankowej

Dzięki uprzejmości Michaela W. Davidsona z Molecular Expressions

3 Zarodki człowieka w stadium preimplantacyjnym

Dzięki uprzejmości Kim Stelzig i Meri Firpo, Uniwersytet Minnesoty,Instytut Komórek Macierzystych

4 Kolonia zarodkowych komórek macierzystych człowieka w hodowli

Dzięki uprzejmości Lucasa Gredera, Uniwersytet Minnesoty, Instytut Komórek Macierzystych

5 Właściwości mysich zarodkowych komórek macierzystych

Zmieniona ryc. 10.13 z J.M.W. Slack, 2005, Essential Developmental Biology, 2nd edn, Blackwell, Oxford

6 Przykład procedury kontrolowanego różnicowania zarodkowych komórek macierzystych człowieka

7 Procedury stosowane w klonowaniu ssaków

Reprodukcja ryc. 2.2 z J.M.W. Slack, 2005, Essential Developmental Biology, 2nd edn, Blackwell, Oxford

8 Procedura tworzenia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS)

Reprodukcja ryc. 3 z J.M.W. Slack oraz J.R. Dutton, 2012, Induced pluripotent stem cells and the prospects for cardiac cell therapy, [w:] Coronary Heart Disease: Clinical, Pathological, Imaging and Molecular Profiles, ed. Z. Vlodaver, Springer Science+Business Media, New York. Dzięki uprzejmości Springer Science+Business Media

9 Mysie komórki iPS

Dzięki uprzejmości Jamesa Duttona, Uniwersytet Minnesoty, Instytut Komórek Macierzystych

10 Kolonia komórek iPS człowieka

Dzięki uprzejmości Lucasa Gredera, Uniwersytet Minnesoty,Instytut Komórek Macierzystych

11 Komórki macierzyste jelit

Reprodukcja ryc. 4 z E. Fuchs, 2009, The tortoise and the hair: slow-cycling cells in the stem cell race, „Cell” 137, 811–819

12 Przekrój poprzeczny przez nabłonek jelitowy myszy oglądany pod mikroskopem

a) Dzięki uprzejmości AbCAM plc.

b–d) Reprodukcja ryc. 5c–e w N. Barker et al., 2007, Identificationof stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5, „Nature” 449, 1003–1007. Przedruk za zgodą Macmillan Publishers Ltd

13 Metoda określania „narodzin” komórki na podstawie poziomu 14C

Reprodukcja ryc. 3 z K.L. Spalding et al., 2005, Retrospective birth dating of cells in humans, „Cell” 122, 133–143. Za zgodą Elsevier

14 Historyczny przeszczep skóry z myszy białej do pręgowanej

Reprodukcja płytki 64, s. 1029 z J.M. Main oraz R.T. Prehn, 1955, Successful skin homografts after the administration of high dosage X-radiation and homologous bone marrow, „Journal of the National Cancer Institute” 15, 1023–1029. Za zgodą Oxford University Press

15 Obraz mikroskopowy pokazujący przekrój przeszczepionej skóry u osoby poparzonej

Reprodukcja ryc. 10–12, s. 610 z C.C. Compton et al., 1989, Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting: a light, electron microscopic and immunohistochemical study, „Laboratory Investigation” 60, 600–612. Przedruk za zgodą Macmillan Publishers Ltd

Wydawca i autor przepraszają za ewentualne błędy lub pominięcia w powyższym wykazie. Jeśli zostaną o nich powiadomieni, wprowadzą zmiany przy najbliższej okazji.

Przedmowa

Celem tej książki jest przybliżenie czytelnikom zagadnień dotyczących komórek macierzystych: wyjaśnienie, czym są, co naukowcy z nimi robią, jaka terapia komórkami macierzystymi jest dziś dostępna, czego można oczekiwać w ciągu najbliższych kilku lat. Uwaga skupiona jest na aspektach naukowych i medycznych, a nie na kwestiach etycznych, prawnych czy politycznych, na temat których wiele informacji znaleźć można w różnych mediach.

Mam nadzieję, że wyjaśnię czytelnikom różnicę pomiędzy zarodkowymi komórkami macierzystymi a tkankowo-specyficznymi somatycznymi komórkami macierzystymi oraz przybliżę potencjał indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Czytelnicy dowiedzą się także, że współczesna terapia komórkami macierzystymi jest jeszcze we wczesnym etapie rozwoju. Większość realnej terapii komórkami macierzystymi stanowią przeszczepy szpiku kostnego, a gros innych działań określanych mianem terapii komórkami macierzystymi (w tej książce nazywanych „aspirującymi terapiami komórkami macierzystymi”) ma ograniczone uzasadnienie i prawdopodobnie jest nieskuteczna.

Pomimo że wiele zastosowań zdobyczy nauki będzie możliwe w często nieokreślonej przyszłości, wierzę, że kolejne pokolenia będą czerpać ogromne korzyści z obecnych badań nad komórkami macierzystymi i medycyny regeneracyjnej.

Jestem wdzięczny za przeczytanie szkicu tej książki oraz cenne uwagi dotyczące jej ścisłości i przystępności: Janet Slack, Rebecce McKnight, Pameli Self, Helen Brittan i Jakubowi Tolarowi.

Ramka 1. Niezbędne akronimy

W tej książce użycie akronimów zostało ograniczone do minimum, ale niektórych nie udało się uniknąć:

DNA: kwas deoksyrybonukleinowy (ang. deoxyribonucleic acid)

FDA: Departament Kontroli Żywności i Leków (ang. Food and Drug Administration)

HLA: antygen leukocytów człowieka (ang. human leukocyte antigen)

HSC: hematopoetyczna komórka macierzysta (ang. hematopoietic stem cell)

HSCT: terapia hematopoetycznymi komórkami macierzystymi (ang. hematopoietic stem cell therapy)

komórka ES: zarodkowa komórka macierzysta (ang. embryonic stem cell)

komórka iPS: indukowana pluripotencjalna komórka macierzysta (ang. induced pluripotent stem cell)

Na końcu książki znajduje się Słowniczek, który zawiera obszerniejsze objaśnienia tych akronimów oraz definicje terminów wyróżnionych kursywą.

Rozdział 1

Czym są komórki macierzyste?

Starzenie się i umieranie należy do przykrych aspektów naszej rzeczywistości. Przez większość życia staramy się o nich nie myśleć, a z pomocą przychodzą nam religie, które wykreowały ideę nieśmiertelnej duszy – istniejącej nawet po śmierci ciała i mózgu. Chociaż unikamy myśli o umieraniu, każdy z nas pragnie ustrzec się przed kalectwem. Przerażenie budzą w nas choroby wrodzone, na przykład porażenie mózgowe, poważne obrażenia powypadkowe, w tym ślepota czy paraliż, utrata niezależności związana z chorobami towarzyszącymi starości, jak choroba Alzheimera, udar mózgu, niewydolność serca lub nowotwór. Dotyczy to zwłaszcza tych sytuacji, gdy bliski przyjaciel czy członek rodziny cierpi z powodu jednego z wymienionych schorzeń lub gdy troszczy się o chorego. Oczekujemy jakiegoś cudownego leku, który zakończy te cierpienia i przywróci nam osobę, którą utraciliśmy.

Nasze pragnienie potęguje mnogość sukcesów w zapobieganiu i leczeniu wielu chorób typowych dla wieku dziecięcego i średniego. Większość z nas, żyjących w bogatych państwach, spodziewa się dożyć późnej starości z nieznacznymi tylko problemami zdrowotnymi, co niestety czyni poważne schorzenia jeszcze bardziej poważnymi.

Gros osób docenia badania nad komórkami macierzystymi, ufając, iż pozwolą one na stworzenie nowych, efektywniejszych leków przeciwko chorobom aktualnie uznawanym za nieuleczalne. Wiara ta stanowi główny czynnik decydujący o olbrzymich nakładach finansowych na badania w tej dziedzinie. Niektórych naukowców motywuje dążenie do opracowania nowych leków, ale często mają oni bardziej szczegółowe cele, jak zrozumienie mechanizmu określonego zjawiska biologicznego. To tylko przykład, w jak odmienny sposób różne osoby mogą postrzegać badania nad komórkami macierzystymi. Kiedy zdamy sobie sprawę z tego, że biologia komórek macierzystych jest w kręgu zainteresowań bioinżynierów, polityków, inwestorów biotechnologicznych i zrozpaczonych pacjentów oraz że jest nierozerwalnie związana z aspektami etycznymi, prawnymi i religijnymi, łatwo zrozumiemy, dlaczego ten obszar nauki wzbudza tak ogromną fascynację.

Czym jest komórka macierzysta?

Komórka macierzysta to komórka, która jednocześnie może odtworzyć samą siebie i tworzyć komórki potomne o różnej funkcjonalności. Aby zrozumieć, co to znaczy, powinniśmy zacząć od rozważenia natury komórek. Komórki są podstawowymi jednostkami strukturalnymi organizmów zwierząt i roślin. Część komórek ma jądro, które zawiera materiał genetyczny (DNA), oraz cytoplazmę, zawierającą złożoną mieszaninę białek i innych rodzajów cząsteczek, które pełnią specyficzne funkcje biochemiczne lub mechaniczne. Ciało człowieka składa się z około 210 rodzajów komórek. Większość z nich to komórki zróżnicowane, z których każdy typ pełni specyficzne funkcje i cechuje się specyficznym wyglądem w obrazie mikroskopowym. Komórki wątroby (hepatocyty), mięśnia sercowego (kardiomiocyty) oraz mózgu (neurony) są znanymi typami komórek zróżnicowanych. To, do jakiego typu komórek zróżnicowanych przynależy dana komórka, jest determinowane przez aktywność specyficznych genów w jej jądrze. Geny mogą kodować białka. Repertuar aktywnych genów, a zatem i białek, warunkuje typ komórki. Termin ekspresja genów jest używany do opisania procesu syntezy białek z aktywnych genów. Kompletny DNA komórki, zawierający wszystkie jej geny, nazywany jest genomem i wszystkie jądrzaste komórki danego organizmu mają taki sam genom. Komórka niezróżnicowana to ta, która nie wykazuje widocznej specjalizacji ani w ekspresji genów, ani w wyglądzie w obrazie mikroskopowym. Ale to, że specjalizacji nie można zobaczyć, nie oznacza, że jej nie ma. Większość niezróżnicowanych komórek wykazuje pewne cechy funkcjonalne końcowo zróżnicowanych komórek, którymi się staną. Niezróżnicowane komórki znajdują się w zarodku, gdzie rozwijają się w miarę upływu czasu w różne typy komórek zróżnicowanych. Znajdują się również w niektórych guzach nowotworowych, co zwykle jest złą wiadomością z powodu ich nieograniczonej zdolności do wzrostu. Niezróżnicowane komórki są czasami, ale nie zawsze, komórkami macierzystymi.

Istnieje zgodność co do definicji komórek macierzystych podanej powyżej. Obejmuje ona tylko dwie właściwości: zdolność do samoodtwarzania i możliwość tworzenia różnicujących się komórek potomnych (ilustracja 1). Zróżnicowanymi komórkami powstającymi z komórek macierzystych są na przykład komórki skóry, krwi czy błony śluzowej jelit. Zewnętrzna warstwa skóry, naskórek, składa się z komórek zwanych keratynocytami. Wierzchnia warstwa komórek naskórka codziennie ulega złuszczaniu, a mimo to nasza skóra pozostaje tkanką funkcjonalną, ponieważ ciągle powstają nowe komórki w najniższej, podstawnej warstwie naskórka, która zawiera jego komórki macierzyste. Kiedy komórki macierzyste dzielą się, około połowa ich komórek potomnych pozostaje w warstwie podstawnej jako komórki macierzyste, a pozostałe dzielą się jeszcze kilka razy i uruchamiają program różnicowania do keratynocytów. Kiedy dojrzewają, przesuwają się przez warstwy skóry, tworząc naskórek. Zaczynają aktywować nowe geny i białka, w tym duże ilości białek fibrylarnych nazywanych keratynami. Nadają one skórze jej pożądane właściwości: elastyczność, wytrzymałość i częściową przepuszczalność. Ostatecznie komórki naskórka umierają i stają się płaskimi dyskami składającymi się w dużej mierze z keratyny. To właśnie te martwe komórki są stale złuszczane z zewnętrznej warstwy naszej skóry.

Naskórek jest przykładem tkanki odnawiającej się (ang. renewal tissue), czyli takiej, w której dzięki podziałom komórkowym komórki są odnawiane przez całe życie. Tkanki odnawiające się nie mogą istnieć bez komórek macierzystych. Najlepiej scharakteryzowanym typem komórek macierzystych są właśnie te biorące udział w odnawianiu się tkanek. Często są nazywane tkankowo-specyficznymi komórkami macierzystymi (ang. tissue-specific stem cells), aby odzwierciedlić fakt, że każdy ich typ bierze udział w tworzeniu komórek tylko tej specyficznej tkanki, a nie żadnej innej.

1. Koncepcja komórki macierzystej. Komórka macierzysta odnawia się i tworzy zróżnicowane komórki potomne. Komórki końcowo zróżnicowane powstają ze swych progenitorów, a te z kolei – z komórek przejściowo namnażających się, których źródłem jest somatyczna komórka macierzysta. Często, choć nie zawsze, komórka macierzysta wytwarza więcej niż jeden typ komórek zróżnicowanych

Tkanka odnawiająca się zawsze zawiera rodzaj mikrośrodowiska nazywany niszą (ang. niche), który sprzyja stabilności i funkcjonowaniu komórek macierzystych. Przykładowo komórki macierzyste naskórka są związane z wypustkami skóry właściwej, komórki macierzyste jelita cienkiego – z zawierającymi ziarnistości komórkami Panetha znajdującymi się przy podstawie drobnych wgłębień na powierzchni jelit (znanych jako krypty), a znajdujące się w szpiku kostnym krwiotwórcze komórki macierzyste (hematopoetyczne komórki macierzyste) – z komórkami kości oraz naczyniami krwionośnymi.

Komórki macierzyste nie są bynajmniej jedynymi dzielącymi się komórkami w organizmie. Zarodki, młode organizmy i odnawiające się tkanki dorosłych osobników zawierają wiele komórek, które dzielą się skończoną ilość razy i po kilku podziałach komórkowych stają się innym typem komórki. To komórki progenitorowe (ang. progenitor cells) lub znajdujące się w tkankach odnawiających się komórki przejściowo namnażające się (ang. transit amplifying cells).

Właściwości tkanek odnawiających się pozwoliły na sformułowanie definicji komórek macierzystych jako komórek mających zdolność do samoodnowy i tworzenia zróżnicowanego „potomstwa”. Najbardziej znaną komórką macierzystą jest zarodkowa komórka macierzysta (ang. embryonic stem cell, komórka ES). Komórki ES stanowią w pewnym sensie ikonę komórek macierzystych. To z nimi wiążą się kontrowersje etyczne i to o nich myślą laicy, odnosząc się do „badań nad komórkami macierzystymi”. Jak na ironię, komórki ES nie występują w naturze. Zostały stworzone przez ludzi i występują tylko w kulturze tkankowej (ang. tissue culture) w postaci komórek w naczyniach hodowlanych utrzymywanych w inkubatorach w kontrolowanej temperaturze, przy odpowiednim stężeniu tlenu i dwutlenku węgla oraz odżywianych pożywkami w laboratorium. Komórki hodowane w kulturze tkankowej są często określane mianem in vitro (łac. „w szkle”; jako odpowiednik szklanego naczynia stosowanego do hodowli) w odróżnieniu od in vivo (łac. „w organizmie żywym”).

Komórki ES wyczerpują podstawową definicję podaną powyżej: są to komórki niezróżnicowane, które mogą dzielić się bez ograniczeń, jak również mogą tworzyć komórki zróżnicowane funkcjonalnie – prawdopodobnie wszystkie typy komórek obecne w organizmie. Komórki ES wywodzą się z komórek znajdujących się w zarodku na wczesnych etapach jego rozwoju. Powodem, dla którego ich odpowiedniki in vivo nie są traktowane jak typowe komórki macierzyste, jest fakt, że w prawidłowym rozwoju zarodkowym komórki ES szybko różnicują do innych typów komórek. W odróżnieniu od wspomnianych komórek macierzystych warstwy podstawnej naskórka komórki ES nie pozostają takie same dłużej niż kilka dni. Jednakże w warunkach in vitro, w naczyniu hodowlanym, mogą stać się prawdziwymi komórkami macierzystymi, ponieważ mogą albo pozostać takie same przez lata, albo różnicować do wielu typów funkcjonalnych komórek. Aby uniknąć nieporozumień, należy wyraźnie odróżnić tkankowo-specyficzne somatyczne komórki macierzyste, takie jak te występujące w naskórku, od pluripotencjalnych komórek macierzystych (ang. pluripotent stem cells), które zalicza się do komórek ES, oraz indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ang. induced pluripotent stem cells, iPS), które są do nich podobne.

Termin pluripotencjalny, który będzie często używany w dalszej części publikacji, oznacza zdolność do tworzenia komórek każdego z trzech listków zarodkowych. Tkankowo-specyficzne somatyczne komórki macierzyste nie są pluripotencjalne, gdyż tworzą komórki występujące w jednej tkance. Czasami są nazywane multipotencjalnymi, gdy tkanka zawiera wiele rodzajów komórek (jak krew), lub unipotencjalnymi, gdy zawiera tylko jeden rodzaj komórek (jak komórki macierzyste jąder produkujące plemniki).

Inny termin, który często pojawia się na stronach internetowych oraz podczas dyskusji etycznych, to somatyczne komórki macierzyste (ang. adult stem cells), nazywane niekiedy dorosłymi komórkami macierzystymi. Odnosi się on do wszystkich komórek macierzystych z wyjątkiem komórek ES. Zatem zarówno tkankowo-specyficzne komórki macierzyste, jak i komórki iPS zalicza się do somatycznych komórek macierzystych, chociaż mają one zupełnie inne właściwości i tak naprawdę komórki iPS bardziej przypominają komórki ES niż komórki somatyczne. W dodatku niewłaściwie definiuje się komórki w kulturze jako somatyczne komórki macierzyste, chociaż mogą one pochodzić z różnych części organizmu: z łożyska, z pępowiny, od osobnika młodocianego, jak również od osobników dorosłych.

Czytelnicy z zacięciem filozoficznym mogli spostrzec, że przedstawiona powyżej definicja komórek macierzystych, która jest generalnie akceptowana przez naukowców biomedycznych, opiera się na zachowaniu komórek, a nie na ich właściwościach. Innymi słowy, nie potrafimy identyfikować komórek macierzystych jako określonego „czegoś”, potrafimy identyfikować je jedynie na podstawie obserwacji tego, do czego są one zdolne. To podejście ma aspekty praktyczne, a nie tylko teoretyczne. Wielu naukowców próbowało i nadal próbuje zidentyfikować geny, których ekspresja jest charakterystyczna dla wszystkich rodzajów komórek macierzystych, ale do tej pory te wysiłki okazały się bezowocne, jeśli nie liczyć oczywistości, jak geny, których aktywność jest niezbędna do przeżycia komórki czy podziału komórkowego. W szczególności geny odpowiadające za pluripotencjał komórek ES nie są aktywne w tkankowo-specyficznych somatycznych komórkach macierzystych. Z tego względu jesteśmy zmuszeni definiować komórkę macierzystą na podstawie jej zachowania, a najlepiej poznanym rodzajem komórek macierzystych są komórki ES, które są raczej artefaktem stworzonym przez człowieka niż częścią natury.

Kultura tkankowa

Jak zaznaczono powyżej, technologia hodowli tkankowej, zwanej również hodowlą komórkową, ma kluczowe znaczenie dla biologii komórek macierzystych. Hodowlę tkankową rozumie się jako wzrost komórek poza organizmem, w probówkach, naczyniach lub butelkach, w pożywkach hodowlanych.

Pierwsze prymitywne metody utrzymywania przy życiu zwierzęcych komórek in vitro zostały wprowadzone przez embriologów pod koniec XIX w. i szczegółowo opracowane na początku XX w. przez Alexisa Carrela, francuskiego naukowca pracującego w Instytucie Badań Medycznych Rockefellera w Nowym Jorku (obecny Uniwersytet Rockefellera). Szerokie zastosowanie hodowli tkankowej notuje się jednak dopiero od 1950 r., kiedy pożywki hodowlane stały się dostępne komercyjnie, a wprowadzenie nowych antybiotyków pozwoliło na zmniejszenie groźby zakażenia hodowli przez mikroorganizmy.

Większość komórek organizmu nie ulega podziałom komórkowym oraz występuje w tkankach – populacjach złożonych zwykle z różnych typów komórek, w bliskiej odległości od siebie oraz w pobliżu naczyń krwionośnych i nerwów. Kiedy mały skrawek tkanki umieszcza się w środowisku hodowli tkankowej, niektóre komórki migrują ze skrawków i podejmują podziały komórkowe, choć wiele innych tego nie robi, dlatego hodowla tkankowa jest procesem samoistnie selektywnym. Komórki hodowli tkankowej rosną zwykle przy powierzchni naczynia hodowlanego, a zwiększenie ich liczby prowadzi do utworzenia pojedynczej warstwy komórek (ang. monolayer). Po zapełnieniu całego naczynia hodowlanego komórki przestają rosnąć. Aby utrzymać wzrost hodowli, należy komórki poddać działaniu trypsyny – enzymu, który niszczy połączenia pomiędzy komórkami a naczyniem hodowlanym i pozwala im swobodnie przemieszczać się w pożywce. W postaci zawiesiny komórki mogą być rozcieńczone w świeżej pożywce, tworząc subkultury, a następnie umieszczone w naczyniach, do których powierzchni będą mogły się przytwierdzić i znów dokonywać podziałów. Każda taka subkultura nazywana jest pasażem. Wszystkie manipulacje na komórkach muszą być wykonywane w specjalnych komorach laminarnych mających system przepływu sterylnego powietrza, aby bakterie i zarodniki grzybów nie przedostały się do wnętrza naczynia hodowlanego. Ponieważ pożywka hodowlana zawiera dużą ilość składników odżywczych, mikroorganizmy chętnie się w niej rozwijają i bardzo łatwo wypierają komórki zwierzęce. Naczynia hodowlane są zwykle przechowywane w inkubatorach w temperaturze 37°C (temperatura ciała ssaków) oraz przy 5-procentowym stężeniu dwutlenku węgla (poziom zbliżony do normalnego środowiska tkankowego).

2. Komórki jajnika chomika chińskiego rosnące w hodowli tkankowej. Każdy ciemny kształt to jedna komórka

Komórki hodowli tkankowej mogą być przechowywane w stanie zamrożonym w ciekłym azocie (–196°C). Staranne zamrażanie i rozmrażanie pozwala na przechowywanie kultur komórkowych w tej temperaturze przez dowolnie długi czas, a później na reaktywację wzrostu komórek.

Niektóre rodzaje komórek mogą wzrastać w hodowli tkankowej, a inne nie. Większość wyodrębnionych fragmentów tkanki (eksplantów) umieszczonych w kulturze pozwoli na wzrost fibroblastów, komórek mających nieregularny kształt podobny do gwiazdy. Przypominają one komórki zwykle występujące w skórze (w jej dolnej warstwie), ale geneza hodowli tkankowej fibroblastów jest bardzo słabo poznana i nie wiadomo, ile różnych typów komórek reprezentują fibroblasty rosnące w kulturze. Komórki nabłonkowe, takie jak keratynocyty naskórka, to druga główna morfologiczna klasa komórek rosnących w kulturze. Tworzą one warstwy dzięki połączeniom pomiędzy komórkami i zwykle wydzielają zewnątrzkomórkową warstwę – błonę podstawną – znajdującą się poniżej warstwy komórek. Górna i dolna powierzchnia warstwy nabłonka jest różna, co określa się mianem polaryzacji komórki, a wszystkie komórki znajdujące się w jednej warstwie są zorientowane w ten sam sposób. Większość tkanek zawiera nabłonek, na przykład naskórek w skórze, wyściółka w jelitach, w układzie rozrodczym i oddechowym, wątroba i wszystkie gruczoły.

Hodowle tkankowe znajdują zastosowanie w wielu badaniach naukowych, jak również w przemyśle – do produkcji szczepionek, hormonów czy czynników wzrostu, które potem są stosowane w medycynie. Utrzymanie hodowli tkankowych stwarza szereg problemów, z których co najmniej dwa mają zasadnicze znaczenie w badaniach komórek macierzystych. Po pierwsze, środowisko kultury tkankowej promuje szybki wzrost komórek, co sprzyja selekcji. Jeśli w jednej komórce wystąpi mutacja, może dać jej to niewielką przewagę w szybkości wzrostu w stosunku do wszystkich innych komórek, dlatego „potomstwo” tej komórki szybko może stać się liczniejsze niż komórki tworzące resztę kultury i po niedługim czasie stanowić praktycznie całą populację komórek kultury. Oznacza to, że cała hodowla tkankowa jest doświadczeniem przyspieszonej ewolucji i jest nieuniknione, że po pewnej liczbie pasaży komórki „na wyjściu” będą inne niż komórki „na wejściu”. Po drugie, nawet bez mutacji i selekcji komórki mogą zmienić swoje właściwości w kulturze tkankowej. Komórki odpowiadają na bodźce z otoczenia: składniki odżywcze, czynniki wzrostu, hormony i fizyczne składniki podłoża, które są obecne w kulturze tkankowej, a które mogą wpływać na zmianę ekspresji genów, co oznacza, że komórki w kulturze mogą nabywać wyraźnie inne cechy niż te, które występują w warunkach in vivo. Jak wspomniano, komórki ES nie są zbytnio podobne do jakiegokolwiek typu prawidłowych komórek zarodka czy komórek pluripotencjalnych izolowanych z dorosłych organizmów, dlatego powszechnie uważa się, że są one artefaktami kultury tkankowej.

Kwestia artefaktów hodowli tkankowych jest podnoszona w tej książce po raz pierwszy, ale bynajmniej nie ostatni. Ich szczególnie istotnym aspektem są różnice w percepcji i perspektywie, jakich doświadczają przedstawiciele różnych nauk. Biolog chcący zrozumieć naturę szuka odpowiedzi na pytanie, czy populacja komórek w hodowli zmieni się, jeśli komórki znajdowały się wcześniej w organizmie, czy raczej komórki te są teraz artefaktami, a jeśli istotnie nimi są, to są one mniej interesujące niż ich odpowiedniki w organizmie. Ale bioinżynier, który chce stworzyć praktyczny produkt, jest zainteresowany użytecznością kultur tkankowych. Innymi słowy, inżyniera zajmuje to, co można zrobić z komórkami, a ich klasyfikacja w świecie przyrody ma dla niego drugorzędne znaczenie. Zwykli ludzie są bardziej skłonni podzielać światopogląd inżyniera niż biologa. Ale większość badań nad komórkami macierzystymi została przeprowadzona przez naukowców, a zatem ich perspektywa wydaje się dominować i może czasem wskazywać priorytety, które wydają się naganne ogółowi społeczeństwa.

Terapia komórkowa

Powodem, dla którego badania nad komórkami macierzystymi są postrzegane jako potencjalne źródło nowych sposobów leczenia, jest technologia terapii komórkowej. Polega ona na wprowadzaniu komórek do odpowiedniej części organizmu, na przykład komórek mięśnia sercowego do niewydolnego serca lub neuronów do części mózgu po udarze. Jeśli stare, uszkodzone lub umierające komórki mogą być zastąpione przez komórki młode, rozwijające się i funkcjonalne, wtedy uszkodzenie narządu można naprawić, a biorcę wyleczyć i przedłużyć mu życie. Komórki macierzyste postrzega się jako klucz do terapii komórkowej, ponieważ są one źródłem nowych komórek do transplantacji. Tkankowo-specyficzne komórki macierzyste to te, które zwykle mogą różnicować się do wielu typów komórek, a komórki ES w odpowiednich warunkach mogą prawdopodobnie tworzyć wszystkie typy komórek.

Wszystko to brzmi bardzo atrakcyjnie, na stronach internetowych wielu firm i klinik oferujących „terapię komórkową” przedstawia się takie leczenie jako proste rozwiązanie problemów zdrowotnych. W rzeczywistości jednak z terapią komórkową wiąże się sporo problemów. Wiele rodzajów komórek ważnych dla organizmu nie wzrasta w dorosłym życiu osobnika. Po wykształceniu się w rozwoju zarodkowym nie wzrastają, ale zazwyczaj utrzymują się przez dłuższy czas, nawet do końca życia, produkując niewielką liczbę komórek potomnych. Jednak aby wytworzyć je w liczbie wystarczającej do przeszczepu, potrzeba źródła komórek, które mogą rosnąć. Innymi słowy, kilka komórek musi posiadać zdolność namnażania się w hodowli tkankowej, aby stworzyć dużą populację komórek niezbędną do przeszczepu. Większość rodzajów komórek potrzebnych do terapii komórkowej nie dzieli się w hodowli tkankowej albo dzieli się, szybko tracąc użyteczne właściwości. Dotyczy to na przykład komórek wątroby (hepatocytów) i komórek trzustki produkujących insulinę (komórek beta). Dlatego prace z hodowlami tkankowymi ukierunkowane na zwiększenie liczebności populacji komórek do przeszczepu mają ograniczony charakter, a terapia komórkowa w większości przypadków dotyczy przeszczepu komórek bezpośrednio od jednej osoby do drugiej. Jednym z powodów, dla których przeszczep szpiku kostnego jest obecnie najważniejszą formą terapii komórkami macierzystymi, jest to, że szpik kostny (i zawarte w nim hematopoetyczne komórki macierzyste) można pobrać w dostatecznej ilości. W innych rodzajach terapii komórkowej, takich jak przeszczepy wysp trzustkowych lub hepatocytów, dawcami są osoby zmarłe, co znacznie ogranicza liczbę komórek oraz użyteczność tych metod.

Kolejnym poważnym problemem terapii komórkowej jest reakcja odpornościowa. Ludzie, oraz wszystkie pozostałe kręgowce, mają bardzo złożony układ immunologiczny, który ewoluował, aby zwalczać infekcje: inwazyjne mikroorganizmy są rozpoznawane jako obce i niszczone. System ten powoduje również odrzucenie przeszczepów komórek lub tkanek. Przeszczepione komórki są uznawane za „nie swoje” przez populację białych krwinek, limfocytów T. Niszczą one obce komórki przez poddanie ich działaniu substancji toksycznych nazywanych cytokinami. Wśród nich są interferony, ważne w odpowiedzi na zakażenie wirusem i na czynniki martwicy nowotworu, które są czasami wydzielane przez komórki nowotworowe i mogą wywoływać ogólnoustrojowe efekty toksyczne. Limfocyty T rozpoznają prawie wszystkie nowe cząsteczki, których dotychczas nie napotykały w organizmie, ale główna odpowiedź immunologiczna jest skierowana przeciwko rodzinie komórkowych cząsteczek powierzchniowych zwanych antygenami HLA (antygenami leukocytów człowieka, ang. human leukocyte antigen). Są to glikoproteiny, cząsteczki składające się częściowo z białek kodowanych przez geny HLA i częściowo z węglowodanów. Geny HLA wykazują ogromną zmienność osobniczą.

W tym momencie warto wspomnieć, że specjaliści z dziedziny biomedycyny mówiąc o „genie”, zwykle myślą o prawidłowej wersji genu, która koduje specyficzne białko pełniące specyficzną funkcję. Ale biolodzy ewolucyjni lub psycholodzy, kiedy mówią o „genie”, zwykle mają na myśli taki jego wariant, który na przykład może warunkować różnice w wyglądzie, osobowości lub zachowaniu. Biolodzy nazywają te warianty genów posiadanych przez różne osoby allelami. Układ HLA obejmuje dwie rodziny genów: ABC oraz DR, z których każdy może być dowolnym wariantem allelu. Całkowita liczba możliwych kombinacji tych alleli jest bardzo duża, dlatego przeszczep tkanki od jednej osoby do drugiej (przeszczep allogeniczny) zazwyczaj wywołuje reakcję odrzucenia przez limfocyty T biorcy. W praktyce klinicznej reakcje te są kontrolowane przez leki hamujące działanie układu odpornościowego (leki immunosupresyjne). Jednak jeśli niedopasowanie pomiędzy allelami HLA przeszczepu i biorcy jest duże, reakcje immunologiczne przybierają na sile. Dlatego określanie stopnia dopasowania alleli HLA stanowi podstawę typowania tkanek, co jest bardzo ważne dla transplantacji narządów i aktualnie stosowanych rodzajów terapii komórkowej.

Od 1950 r. wiadomo, że przeszczepy tkanek są tolerowane, jeżeli przeprowadza się je pomiędzy bliźniętami jednojajowymi. Dzieje się tak, ponieważ bliźnięta jednojajowe powstają na skutek spontanicznego podziału zarodka na dwie części we wczesnym etapie jego rozwoju. W efekcie mają one dokładnie takie same allele dla wszystkich genów HLA oraz innych genów związanych z odrzuceniem przeszczepu. To samo dotyczy wszelkich przeszczepów pobranych od pacjenta i wszczepionych temu samemu pacjentowi w innym miejscu (przeszczep autologiczny).

Stosowanie leków immunosupresyjnych w celu kontroli odrzucenia przeszczepu jest procedurą obciążającą pacjenta. Leki te często mają skutki uboczne, powodując różnego rodzaju uszkodzenia narządów, a ponieważ hamują reakcję immunologiczną przeciwko mikroorganizmom, pacjenci z przeszczepem cechują się obniżoną odpornością i są podatni na infekcje, które zazwyczaj mają ostrzejszy przebieg niż u osób z w pełni funkcjonalnym systemem odpornościowym. Możliwość produkcji komórek, tkanek lub narządów do przeszczepów, które nie wymagają immunosupresji, jest świętym graalem badań nad komórkami macierzystymi i dlatego kwestia spersonalizowanej hodowli komórkowej, omówiona w rozdziale 3, jest tak ważna.

Trzecim poważnym problemem terapii komórkowej jest sposób dostarczenia komórek w uszkodzone miejsce. Przeważnie są one wstrzykiwane w postaci zawiesiny. W przypadku transplantacji szpiku kostnego wstrzyknięcie może być wykonane do krwiobiegu, ponieważ macierzyste komórki krwiotwórcze, które są głównym składnikiem przeszczepu, mogą przemieszczać się przez krew do nisz w szpiku kostnym biorcy i tam się osiedlać. Organy lite sprawiają więcej kłopotów. W eksperymentalnej terapii serca lub rdzenia kręgowego przeważnie wstrzykuje się zawiesinę komórek w uszkodzone miejsce. Ale z badań na zwierzętach jasno wynika, że większość komórek obumiera zaraz po iniekcji, a otrzymanie zintegrowanego, uporządkowanego i funkcjonalnego trójwymiarowego układu komórek po przeszczepieniu jest aktualnie nieosiągalne.

Zatem obecnie terapia komórkowa napotyka kilka poważnych problemów; są to przede wszystkim trudności w otrzymaniu wymaganej do przeszczepu liczby komórek, reakcja immunologiczna i możliwość odrzucenia przeszczepu oraz kłopoty z efektywnym dostarczeniem komórek do miejsca docelowego. Pomimo że wszystkie te problemy są poważne, nie są jednak nierozwiązalne. Zastosowanie komórek macierzystych może pomóc w uporaniu się z dwoma pierwszymi trudnościami. Bariera małej liczby komórek może zostać pokonana przez zastosowanie komórek pluripotencjalnych (zarodkowych lub indukowanych), które są zdolne do nieograniczonego wzrostu w hodowli komórkowej oraz do różnicowania w niemal każdy rodzaj komórek obecny w organizmie. Problem reakcji immunologicznej i odrzutu przeszczepu może zostać rozwiązany przez tworzenie banków komórek, aby zapewnić zgodność HLA każdemu pacjentowi, lub też przez zastosowanie metod do produkcji spersonalizowanych komórek iPS. Są to komórki wyprowadzone z komórek pacjenta, które wykazują całkowitą zgodność immunologiczną i dlatego nie powodują odrzucania przeszczepu. Trzeci problem, dotyczący efektywnego dostarczenia komórek do miejsca docelowego, leży mniej po stronie badań nad komórkami macierzystymi, a bardziej w obszarze bioinżynierii. Kluczem jest otrzymanie przestrzennej hodowli tkankowej, w której komórki rosłyby, tworząc określony trójwymiarowy kształt lub specyficzną konfigurację tkanek, a następnie mogłyby zostać przeszczepione konwencjonalnie jako zintegrowana całość zamiast pojedynczych komórek.

Niepewna efektywność aspiracyjnej terapii komórkami macierzystymi

Oprócz przykładów współcześnie stosowanych terapii z wykorzystaniem komórek macierzystych, które są omówione w tej książce, możemy zetknąć się z wieloma innymi propozycjami „terapii z wykorzystaniem komórek macierzystych”, które jednak nie mają wyraźnych podstaw naukowych. Zazwyczaj polegają one na autologicznym przeszczepie komórek z jednej części ciała do drugiej lub czasem na allogenicznym przeszczepie linii komórkowej do uszkodzonego miejsca. Tego typu procedury rzadko stanowią część kontrolowanych badań klinicznych. Na potrzeby tej książki taki rodzaj aktywności będzie nazywany aspiracyjną terapią komórkami macierzystymi, chociaż to zjawisko jest również znane jako „turystyka komórek macierzystych” (ramka 2).

Ramka 2. Turystyka komórek macierzystych

Żyjemy w świecie, gdzie pieniądze można łatwo zarobić tylko poprzez przyciąganie uwagi lub składanie obietnic. Naturalnie, każda obietnica nowych leków przeciwko postępującym i wyniszczającym chorobom na pewno zwróci na siebie uwagę – częściowo z powodu niezrozumienia nauki, częściowo ze względu na zupełnie inną perspektywę lekarzy i naukowców, częściowo ze względu na debaty etyczne, a częściowo ze względu na chęć zarabiania pieniędzy. O obietnicy „terapii komórkami macierzystymi” mówiło się głośno i często, dlatego przyciągnęła ona więcej uwagi, niż na to naprawdę zasługuje. Zachęciło to wiele tysięcy osób z ciężkimi, bolesnymi i wyniszczającymi, często terminalnymi chorobami, by starać się o cudowne lekarstwo – komórki macierzyste. Tacy ludzie są gotowi do podróży po całym świecie i do płacenia dużych pieniędzy klinikom, które oferują tego typu kuracje. Dlaczego mieliby tego nie robić? Przecież to dosłownie kwestia życia i śmierci, a odrobina nadziei, jaką daje nowe, eksperymentalne leczenie, zawsze warta jest ryzyka, zwłaszcza gdy w perspektywie ma się nieuniknione wyniszczenie lub śmierć. Niestety, większość tego, co obecnie oferują takie kliniki, jest prawie zawsze nieskuteczna.

Dramat turystyki komórek macierzystych wynika ze stronniczości znanej wszystkim statystykom medycznym. W większości jednostek chorobowych jest wiele różnic osobniczych w tempie progresji choroby, dlatego trudno przewidzieć, co stanie się z danym pacjentem w ciągu najbliższych dwóch lub trzech lat. Wyobraźmy sobie nieuleczalną zwyrodnieniową chorobę mózgu, w której nieprzewidywalnie pojawiają się okresy remisji, a także okresy, w których pacjenci czują się lepiej, nawet jeśli faktyczne funkcjonowanie neuronów się nie poprawiło. Załóżmy, że 100 takich pacjentów zapisało się na cudowną terapię komórkami macierzystymi do doktora Dobresamopoczucie. Niektórzy z tych pacjentów doświadczą okresu remisji wkrótce po rozpoczęciu leczenia wyłącznie przez przypadek, ale wyrażają oni swoją pozytywną opinię na temat terapii. Pacjenci, podejmując ryzyko nowej terapii, rekompensują znaczne wydatki świadomością, że się im to opłaciło. Osoby te łatwo przekonać, aby napisały referencje wychwalające doktora Dobresamopoczucie i jego lekarstwo, listy te zamieszczane na stronie internetowej kliniki przyciągają jeszcze większą liczbę klientów. Stan wielu spośród tych 100 pacjentów nie poprawił się, a nawet pogorszył, również przez przypadek, wkrótce po zabiegu. Osoby te nie piszą rekomendacji, a jeśli złożą reklamację, to zostanie im grzecznie przypomniane, że umowa zawiera zapisaną drobnym drukiem informację, że leczenie było eksperymentalne i wyzdrowienie nie było gwarantowane. W każdym razie reklamacje te nie są publikowane na stronie internetowej kliniki. Świadome wykorzystanie przez kliniki naturalnej zmienności przebiegu choroby i selektywności w raportowaniu wyników, bardzo łatwo tworzy szereg dowodów na skuteczność terapii, która jest całkowicie nieefektywna.

Doktor Dobresamopoczucie przypuszczalnie nie ma odpowiednich kontaktów lub środków finansowych umożliwiających udział w kontrolowanym badaniu klinicznym, więc nawet gdyby chciał ustalić efektywność leczenia za pomocą statystycznie akceptowalnych metod, nie byłby w stanie tego zrobić. Jest o wiele bardziej prawdopodobne, że wierzy własnym oczom, szczególnie wdzięcznym pacjentom, których stan poprawia się wkrótce po terapii. Zjawisko to jest znane w handlu jako dowód anegdotyczny i do czasu wynalezienia randomizowanych, kontrolowanych badań klinicznych w 1940 r. wszystkie oceny efektywności terapii w medycynie opierały się na takich zawodnych metodach.

Ustalenie skuteczności nowej terapii bez kontrolowanych badań klinicznych jest mało prawdopodobne. Badania kliniczne to bardzo złożony proces, ale w istocie mają na celu uniknięcie błędów poprzez porównanie jednej metody leczenia z inną, gdy obie są prowadzone w ten sam sposób na całej grupie pacjentów. Łatwość dokonywania porównań jest odwrotnie proporcjonalna do zmienności choroby. Im choroba bardziej zmienna, tym grupa badana powinna być większa, aby móc wykryć różnicę w skuteczności terapii. Ponieważ wyniki często są nieco subiektywne, ważne jest, jeśli to możliwe, aby pacjent nie wiedział, czy jest on członkiem grupy badanej, która otrzymuje nowe leczenie, czy grupy kontrolnej, która go nie otrzymuje. Zaleca się, aby personel medyczny zajmujący się pacjentami i zapisujący wyniki również nie wiedział, kto przynależy do danej grupy. Istnieje wiele innych złożonych problemów dotyczących badań klinicznych, ale spełnienie warunku wystarczająco dużej próby, aby wykryć różnice, oraz warunku ukrywania tożsamości grup badanych i kontrolnych, wiąże się z tym, że badania kliniczne mogą być wykonywane tylko przez duże akademickie ośrodki medyczne, a często przez kilka współpracujących ze sobą ośrodków.

Większość aspiracyjnych terapii komórkami macierzystymi jest prowadzona przez lekarzy lub prywatne kliniki, które nie są w stanie wykonać badań klinicznych. Ponieważ pacjenci ciągle proszą o opinię na temat danego sposobu leczenia, sprawa jest bardzo irytująca dla naukowców zajmujących się komórkami macierzystymi. W 2008 r. Międzynarodowe Towarzystwo Badań nad Komórkami Macierzystymi (International Society for Stem Cell Research, ISSCR) skłaniało się ku stwierdzeniu, że żadna nowa metoda leczenia komórkami macierzystymi nie powinna być testowana na pacjentach, chyba że jest ona częścią badania kontrolowanego. Ostatecznie jednak ISSCR nie przyjęło tego bardzo radykalnego stanowiska i oświadczyło, że nowe metody leczenia muszą mieć „racjonalne uzasadnienie i określony cel”. Może się to wydawać oczywiste, ale po raz kolejny uwidacznia się różnica pomiędzy oceną tych samych danych przez różnych specjalistów, z których każdy skupia się na własnej branży. Argumenty przemawiające do naukowca bardzo często różnią się od tych przemawiających do lekarza praktyka. Na przykład, jeżeli dosercowe wstrzyknięcie pacjentom komórek ich własnego szpiku kostnego powoduje poprawę funkcjonalności o 2%, ale zakłada się, że wszystkie te komórki obumierają w ciągu pierwszego dnia, czy stanowi to uzasadnienie dla podjęcia dalszych badań? Naukowiec powie: „Tego, co obserwujemy, nie potrafimy wytłumaczyć. Należy przeprowadzić dalsze badania laboratoryjne, aby dowiedzieć się więcej, zanim zaproponujemy następną terapię”. Natomiast klinicysta będzie skłonny powiedzieć: „Tak, 2% to nie jest dużo, ale lepsze to niż nic, a muszę zaoferować moim pacjentom to, co najlepsze. I tak naprawdę nie obchodzi mnie, jaki mechanizm za tym stoi, dopóki ta metoda przynosi pożytek pacjentom”. Ten przykład daje zaledwie wyobrażenie o ogromnych różnicach w postrzeganiu terapii komórkami macierzystymi.